本发明涉及中药提取领域，涉及齐墩果烷型三萜皂苷类化合物及其提取方法和用途。
背景技术：
：：紫草科牛舌草属(anchusa.l)植物为我国传统药用植物，牛舌草为本属植物意大利牛舌草anchusaitalicretiz.的干燥地上部分。牛舌草主要分布于地中海和热带地区，在我国新疆维吾尔地区分布较为广泛，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维药分册，维文名又称高孜万。具有生湿补脑、调节异常黑胆质、祛寒补心、爽心悦志、润燥消炎、止咳平喘等功能(付瑾,刘霞.维药牛舌草的研究与应用[j].安徽农业科学,2015,43(11):111-115.)，国内外学者通过体内、体外实验证实了牛舌草的抗肿瘤作用(upurh,yusupa,baudrimonti,etal.inhibitionofcellgrowthandcellularprotein,dnaandrnasynthesisinhumanhepatoma(hepg2)cellsbyethanolextractofabnormalsavdamunziqoftraditionaluighurmedicine[j].evidence-basedcomplementaryandalternativemedicine,2011,9:348-352.)，抗氧化作用(confortif,marrellim,carmelac,etal.bioactivephytonutrients(omegafattyacids,tocopherols,polyphenols),invitroinhibitionofnitricoxideproductionandfreeradicalscavengingactivityofnon-cultivatedmediterraneanvegetables[j].foodchemistry,2011,129:1413-1419.)，抗炎作用(kuruuzum-uza,suleymanh,cadircie,etal.investigationonanti-inflammatoryandantiulceractivitiesofanchusaazureaextractsandtheirmajorconstituentrosmarinicacid[j].z.naturforsch.2012,67(7-8):360-366.)，抗菌作用(boskovic1i,d,maskovicp,etal.phytochemicalcompositionandantimicrobial,antioxidantandcytotoxicactivitiesofanchusaofficinalisl.extracts[j].biologia,2018,73(11):1035-1041.)以及胃蛋白酶抑制作用(ghalebma.peprininhibitorfromrootsofanchusastrigosa[j].phytochemistry.1998,48(2):217-221.)等作用。文献报道从牛舌草属植物中分离得到的三萜类化合物主要包括齐墩果烷型及乌苏烷型三萜(omerk,cosimop.triterpeneandflavoneglycosidesfromanchusaundulatasubsp.hybrid[j].naturalproductresearch,2009,23(3):284-292.)。为了将牛舌草的药用价值发挥到最大，我们对牛舌草地上部分进行了系统的成分研究，发现了新的齐墩果烷型三萜皂苷，利用核磁、红外、质谱等手段对化合物的结构进行了确证，并检测其对心肌细胞缺氧/复氧再灌注损伤的保护作用。技术实现要素：本发明的目的是提供齐墩果烷型三萜皂苷类化合物。本发明的第二个目的是提供齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的提取方法。本发明的第三个目的是提供齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的用途。本发明的第四个目的是提供包含所述的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的牛舌草地上部分提取物。本发明的第五个目的是提供牛舌草地上部分提取物的用途。本发明的第六个目的是提供含齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的药物组合物。本发明的第七个目的是提供上述药物组合物的用途。本发明的技术方案如下：齐墩果烷型三萜皂苷类化合物或其盐，具有式(i)的结构：其中：r1为h,o-β-d-glc或oh；r2为oh,o-β-d-glc,o-β-d-glc-(1-2)-β-d-glc或＝o；r3为h,oh或o-β-d-glc-(1-2)-β-d-glc；r4为h或β-d-glc；r5为o-β-d-glc,o-β-d-glc-(1-2)-β-d-glc或＝o；进一步地，本发明提供如下结构的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物或其盐：本发明还提供了所述的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：(1)以牛舌草地上部分为原料，加入原料8-12质量倍的体积分数为60％-80％乙醇水溶液，回流提取2-4次，每次提取2-4小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总粗提物；(2)将粗提物分散到5-10质量倍的水中，用ab-8大孔吸附树脂进行吸附，分别用纯水、30％、50％、70％、95％乙醇水洗脱，将各馏分洗脱液减压浓缩分别得到水层、30％乙醇层、50％乙醇层、70％乙醇层和95％乙醇层；(3)50％乙醇层和70％乙醇层部分经硅胶柱色谱分离，分别以体积比为100:1-1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，50％乙醇层得到馏分d1、d2、d3、d4、d5和d6，70％乙醇层中得到馏分d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8和d9。