一种原位荧光标记地杆菌的方法与流程

本发明涉及一种原位荧光标记地杆菌的方法，属于微生物技术领域。

背景技术：

地杆菌(geobacter)是自然环境中数量最多、分布最广的电活性细菌，也是研究最为广泛、电子转移活性最强的电活性模式菌株，广泛分布于淡水沉积物、有机物及重金属污染的地下水沉积层等厌氧环境，具有铁还原、腐殖质还原与产电三大功能。由地杆菌形成的电活性生物膜在环境修复及生物工程方面有重要的应用价值，可实现处理污染物的同时产出电能或其他化学制品，有助于污染修复技术向低投入、低能耗、低污染的方向转型。利用原位荧光蛋白标记技术，实时的探究地杆菌生物膜形成的动态过程及细菌间的群体行为，对促进地杆菌电活性生物膜的形成、提高其环境及经济效益具有重要的意义。

目前，原位荧光蛋白标记的方法在研究基因的调控及蛋白的合成、折叠、定位、运动和相互作用等方面已经得到广泛的应用。其中，一种来自维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白(gfp)应用最广泛。然而，其发色光团的合成需要氧分子作为必须的辅因子，因此无法在厌氧菌地杆菌中应用。此外gfp的半衰期较短，这也使其在长期原位观察生物膜的形成过程中受到限制。因此，寻找一种能够在厌氧条件下发光且半衰期较长的荧光探针及其标记方法是解决当前地杆菌无法进行原位荧光标记的有效策略。

技术实现要素：

本发明提供了一种原位荧光标记地杆菌的方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种原位荧光标记地杆菌的方法，将ppfbfp荧光蛋白基因转入地杆菌。

作为进一步改进的，所述ppfbfp荧光蛋白基因的核苷酸序列如seqidno：01所示。

作为进一步改进的，所述地杆菌为geobactersulfurreducens菌。

作为进一步改进的，包括以下步骤：

s1，采用质粒puc19构建含有ppfbfp荧光蛋白基因的质粒puc-ppfbfp；

s2，将步骤s1构建的质粒puc-ppfbfp转入geobactersulfurreducens菌。

作为进一步改进的，所述质粒puc-ppfbfp在构建时插入ompj的强启动子。

作为进一步改进的，所述质粒puc-ppfbfp在构建时还插入庆大霉素抗性基因。

作为进一步改进的，所述ppfbfp荧光蛋白基因插入质粒puc19的位点gsu0808与gsu0807之间。

作为进一步改进的，步骤s2具体为：

a，使用限制性内切酶scai单酶切质粒puc-ppfbfp使其线性化，并将线性化质粒进行浓缩；

b，在厌氧条件下，将培养至对数期的geobactersulfurreducenspca4℃预冷后，离心并收集菌体，并用4℃预冷的电转buffer洗涤菌体两次，制备geobactersulfurreducenspca感受态；

c，取浓缩后的线性化质粒puc-ppfbfp加入到geobactersulfurreducenspca感受态细胞悬浮液中，混匀后移入预冷的电击杯底部，进行瞬时电击，促进质粒转入感受态细胞中；

d，用nbaf培养基悬浮转化后的geobactersulfurreducenspca电感受态细胞进行培养，取不同浓度的菌液涂布含有庆大霉素的nbaf琼脂平板，并将其置于厌氧培养箱中培养，挑取平板上的单菌落接种到nbaf培养基中，待菌株增殖生长后进行pcr扩增验证。

作为进一步改进的，所述瞬时电击的参数为1.47kv/cm，时间为5ms。

作为进一步改进的，所述庆大霉素含量为10-30μg/ml。

本发明还提供一种质粒puc-ppfbfp的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取geobactersulfurreducenspca基因组dna，并以geobactersulfurreducenspca基因组dna为模板，以引物对gsu0808f/gsu0808r、pompjf/pompjr、gsu0807f/gsu0807r，利用pcr扩增技术分别扩增gsu0808、pompj及gsu0807的核苷酸序列；采用质粒pcm351、引物对gentfor/gentrev，利用pcr技术扩增庆大霉素抗性基因gent；

