本发明涉及药物领域，尤其涉及一种n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物，以及作为细胞周期检查点激酶1(chk1)抑制剂在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
靶向细胞周期已经成为抗肿瘤研究的热点。当细胞的dna因细胞毒药物、放疗而发生损伤时，会激活体内的dna损伤应答通路，从而修复受损的dna，其中细胞周期检查点激酶1(chk1)在这条通路中发挥着重要的作用。当dna发生损伤时，引起g1期，s期或g2/m期细胞周期阻滞，其中细胞周期检查点激酶1(chk1)主要负责s和g2/m期检查点的调控。在大部分肿瘤细胞中，因为p53基因的缺陷而导致其g1检查点缺失，因此大多数肿瘤细胞主要依赖于s和g2/m期检查点。若在dna损伤的同时抑制chk1蛋白，清除仅存的s和g2/m期检查点，阻碍肿瘤细胞的自我修复，可以促进肿瘤细胞凋亡。由于正常细胞可以依靠p53进行自我修复和保护，因而对chk1抑制剂相对不敏感，这使得chk1抑制剂在肿瘤治疗中有很好的靶向肿瘤细胞的选择性。目前已有12个chk1小分子抑制剂进入临床研究，处于临床i期研究的为gdc-0575、xccs605b和ly-2880070，临床ii期研究的为ly2606368和cct-245737。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物，及其光学异构体或其药学上可接受的盐。
为实现上述目的，本发明提供的n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物具有通式i的结构：
及其光学异构体或其药学上可接受的盐，
其中；
r1选自三氟甲基、三氟甲基吡唑；
r2选自h、甲氧基、甲氨基；
x选自o、nra；
ra选自h、c1-3烷基；
n选自0、1、2、3或4；
r3选自-l1-nrbrc、
l1为无取代或取代的c2-4烷基、
所述的c2-4烷基可任选地被一个或多个选自氘、卤素、氨基、羟基、c1-4烷基、卤代c1-4烷基取代；
m和o分别独立地选自0、1、2或3，k选自1，2，3或4；
rb和rc分别独立地选自h、c1-4烷基、卤代c1-4烷基、c3-8环烷基、卤代c3-8环烷基；
p和q分别独立地选自1，2，3，4；
rd选自氨基、羟基；
进一步更具体地，本发明通式i结构的优选化合物选自：
3-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-(2-氨基乙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基乙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，4r)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，4r)-4-氨基环己基)氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，3s)-3-氨基环丁基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，3r)-3-氨基环丁基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，3r)-3-氨基环戊基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，3s)-3-氨基环戊基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，3s)-3-氨基环戊基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，3r)-3-氨基环戊基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-甲氧基-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，3s)-3-氨基环丁氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，3r)-3-氨基环丁氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，4r)-4-氨基环己基)氨基)-5-((5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基-2-甲基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-((2-(甲氨基)丙基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1-氨基环丙基)甲基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1-氨基环丁基)甲基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-(环丙氨基)乙基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((3-氨基-3-甲基丁基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(1-三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基乙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(1-三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((2-氨基-2-甲基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1r，4r)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶
