马短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体来说，涉及马多个短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒。
背景技术：
：短串联重复序列(shorttandemrepeats，str)：又称微卫星序列，是一类广泛存在于真核生物基因组中的dna重复序列。由2～6bp的核心序列构成，重复次数通常为15～30次，具有容易通过pcr扩增、电泳分型、分布广泛、多态信息含量高、呈共显性遗传等优点。其中最显著的优点是它的共显性遗传特征，这就使得纯合子和杂合子基因型可以被区分出来，极大地增加了亲子鉴定的准确性。目前str复合扩增分型技术已逐步取代传统的血清学方法，成为人类亲缘关系鉴定的主要方法。有关人的亲子鉴定、个体认定已经形成了一套稳定的str检测方法，而动物的此类相关研究相对滞后，可利用的str位点较少。马的许多特性都是高度遗传的，马主们认为马的后代的特质很大程度上与其父母相关，所以马的谱系对于很多马主和购马者而言是十分重要的。目前对马进行亲子鉴定的试剂盒大多数是以美国abi公司生产的选取vhl20、htg4、aht4、hms7、htg6、hms6、aht5、asb2、htg7、hms3、hms2共11个str位点的试剂盒，该试剂盒由于检测位点较少可能会有无法推测亲子关系的情况，此时便需要额外增加检测到17对或22对str位点，目前国内还没有此种类型的马亲子鉴定试剂盒，鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：针对上述领域的不足，本发明提供一种马短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，本复合扩增体系及试剂盒包含16个str位点及1个性别位点，可应用于马的群体遗传学分析或亲子鉴定检测中。本发明涉及马短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括16对引物，可同时扩增16个str位点：hms7、hms2、hms3、aht4、vhl20、lex33、ucdeq425、lex34、cor58、cor7、cor18、cor71、cor82、chr20、chr29、chr3，所述引物分别为：所述扩增hms7的上游引物序列如seqidno1所示，所述扩增hms7的下游引物序列如seqidno2所示；所述扩增hms2的上游引物序列如seqidno3所示，所述扩增hms2的下游引物序列如seqidno4所示；所述扩增hms3的上游引物序列如seqidno5所示，所述扩增hms3的下游引物序列如seqidno6所示；所述扩增aht4的上游引物序列如seqidno7所示，所述扩增aht4的下游引物序列如seqidno8所示；所述扩增vhl20的上游引物序列如seqidno9所示，所述扩增vhl20的下游引物序列如seqidno10所示；所述扩增lex33的上游引物序列如seqidno11所示，所述扩增lex33的下游引物序列如seqidno12所示；所述扩增ucdeq425的上游引物序列如seqidno13所示，所述扩增ucdeq425的下游引物序列如seqidno14所示；所述扩增lex34的上游引物序列如seqidno15所示，所述扩增lex34的下游引物序列如seqidno16所示；所述扩增cor58的上游引物序列如seqidno17所示，所述扩增cor58的下游引物序列如seqidno18所示；所述扩增cor7的上游引物序列如seqidno19所示，所述扩增cor7的下游引物序列如seqidno20所示；所述扩增cor18的上游引物序列如seqidno21所示，所述扩增cor18的下游引物序列如seqidno22所示；所述扩增cor71的上游引物序列如seqidno23所示，所述扩增cor71的下游引物序列如seqidno24所示；所述扩增cor82的上游引物序列如seqidno25所示，所述扩增cor82的下游引物序列如seqidno26所示；所述扩增chr20的上游引物序列如seqidno27所示，所述扩增chr20的下游引物序列如seqidno28所示；所述扩增chr29的上游引物序列如seqidno29所示，所述扩增chr29的下游引物序列如seqidno30所示；所述扩增chr3的上游引物序列如seqidno31所示，所述扩增chr3的下游引物序列如seqidno32所示。所述复合扩增体系还包括1对能扩增amel的引物，分别为：所述扩增amel的上游引物序列如seqidno33所示，所述扩增amel的下游引物序列如seqidno34所示。所述复合扩增体系所包括每个位点的引物对中均包含一条引物其5’端被所述荧光染料标记。所述复合扩增体系中被扩增位点分别由四种荧光染料标记，相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为：第一组lex34、amel、chr20、chr3、aht4；第二组cor7、cor71、hms2、chr29；第三组cor82、ucdeq425、lex33、hms7；第四组cor58、vhl20、cor18、hms3。所述四组中分别标记fam、hex、rox及tamra。所述第一组的荧光染料标记为fam标记，第二组的荧光染料标记为hex标记，第三组的荧光染料标记为rox标记，第四组的荧光染料标记为tamra标记，liz作为分子量内标参与检测。所述复合扩增体系还包括mastermix、模板dna及ddh2o。所述复合扩增体系扩增时的反应条件为：第1步：95℃预变性5min，第2步：94℃变性45sec，第3步：56℃退火1min，第4步：72℃延伸1min，重复2～4步骤35次，最后60℃延伸60min。