(4)50％乙醇层馏分d6和70％乙醇层馏分d6分别经硅胶柱色谱分离，并以体积比为100:1-2:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到50％乙醇层馏分d66、d69、d6-10和70％乙醇层馏分d65；(5)50％乙醇层馏分d66经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇等度洗脱，得到馏分d6631、d6632和d663；(6)馏分d663经ods柱色谱分离，以体积比为2:8-1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d6631、d6632、d6633、d6634、d6635和d6636；(7)馏分d6635经制备hplc色谱，以体积比为50％-60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物6；(8)50％乙醇层馏分d69经ods柱色谱分离，以体积比为2:8-1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d691、d692、d693和d694；(9)馏分d694经制备hplc色谱，以体积比为50％-60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3、4和化合物5；(10)50％乙醇层馏分d6-10经ods柱色谱分离，以体积比为1:9～1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d6-10-1、d6-10-2、d6-10-3和d6-10-4；(11)馏分d6-10-3经制备hplc色谱，以体积比为50％-60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1和化合物2；(12)70％乙醇层馏分d65经ods柱色谱分离，以体积比为1:9-1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d651和d652；(13)馏分d652经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇等度洗脱，得到馏分d6521、d6522和d6523；(14)馏分d6522经制备hplc色谱，以体积比为60％-70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分d65221和d65222；(15)馏分d65222经制备hplc色谱，以体积比为50％-70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物7。本发明进一步提供了齐墩果烷型三萜皂苷类化合物在制备心肌保护药物中的应用。本发明还包含齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的牛舌草地上部分提取物。一种药物组合物，包含齐墩果烷型三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明还提供了牛舌草地上部分提取物或其药物组合物在制备心肌保护药物中的应用。本发明的优点：本发明提供了一系列齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，药理试验证明，所述的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物对心肌细胞缺氧/复氧再灌注损伤具有保护作用，提示本发明化合物可用于制备预防和治疗心肌细胞损伤的药物。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1牛舌草中齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的提取方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以牛舌草地上部分为原料总干重约30kg，加入原料10质量倍的体积分数为75％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总粗提物(1750g)；(2)将粗提物分散到5-10质量倍的水中，用ab-8大孔吸附树脂进行吸附，分别用纯水、30％、50％、70％、95％乙醇水洗脱，将各馏分洗脱液减压浓缩分别得到水层、30％乙醇层、50％乙醇层、70％乙醇层和95％乙醇层；(3)50％乙醇层和70％乙醇层部分经硅胶柱色谱分离，分别以体积比为100:1、100:2、100:5、100:10、5:1、2:1和1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，50％乙醇层得到馏分d1、d2、d3、d4、d5和d6，70％乙醇层中得到馏分d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8和d9。