本发明提供的化合物可接受的盐，选自无机酸和有机酸，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、硬脂酸盐和三氟乙酸盐。
本发明的另一个目的是提供所述的n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物及其光学异构体或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为血液肿瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌、甲状腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、胃肠道间质瘤、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、皮肤癌。所述药物由n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物及其光学异构体或其药学上可接受的盐与药学上允许的辅料制成。所述药物作为细胞周期检查点激酶1(chk1)抑制剂，在肿瘤治疗中有很好的靶向肿瘤细胞的选择性。本发明提供的n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物具有chk1抑制活性。
所述药物单用和/或与其他化疗药物、放射治疗、免疫治疗药物等组合联用。
本发明提供的n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物及其光学异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，通过以下步骤实现：
方法一：
以5-三氟甲基-2,4-二氯嘧啶为起始原料，依次经氨化和甲胺化取代得n4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺中间体；
5-溴-2-氰基-3-硝基吡啶在碱性条件下，与不同的醇经取代反应得到不同取代的吡啶片段中间体，进而与得到的n4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺中间体反应，脱保护基得到目标化合物：
方法二：
5-溴-2-氰基-3-氟吡啶在碱性条件下，与不同的脂肪胺经取代反应得到不同取代的吡啶片段中间体，进而与方法一得到的n4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺中间体反应，脱保护基得到目标化合物：
方法三：
以2-氯-5-三氟甲基嘧啶为起始原料，经氨化得5-三氟甲基-2-氨基嘧啶中间体；
5-溴-2-氰基-3-氟吡啶在碱性条件下，与不同的脂肪胺经取代反应得到不同取代的吡啶片段中间体，进而与得到的5-三氟甲基-2-氨基嘧啶中间体反应，脱保护基得到目标化合物：
方法四：
以5-三氟甲基-2,4-二氯嘧啶为起始原料，依次经氨化和甲醚化取代得4-甲氧基-5-(三氟甲基)吡啶-2-胺；
5-溴-2-氰基-3-氟吡啶在碱性条件下,与不同的脂肪胺经取代反应得到不同取代的吡啶片段中间体，进而与得到的4-甲氧基-5-(三氟甲基)吡啶-2-胺反应，脱保护基得到目标化合物：
方法五：
以5-溴-2,4-二氯嘧啶为起始原料，依次经甲胺化和氨化，再经suzuki偶联得n4-甲基-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺，进而与得到的不同取代的吡啶片段中间体反应，脱保护基得到目标化合物：
方法六：
5-溴-2-氰基-3-硝基吡啶在碱性条件下,与不同的醇经取代反应得到不同取代的吡啶片段中间体，进而与方法五得到的n4-甲基-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺反应，脱保护基得到目标化合物：
方法七：
将1.2当量的无机酸或有机酸溶于乙醇溶液中，缓慢滴加到化合物的乙醇溶液中，加入适量的乙醚溶液，抽滤得到成盐化合物，用乙醚洗涤，干燥即得。
实验证明，本发明的具有全新骨架的n-多取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物具有良好的chk1蛋白抑制活性，部分化合物对mv4-11，z138，mm1s等血液瘤细胞株有明显的体外增殖抑制作用。本发明化合物的合成路线设计合理，所需原料易得，反应条件温和，各步产率高，操作简便，适合工业化生产。因此，本发明的化合物可作为chk1抑制剂应用于肿瘤治疗中。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
制备实施例13-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物1)的制备
步骤1.5-三氟甲基-4-氯-2-氨基嘧啶(中间体1-2)合成
将2,4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(5.2g,24.07mmol)溶于氨气饱和的乙醇(25ml)中，室温搅拌2h，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(5:1)为洗脱剂，得白色固体1-2(2.3g,11.67mmol)，收率：48.5％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.57(s,1h),7.98(s,2h)；esi-ms:m/z＝198.0[m+h]+。
步骤2.n4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(中间体1-3)合成
将中间体1-2(1g,5.08mmol)溶于乙腈溶液中，滴加甲胺的醇溶液(10ml)，回流反应3h，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(2:1)为洗脱剂，得白色固体1-3，收率：73.8％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.04(d,j＝1.0hz,1h),5.30(s,1h),5.11(s,1h),2.99(d,j＝5.0hz,1h)；esi-ms:m/z＝193.0[m+h]+。