一种试剂盒，包括上述任一项所述复合扩增体系。所述试剂盒，包括引物有17对，其用量浓度为：lex34，0.5μm；amel，0.5μm；chr20，1.5μm；chr3，4μm；aht4，5μm；cor7，0.4μm；cor71，2μm；hms2，2μm；chr29，1.5μm；cor82，1.5μm；ucdeq425，1.5μm；lex33，5μm；hms7，5μm；cor58，0.5μm；vhl20，2μm；cor18，5μm；hms3，5μm。所述试剂盒扩增组合物的含量如下：2.5xmastermix，4μl；引物混合物，1μl；dna，1μl；ddh2o，4μl。上述复合扩增体系或试剂盒在马亲子鉴定中的应用。所述复合扩增体系或试剂盒亦可用于马群体遗传学分析。本发明的有益之处在于：1、本发明提供的马短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，可用于dna或血液直接扩增，一次性扩增16个位于不同染色体上的马str位点和1个性别判定位点，能得到大量的信息，可快速准确进行马dna或血液str分型进而对马进行群体遗传学分析或亲子鉴定检测；2、各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高；3、系统特异性好，经过反复验证多次，无非特异性扩增产物产生，稳定性良好；4、本发明的技术体系可以快速(3-5小时)、准确(荧光标记)、高效(同时检测17个位点)地同时检测17个微卫星位点，读取同一个体样本17个不同微卫星的基因型，用于遗传多样性分析或亲子鉴定。附图说明图1本发明中引物cor82筛选过程中检测的分型图谱；图2本发明中引物lex33筛选过程中检测的分型图谱；图3本发明中引物chr19筛选过程中检测的分型图谱；图4采用本发明对样本1进行检测的分型图谱；图5采用本发明对样本2进行检测的分型图谱；图6采用本发明对样本3进行检测的分型图谱；图7采用本发明对样本4进行检测的分型图谱。具体实施方式本发明的设计思路发明人在不同染色体上，通过大量筛选工作，选择了16个具有高度敏感性及扩增特异性的马str位点，选择的位点包括hms7、hms2、hms3、aht4、vhl20、lex33、ucdeq425、lex34、cor58、cor7、cor18、cor71、cor82、chr20、chr29、chr3，还包括性别判定位点amel。实验表明，这些位点具有极佳的高度敏感性和特异性，这些位点组合能够有效用于马的遗传多样性分析或亲子鉴定。对于这些位点的扩增引物，由于引物数多，容易产生引物二聚体以及相互干扰等多方面因素，发明人在辅助设计得到的若干引物中进行了大量筛选工作，并结合引物浓度等因素，最终筛选得到符合要求的引物序列。扩增反应体系优化：发明人进行两组试验，第一组扩增体系包括：pcr缓冲液(常规方法配置)、混合引物、dna模板及taqdna聚合酶；第二组扩增体系包括：mastermix(苏州阅微基因技术有限公司)、混合引物、dna模板。通过从检出率、杂峰有无、峰型等评判，第二组体系比第一组体系效果好，选用该体系进行后续实验。扩增反应程序优化：经过大量试验摸索了反应程序的变性、退火及延伸的温度和时间范围，认为在以下条件下可以得到较好的结果。下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明：实施例1位点的筛选及扩增体系的建立1、位点的筛选本发明根据马基因组序列，筛选出重复单元2碱基以上且重复次数多于5次的str位点，设计引物。进一步，除性别位点外，每条染色体筛选出3-4个敏感性和特异性较佳位点，并进一步针对这些位点合成102对引物，这些引物兼顾相近的扩增条件，扩增产物大小(通常相差不超过50bp)，以及避免引物二聚体和相互干扰等等因素，进行进一步的筛选，筛选过程部分分型图谱情况见图1-3。因引物筛选工作量大且图表多，这里仅列举后续使用引物cor82(图1)和lex33(图2)，以及舍弃引物之一chr19的扩增结果(图3)，引物cor82在体系开发过程中至少有5个等位基因(237bp、239bp、241bp、243bp和245bp)和4种基因型(237/243bp、239/243bp、241/245bp和237/241bp)，引物lex33在体系开发过程中至少有4个等位基因(199bp、201bp、203bp和211bp)和4种基因型(201/203bp、201/201bp、199/203bp和203/211bp)，这2对引物扩增产物多态性丰富且无杂峰，故保留在后续体系开发中使用，而引物chr19仅1个等位基因(213bp)和1种基因型(213/213bp)，且扩增产物中有杂峰，疑似存在引物二聚体，因此在后续体系开发中舍弃不用。经过大量验证工作后得到包括hms7、hms2、hms3、aht4、vhl20、lex33、ucdeq425、lex34、cor58、cor7、cor18、cor71、cor82、chr20、chr29、chr3，还包括性别判定位点amel，17个位点分布在不同的染色体上，其具有多态性高、分辨率高，对位点的鉴别能力强，组合应用具有极高的敏感性和特异性。2、单引物验证针对筛选得到的这17个位点，进一步进行引物筛选验证。将针对这17个位点的引物，分为四组进行标记。每组采用一组荧光标记，分别为fam、hex、rox和tamra。得到荧光标记引物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩增产物置于abi3730xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。