(2)将扩增的gsu0808、pompj、gsu0807核苷酸序列及基因gent进行纯化；

(3)将纯化的gsu0808、pompj、gsu0807核苷酸序列及基因gent与线性化的puc19质粒载体进行infusion构建质粒puc-ppfbfp；

(4)将重组质粒puc-ppfbfp转入e.colidh5α感受态细胞进行培养，挑取单菌落并进行测序验证。

本发明还提供一种上述的方法构建的质粒puc-ppfbfp。

本发明的有益效果是：

本发明的ppfbfp荧光蛋白标记不受氧气的影响，可以在厌氧条件下使得被标记的地杆菌发荧光，且半衰期长(>40h)，能够实现长期实时观察严格厌氧微生物地杆菌的运动轨迹、成膜过程及群体行为。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例的质粒puc-ppfbfp基因排布图。

图2是本发明实施例的geobactersulfurreducensppfbfp荧光检测图。

图3是本发明的实施例的ppfbfp荧光蛋白标记的geobactersulfurreducensppfbfp的pcr鉴定图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例

本实施例中所涉及的菌株：(1)escherichiacoli菌株dh5α化学感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)用于基因克隆与质粒扩增。(2)geobactersulfurreducenspca(购自美国典型培养物保藏中心，菌株编号atcc-51573)被用于构建荧光蛋白标记菌株。

本实施例中培养菌株所涉及的nbaf培养基配方如下：

*每升100xnb盐溶液中含42gkh2po4，22gk2hpo4，20gnh4cl，38gkcl，36gnacl。

**每升nb矿物质溶液中含2.14gnta；0.1gmncl2*4h2o；0.3gfeso4*7h2o；0.17gcocl2*6h2o；0.2gznso4*7h2o；0.03gcucl2*2h2o；0.005galk(so4)2*12h2o；0.005gh3bo3；0.09gna2mno4*2h2o；0.11gniso4*6h2o；0.02gna2wo4*2h2o。

***每升dl维生素溶液中含0.002g生物素；0.005g维生素b5；0.0001g维生素b12；0.005g对氨基苯甲酸；0.005ga-硫辛酸；0.005g烟酸；0.005g维生素b1；0.005g核黄素；0.01g维生素b6；0.002g叶酸。

lb培养基配方如下：5g酵母提取物；10gnacl；10g胰蛋白胨。

固体lb及nbaf平板含有1.5％的琼脂。抗生素筛选平板中庆大霉素含量为20μg/ml。

本实施例中所涉及的质粒：(1)线性质粒puc19(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)为pcr产物的克隆载体，并且直接作为同源重组载体用于构建ppfbfp荧光蛋白标记的突变株。质粒puc-ppfbfp起源于质粒puc19，含有庆大霉素抗性基因并携带ppfbfp编码基因序列。

本实施例中基因操作及质粒的构建：

1.puc-ppfbfp质粒的构建

(1)用nbaf培养基培养geobactersulfurreducenspca。使用dna试剂盒(purelink^tmgenomicdnaminikit,美国thermofisherscientific公司,no.k182001)提取geobactersulfurreducenspca基因组dna，并以geobactersulfurreducenspca基因组dna为模板，以引物对gsu0808f/gsu0808r、pompjf/pompjr、gsu0807f/gsu0807r，利用pcr扩增技术分别扩增gsu0808、pompj及gsu0807基因序列。pcr反应体系为：1μl的dna模板、10μm的上下引物各1μl、25μl的primestarmaxdnapolymerase(日本takara公司,codeno.r045a)及22μl的ddh2o。pcr反应程序为：95℃30s，然后30个循环(95℃15s,55℃30s,68℃1min),72℃10min。庆大霉素抗性基因gent使用引物对gentfor/gentrev扩增自质粒pcm351(购自美国addgene质粒保藏中心，目录号：46013)。ppfbfp荧光蛋白编码基因(ppfbfp)序列直接通过dna合成技术获得。ppfbfp的核苷酸序列如下：