步骤3.(3-(3-n-叔丁氧羰基氨基丙氧基)-5-溴-2氰基吡啶(中间体1-5)合成
将3-叔丁氧羰基氨基-1-丙醇(800mg,4.55mmol)溶于无水的thf(15ml)溶液中,冰浴下分批加入60％氢化钠(218mg)，室温下搅拌半小时。在氮气保护下，将5-溴-2-氰基-3-硝基吡啶(794.5mg,3.5mmol)溶于无水的thf(5ml)溶液中，将上述制得的钠盐滴加到上述溶液中，室温下反应1h。加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(3:1)为洗脱剂，收率：50.1％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.34(d,j＝2.0hz,1h),7.52(d,j＝1.5hz,1h),4.77(s,1h),4.17(t,j＝6.0hz,2h),3.36(q,j＝6.5hz,2h),2.13-2.06(m,2h),1.43(s,9h)；esi-ms:m/z＝356.0[m+h]+。
步骤4.3-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物1)合成
氮气保护下，向中间体1-3(122.8mg,0.64mmol)，中间体1-5(250.0mg,0.70mmol)，四三苯基膦钯(37mg,0.032mmol)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(37mg,0.06mmol)，碳酸铯(312.1mg，0.96mmol)的混合物加入无水二氧六环(10ml)，回流搅拌5h，抽滤，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(1:1)为洗脱剂，得淡黄色固体。用盐酸饱和的乙酸乙酯脱保护基得白色固体化合物1。收率：70％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.43(br,2h),8.24(s,1h),7.43(s,1h),4.18(t,j＝6.5hz,2h),2.96(d,j＝3.0hz,3h),2.72(t,j＝6.5hz,2h),1.89-1.80(m,2h)；esi-ms:m/z＝368.1[m+h]+。
制备实施例2化合物2-6的合成
以化合物1-4为原料，分别采用n-(叔丁氧羰基)乙醇胺，顺式-3-羟基环丁基氨基甲酸叔丁酯，反式-3-羟基环丁基氨基甲酸叔丁酯，顺式-n-boc-4-氨基环己醇，反式-n-boc-4-氨基环己醇代替化合物3-叔丁氧羰基氨基-1-丙醇，合成得到化合物2-6。该系列目标分子如下表1所示。
表1
制备实施例33-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物7)的制备
步骤1.(3-(3-n-叔丁氧羰基氨基丙氨基)-5-溴-2氰基吡啶(中间体1-7)合成
将5-溴-2-氰基-3-氟吡啶(250mg,1.25mmol)，n-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺(326mg,1.88mmol)溶于乙腈(10ml)溶液中，滴加三乙胺(0.5ml)回流反应12h,减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(4:1)为洗脱剂，收率：90％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.97(d,j＝1.5hz,1h),7.18(d,j＝1.5hz,1h),5.15(s,1h),4.72(s,1h),3.30-3.20(m,4h),1.82(p,j＝6.5hz,2h),1.44(s,9h)；esi-ms:m/z＝355.0[m+h]+。
步骤2.3-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物7)的合成
氮气保护下，向中间体1-3(100.0mg,0.52mmol)，中间体1-7(200.0mg,0.52mmol)，四三苯基膦钯(30.0mg,0.026mmol)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(30.0mg,0.052mmol)，碳酸铯(254.0mg,0.78mmol)的混合物加入无水二氧六环(10ml)，回流搅拌5h，抽滤，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以ea:ch2cl2(1:2)为洗脱剂，得白色固体。用盐酸饱和的乙酸乙酯脱保护基得白色固体化合物7。收率：66％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.24(s,1h),8.16(s,1h),7.91(s,1h),7.37(s,1h),6.61(s,1h),3.23-3.18(m,2h),2.96(d,j＝3.5hz,4h),2.65(t,j＝6.0hz,2h),1.70-1.61(m,2h)；esi-ms:m/z＝367.1[m+h]+。
制备实施例4化合物8-24的合成
合成步骤参考实施例3，以5-溴-2-氰基-3-氟吡啶为起始原料，分别采用3-n-叔丁氧羰基-3-甲基-1,3-丁二胺，n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺，n2-叔丁氧羰基-n2-甲基-1,2-丙二胺，2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯，2-n-叔丁氧羰基-1,2-丙二胺，2-n-叔丁氧羰基-2-甲基-1,2-丙二胺，1-氨甲基-1-(叔丁氧羰基-氨基)环丙烷，1-氨甲基-1-(叔丁氧羰基-氨基)环丁烷，n-叔丁氧羰基-n-环丙基乙二胺，顺式-3-氨基-1-环丁基氨基甲酸叔丁酯，反式-3-氨基-1-环丁基氨基甲酸叔丁酯，(1s,3r)-1-(叔丁氧羰基-氨基)-3-氨基环戊烷，(1r,3r)-1-(叔丁氧羰基-氨基)-3-氨基环戊烷，(1s,3s)-1-(叔丁氧羰基-氨基)-3-氨基环戊烷，(1r,3s)-1-(叔丁氧羰基-氨基)-3-氨基环戊烷，n-叔丁氧羰基-反式-1,4-环己二胺，n-叔丁氧羰基-顺式-1,4-环己二胺替代n-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺合成相应的中间体，进而在四三苯基膦钯，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽的催化下，与中间体1-3反应，最后脱保护基得到化合物8-24。该系列目标分子如下表2所示。