单引物验证包括两部分：1)验证单引物能够高效扩增，否则重新设计合成引物；2)能够特异性扩增，ce条带和预期中一致，且无非特异，否则重新设计合成引物。在前两点的基础之上，就可以开始混扩体系的开发。pcr体系：pcr程序：3、混扩体系的开发将同一荧光素标记的4对～5对引物混合置于同一管中进行组合扩增，将扩增产物置于abi3730xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此四对或五对引物的混合扩增是否引起非特异性扩增。由于产物、引物较多，调整扩增程序调整为：体系优化：从检出率、杂峰有无、峰型等评判，mastermix体系比10×bufferi好，选用该体系进行后续实验。最后，根据单个扩增和组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将针对不同位点的17对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。扩增程序为：扩增体系为：最终确定的17对引物序列分别见下表。混合引物比例为：实施例2扩增体系的应用以下是采用本发明对4例马血液样本进行检测的具体实施情况，4例样本记为样本1、样本2、样本3、样本4，下述试验步骤相同。1.dna提取采用chelex-100、dna提取试剂盒(天根生化)进行dna提取，操作步骤依照说明书。2.pcr过程2.1反应体系：将16个马str位点及性别判定位点amel，共17对引物分别溶解并配置成表1所示浓度，等体积配置成引物混合液，或配成相同浓度，调整体积比使引物混合液中各引物浓度为下表1所示浓度(引物序列见附录中序列表)。表1复合扩增体系中各引物浓度引物名称混合引物中浓度/μmlex340.5amel0.5chr201.5chr34aht45cor70.4cor712hms22chr291.5cor821.5ucdeq4251.5lex335hms75cor580.5vhl202cor185hms35将其他各反应试剂按照表2所示体积配置pcr反应体系，反应体系总体积为10μl，离心后进入下一步。表2扩增反应体系2.2pcr反应程序：将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃预变性5min，第2步：94℃变性45sec，第3步：56℃退火1min，第4步：72℃延伸1min，重复2～4步骤35次，最后60℃延伸60min。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。3.毛细管电泳检测3.1取上一步得到的pcr扩增产物，点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察结果，若出现目的条带则可上机检测。3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀释待用。将liz内标(苏州阅微基因技术有限公司)和甲酰胺按比例5:100混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，离心后放入abi3730xl测序仪上，准备检测。打开abi3730xl测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。点击运行，即开始检测。4.数据分析导入原始数据，在主页面的file菜单选择addsampletoproject，找到样品文件，选中文件夹，点击addtolist，点击add，样品文件即显示在project窗口；选择分析参数。定义analysismethod、panel和sizestandard。浏览样本电泳的原始数据，任一样本文件名，在“sample”菜单下选择“rawdata”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个橙色的内标峰之前)，以此时窗口左下角x轴上显示的数值作为analysismethod分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现saveproject对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysiscompleted。采用genemapperv3.2软件分析得到的数据并生成图谱，见图4-7。5.结果分析通过分型图(见图4-7)可知，通过本发明的复合扩增体系获得的dna分型图清晰。实施例3扩增体系的应用利用上述复合扩增体系对4个样本进行检测，将检测得到的原始数据文件导入到分析软件genemapperv3.2软件进行分析。检测结果如下：亲子鉴定结果为：样本1和样本3是父子，样本2和样本3是母子；样本1和样本4是父女，样本2和样本4是母女。样本5是理论上与其他4个待检样品无血缘关系的已知dna样品，从上表可见，样本1、2、3、4和样本5均无亲缘关系。鉴定结果与5个马个体的实际亲缘关系完全一致。