(4)50％乙醇层馏分d6和70％乙醇层馏分d6分别经硅胶柱色谱分离，并以体积比为100:1、100:2、100:5、100:10、5:1、2:1和1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到50％乙醇层馏分d66、d69、d6-10和70％乙醇层馏分d65；(5)50％乙醇层馏分d66经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇等度洗脱，得到馏分d6631、d6632和d663(15.5g)；(6)馏分d663经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5、2:1和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d6631、d6632、d6633、d6634、d6635和d6636；(7)馏分d6635经制备hplc色谱，以体积比为60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物6(26.0mg)；(8)50％乙醇层馏分d69经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5、2:1和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d691、d692、d693和d694；(9)馏分d694经制备hplc色谱，以体积比为55％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3(210.0mg)、4(66.3mg)和化合物5(39.5mg)；(10)50％乙醇层馏分d6-10经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5、2:1和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d6-10-1、d6-10-2、d6-10-3和d6-10-4；(11)馏分d6-10-3经制备hplc色谱，以体积比为55％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1(76.7mg)和化合物2(64.0mg)；(12)70％乙醇层馏分d65经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5、2:1和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分d651和d652；(13)馏分d652经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇等度洗脱，得到馏分d6521、d6522和d6523；(14)馏分d6522经制备hplc色谱，以体积比为65％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分d65221和d65222；(15)馏分d65222经制备hplc色谱，以体积比为60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物7(18.2mg)。化合物的物理化学和常数如下：化合物1:白色无定型粉末(meoh)，-117.0(c＝0.20,meoh)；ir(kbr)νmax3422,2925,1702,1384,1077；hresims(positive)m/z:1013.4966[m+na]+(calcdforc48h78o21na,1013.4927),分子式c48h78o21；1h-nmr(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表1。化合物2:白色无定型粉末(meoh)，-113.9(c＝0.24,meoh)；ir(kbr)νmax3423,2926,1638,1384,1076；hresims(positive)m/z:1013.4963[m+na]+(calcdforc48h78o21na,1013.4927),分子式c48h78o21；1h-nmr(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表2。化合物3:白色无定型粉末(meoh)，-114.2(c＝0.20,meoh)；ir(kbr)νmax3423,2929,1702,1385,1073；hresims(positive)m/z:997.5019[m+na]+(calcdforc48h78o20na,997.4978),分子式c48h78o20；1h-nmr(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表3。化合物4:白色无定型粉末(meoh)，-95.7(c＝0.30,meoh)；ir(kbr)νmax3423,2923,1628,1384,1074；hresims(positive)m/z:997.5018[m+na]+(calcdforc48h78o20na,997.4978),分子式c48h78o20；1h-nmr(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表4。化合物5:白色无定型粉末(meoh)，-40(c＝0.5,meoh)；ir(kbr)νmax:3396,2922,2850,1740,1646,1261,802cm-1；hresimsm/z997.4986[m+na]+(calcdforc48h78o20na+,997.4978)，分子式c48h77o20；1h(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表5。化合物6:白色无定型粉末(meoh)，-100.5(c＝0.20,meoh)；ir(kbr)νmax3424,2922,1627,1384,1075；hresims(positive)m/z:810.4498[m+h]+(calcdforc42h67o15,810.4474),分子式c42h66o15；1h-nmr(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)数据见表6。化合物7:白色无定型粉末(meoh)，-84.7(c＝0.20,meoh)；ir(kbr)νmax3423,2952,1650,1631,1404,1385cm-1；hresims(negative)m/z：709.3802[m+hcoo]-(calcdforc37h57o13,709.3799)，确定分子式为c36h56o11；1h-nmr(600mhz,dmso-d6)和13c-nmr(150mhz,dmso-d6)数据见表7。