atgataaatgcaaaacttcttcagcttatggtagaacattcaaatgatggtatagtagtagcagaacaggaaggtaatgaatcaatacttatatatgtaaatcctgcatttgaaagacttacaggttattgtgcagatgatatactttatcaggatgcaagatttcttcagggtgaagatcatgatcagcctggtatagcaataataagagaagcaataagagaaggtagaccttgttgtcaggtacttagaaattatagaaaagatggttcacttttttggaatgaactttcaataacacctgtacataatgaagcagatcagcttacatattatataggtatacagagagatgtaacagcacaggtatttgcagaagaaagagtaagagaacttgaagcagaagtagcagaacttagaagacagcagggtcaggcaaaacattaaccatggggatccgtcgaccccggggaattctaataaaaataactctgtagaattataaattagttctacagagttatttttggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatg(seqidno：01)。

gsu0808与gsu0807为ppfbfp基因的插入位点，研究表明该位点插入基因片段后不会对geobactersulfurreducenspca的生长及产电产生影响。

其引物序列如下：

gsu0808f：

cggtacccggggatcgtggtggacccccttaccggt(seqidno：02)。

gsu0808r：

cggccgttactagtgtgtgaccgctgccggctccggtca(seqidno：03)。

gsu0807f：

ctcatgagacaataaccctgataaatgagggcagacattgcggaacgtgcca(seqidno：04)。

gsu0807r：cgactctagaggatcgggttccgctgccgtcgtac(seqidno：05)。

pompjf的核苷酸序列如下：

atcacactggcggccgccgctggaaggtctgtcgatgca(seqidno：06)。

pompjr的核苷酸序列如下：

cttggcgttgatcatcgttgcctccttcattggtgataaaacagc(seqidno：07)。

gentfor的核苷酸序列如下：cactagtaacggccgccag(seqidno：08)。

gentrev的核苷酸序列如下：ggccgccagtgtgatggat(seqidno：09)。

将gsu0808、pompj、gsu0807及gent的基因用pcr产物纯化试剂盒(日本takara公司，minibest)进行纯化。

(2)将(1)纯化后的pcr产物与线性化puc19质粒载体及5×in-fusionhdenzymepremix(日本takara公司，codeno.638909)置于pcr仪中50℃15min，构建质粒puc-ppfbfp；

(3)将重组质粒puc-ppfbfp转入e.colidh5α感受态细胞(生长在lb平板上)，挑取单菌落并通过sanger测序验证(上海生工生物工程股份有限公司)，得到质粒puc-ppfbfp。质粒puc-ppfbfp基因排布如图1所示。

2.构建ppfbfp荧光蛋白标记的geobactersulfurreducensppfbfp菌

(1)使用限制性内切酶scai单酶切质粒puc-ppfbfp使其线性化，总量不低于10μg，并将线性化质粒进行浓缩。浓缩步骤如下：1)取100μl上述质粒于1.5ml离心管中，加入10μl3m乙酸钠溶液(ph＝5.2)混匀；2)加入250μl冰乙醇(4℃预冷)，混匀后-20℃静置(>20min)后4℃，>12000g离心30min；3)弃上清，加入1ml70％冰乙醇(4℃预冷)，4℃，>12000g离心30min；4)弃上清，加入500μl冰乙醇(4℃预冷)，4℃，>12000g离心30min；5)弃上清，待乙醇挥发尽后加入10μl无菌水，将质粒重新溶解并测定浓度。