序列表<110>北京市畜牧总站<120>马短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒<130>p1910175<160>34<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1caggaaactcatgttgataccatc24<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2tgttgttgaaacataccttgactgt25<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3acggtggcaactgccaaggaag22<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4cttgcagtcgaatgtgtattaaatg25<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5ccaactctttgtcacataacaaga24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6ccatcctcactttttcactttgtt24<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7aaccgcctgagcaaggaagt20<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列<400>8cccagagagtttaccct17<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<400>9caagtcctcttacttgaagactag24<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<400>10aactcagggagaatcttcctcag23<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列<400>11tttaatcaaaggattcagttg21<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12tttctcttcaggtgtcctc19<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13agctgcctcgttaattca18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14ctcatgtccgcttgtctc18<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15gcggaggtaagaagtggtag20<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列<400>16ggcctaagatgagggtgaa19<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<400>17gggaaggacgatgagtgac19<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<400>18caccaggctaagtagccaaag21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19gtgttggatgaagcgaatga20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20gacttgcctggctttgagtc20<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<400>21agtctggcaatattgaggatgt22<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<400>22agcagctaccctttgaatactg22<210>23<211>21<212>dna<213>人工序列<400>23cttgggctacaacagggaata21<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<400>24ctgctatttcaaacacttgga21<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25gcttttgtttctcaatcctagc22<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<400>26tgaagtcaaatccctgcttc20<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27cacagctggacaccaatgac20<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<400>28tggtgcccattgtgtgttac20<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<400>29cctgttgtatgcttcagcca20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<400>30tgggacttgccagcttctat20<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列<400>31ccaatgctcatggactcaga20<210>32<211>20<212>dna<213>人工序列<400>32gatttagcccaggcaattca20<210>33<211>30<212>dna<213>人工序列<400>33ccaacccaacaccaccagccaaacctccct30<210>34<211>30<212>dna<213>人工序列<400>34agcatagggggcaagggctgcaaggggaat30当前第1页12