表1化合物1的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，pyridine-d5；13c-nmr，150mhz，pyridine-d5。表2化合物2的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，pyridine-d5；13c-nmr，150mhz，pyridine-d5。表3化合物3的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，meoh-d4；13c-nmr，150mhz，meoh-d4。表4化合物4的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，pyridine-d5；13c-nmr，150mhz，pyridine-d5。表5化合物5的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，pyridine-d5；13c-nmr，150mhz，pyridine-d5。表6化合物6的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，pyridine-d5；13c-nmr，150mhz，pyridine-d5。表7化合物7的碳谱和氢谱数据注：1h-nmr，600mhz，dmso-d6；13c-nmr，150mhz，dmso-d6。通过理化常数和现代波谱学手段(hresims和nmr)，结合文献相关数据，鉴定它的结构，化合物1-7均为未见文献报道的新化合物，如下所示：实施例2牛舌草中齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：(1)以牛舌草地上部分为原料，加入原料8质量倍的体积分数为60％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总粗提物；(2)将总浸膏分散到5质量倍的水中，用ab-8大孔吸附树脂进行吸附，分别用纯水、30％、50％、70％、95％乙醇水洗脱，将各馏分洗脱液减压浓缩分别得到水层、30％乙醇层、50％乙醇层、70％乙醇层和95％乙醇层；(3)-(15)同实施例1(3)-(15)。实施例3牛舌草中齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：(1)以牛舌草地上部分为原料，加入原料10质量倍的体积分数为80％乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总粗提物；(2)将总浸膏分散到8质量倍的水中，用ab-8大孔吸附树脂进行吸附，分别用纯水、30％、50％、70％、95％乙醇水洗脱，将各馏分洗脱液减压浓缩分别得到水层、30％乙醇层、50％乙醇层、70％乙醇层和95％乙醇层；(3)-(15)同实施例1(3)-(15)。实施例4sd大鼠乳鼠心肌细胞的体外分离与培养1)取新生3d以内的乳鼠，使用75％酒精体外消毒后，用眼科剪沿胸骨左侧打开胸腔，使用弯镊取下心脏迅速放入4℃预冷的pbs溶液中。2)剥去心脏表面结缔组织，洗去血液，保留心脏的心尖部分，转移至另一预先加入预冷pbs的培养皿中，用眼科镊子将心脏剪成1mm3左右的小块。3)将组织碎块转移至15ml离心管中，使用2ml胰酶冲洗培养皿，转移至离心管中，加入3ml胰酶，37℃水浴锅摇晃消化10min，待自然沉淀小心吸取上清弃掉(结缔组织和血细胞居多)。4)加入5-8ml胰酶，混匀，于37℃消化10min，待自然沉淀，小心吸取上清，转移至预先加有5ml含10％fbs的dmem中(此步骤重复5-8次)。5)合并所有细胞悬液，过200目筛，1000rpm离心5min，弃上清，加入含10％fbs的dmem中重悬，加入培养皿中进行差速培养。6)1.5h后小心吸取上层未贴壁细胞至另一培养皿中，37℃，5％co2培养箱进行培养至细胞伪足伸出，开始同步搏动，进行下一步实验.体外心肌细胞缺氧复氧模型的建立缺氧模型建立：1)心肌细胞于37℃，95％n2，5％co2的恒温培养箱培养后，细胞融合度>90％时用于实验，铺96孔板，使细胞贴壁并伸出伪足。2)将含10％fbs的dmem培养基更换为无糖无血清培养基，并通95％n2，5％co2进行预饱和后用于实验。3)将96孔板中培养液更换为预先n2饱和的无糖无血清培养基，置于缺氧装置中，使用95％n2，5％co2置换装置内空气半小时后，密封装置，于37℃培养箱中缺氧培养4h，建立缺氧模型。复氧模型的建立：1)缺氧结束后，更换为含有10％fbs的dmem培养基，于正常培养箱中培养3，6，9，12小时，检测各条件下的指标。2)实验检测指标：孔中细胞使用mtt检测细胞存活率，取各孔中上清分别使用丙酮酸法检测ldh含量，免疫抑制法测ck-mb含量。3)根据检测的指标，来确定复氧模型的最优条件，进行后续实验。mtt法检测化合物对心肌细胞缺氧/复氧再灌注损伤的保护作用1)大鼠心肌细胞胰酶处理，制成浓度为1×104cells/well单细胞悬液，接种于96孔板内(200μl)，每组设3个平行孔。2)24小时后加入受试物(100μm)培养3小时，利用上述建立好的模型条件，进行心肌细胞缺氧/复氧再灌注，利用mtt，检测细胞存活率。结果如表8。实验结果表明，化合物1-7均能不同程度地使细胞存活率增加，化合物6和7能够使细胞存活率明显增加，具有较好的心肌保护作用。表8：化合物6和7对心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的保护作用含有本发明所述化合物或组合物的心肌保护药物可以为适用于口服或注射等应用形式，例如，可为片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。当前第1页12当前第1页12