(2)制备geobactersulfurreducenspca感受态。将在nbaf培养基中培养至对数期的geobactersulfurreducenspca4℃预冷后(4500×g12min)离心并收集菌体，并用4℃预冷的电转buffer洗涤菌体两次(4500×g12min)，以上操作均在厌氧条件下进行。

(3)取1μl浓缩后的线性化质粒puc-ppfbfp加入到1μlgeobactersulfurreducenspca感受态细胞悬浮液中，轻轻混匀后移入预冷的电击杯底部。将电击杯进行瞬时电击，促进质粒转入感受态细胞中(1.47kv/cm,5ms。bio-radmicropulser)。

(4)取0.2ml还原好的nbaf培养基悬浮转化后的geobactersulfurreducenspca电感受态细胞，并将其移入nbaf培养基中30℃培养18h。

(5)18h后，在厌氧培养箱中取不同浓度(原菌液及浓缩10倍的菌液)的菌液涂布含有庆大霉素的nbaf琼脂平板，并将其置于厌氧培养箱中培养。

(6)挑取平板上的单菌落接种到还原后的nbaf培养基中，待菌株增殖生长后利用验证引物对verppfbfp-f/verppfbfp-r及seqgentfor/seqppfbfpr进行pcr扩增验证，验证结果如下图3。引物的序列如下：

verppfbfp-fcggacccaccattgcggataa(seqidno：10)

verppfbfp-rgactaggccgacaactcgatgt(seqidno：11)

seqgentforacgaaccgaacaggcttatgtc(seqidno：12)

seqppfbfpragatgaggatggactcgttgc(seqidno：13)

当geobactersulfurreducenspca被ppfbfp荧光蛋白成功标记后，利用激光共聚焦显微在发射波长及激发波长分别为495nm和452nm的条件下检测geobactersulfurreducensppfbfp的荧光状态，结果如图2所示。本实施例的荧光标记的半衰期达41h。厌氧菌株geobactersulfurreducenspca被该荧光蛋白标记后可与荧光显微镜结合在厌氧条件下实时观查菌株的运动轨迹、成膜过程及其他微生物间的群体行为。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种原位荧光标记地杆菌的方法

<130>2020

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>941

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgataaatgcaaaacttcttcagcttatggtagaacattcaaatgatggtatagtagta60

gcagaacaggaaggtaatgaatcaatacttatatatgtaaatcctgcatttgaaagactt120

acaggttattgtgcagatgatatactttatcaggatgcaagatttcttcagggtgaagat180

catgatcagcctggtatagcaataataagagaagcaataagagaaggtagaccttgttgt240

caggtacttagaaattatagaaaagatggttcacttttttggaatgaactttcaataaca300

cctgtacataatgaagcagatcagcttacatattatataggtatacagagagatgtaaca360

gcacaggtatttgcagaagaaagagtaagagaacttgaagcagaagtagcagaacttaga420

agacagcagggtcaggcaaaacattaaccatggggatccgtcgaccccggggaattctaa480

taaaaataactctgtagaattataaattagttctacagagttatttttggcgcctgatgc540

ggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagta600

caatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacg660

cgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccg720

ggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcc780

tcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcag840

gtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacatt900

caaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatg941

<210>2

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cggtacccggggatcgtggtggacccccttaccggt36

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cggccgttactagtgtgtgaccgctgccggctccggtca39

<210>4

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcatgagacaataaccctgataaatgagggcagacattgcggaacgtgcca52

<210>5

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgactctagaggatcgggttccgctgccgtcgtac35

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

atcacactggcggccgccgctggaaggtctgtcgatgca39

<210>7

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cttggcgttgatcatcgttgcctccttcattggtgataaaacagc45

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cactagtaacggccgccag19

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ggccgccagtgtgatggat19

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

cggacccaccattgcggataa21

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gactaggccgacaactcgatgt22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

acgaaccgaacaggcttatgtc22

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

agatgaggatggactcgttgc21