表2
制备实施例53-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物25)的制备
步骤1.5-三氟甲基-2-氨基嘧啶(中间体1-9)合成
将化合物2-氯-5-三氟甲基嘧啶(910mg,5mmol)溶于乙醇(5ml)溶液中，冰浴下滴加氨气饱和的乙醇溶液(15ml)，室温下反应2h，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(4:1)为洗脱剂，得白色固体。esi-ms:m/z＝164.0[m+h]+。
步骤2.(3-(4-叔丁氧羰基氨基环己基氨基)-5-溴-2氰基吡啶(中间体1-10)合成
将5-溴-2-氰基-3-氟吡啶(200mg,1.0mmol),n-叔丁氧羰基-顺式-1,4-环己二胺(246mg,1.15mmol)溶于乙腈(10ml)溶液中,滴加三乙胺(0.5ml)回流反应12h,减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(3:1)为洗脱剂，收率：85％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.98(d,j＝2.0hz,1h),7.17(d,j＝2.0hz,1h),4.65(d,j＝6.5hz,1h),4.60(s,1h),3.74-3.60(m,1h),3.56-3.44(m,1h),1.88-1.77(m,4h),1.75-1.55(m,4h),1.45(s,9h)；esi-ms:m/z＝395.1[m+h]+。
步骤3.3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物25)合成
氮气保护下，向中间体1-9(90.0mg,0.55mmol)，中间体1-10(250.0mg,0.63mmol)，四三苯基膦钯(31.0mg,0.027mmol)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(31.0mg,0.055mmol)，碳酸铯(268.0mg,0.82mmol)的混合物加入无水二氧六环(10ml)，回流搅拌5h，抽滤，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(1:1)为洗脱剂，得白色固体。用盐酸饱和的乙酸乙酯脱保护基得白色固体化合物25。收率：60％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.96(s,2h),8.27(d,j＝1.5hz,1h),7.88(s,1h),5.62(d,j＝7.0hz,1h),3.44-3.36(m,1h),2.93-2.87(m,1h),1.86-1.77(m,2h),1.68-1.53(m,4h),1.51-1.43(m,2h)；esi-ms:m/z＝378.1[m+h]+。
制备实施例63-((1r，4r)-4-氨基环己基)氨基)-5-((5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物26)的制备
合成步骤参考实施例5，采用n-叔丁氧羰基-反式-1,4-环己二胺替换n-叔丁氧羰基-顺式-1,4-环己二胺得到化合物26。收率：55％；esi-ms:m/z＝378.1[m+h]+。
制备实施例73-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-甲氧基-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物27)的制备
步骤1.2-氨基-4-甲氧基-5-三氟甲基嘧啶(中间体1-12)合成
将化合物1-2(500mg,2.54mmol)溶于甲醇(8ml)溶液中,冰浴下滴加甲醇钠(8ml)溶液，常温下反应2h，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(3:1)为洗脱剂，得到化合物1-12。收率：90％；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.25(d,j＝1.0hz,1h),5.48(s,2h),3.97(s,3h)；esi-ms:m/z＝194.1[m+h]+。
步骤2.3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氨基)-5-((4-甲氧基-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物27)合成
合成步骤参考制备实施案例1的步骤4，用2-氨基-4-甲氧基-5-三氟甲基嘧啶(中间体1-12)替换n4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(中间体1-3)，得到化合物27。收率：50％；esi-ms:m/z＝408.1[m+h]+。
制备实施例83-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(1-三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物28)的制备
步骤1.5-溴-2-氯-n-甲基嘧啶-4-胺(中间体1-14)合成
将5-溴-2,4-二氯嘧啶(5.0g,22mmol)溶于甲醇溶液(42ml)中，冰浴下缓慢滴加甲胺的醇溶液(8ml)，室温下反应1h,减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(5:1)为洗脱剂，得到化合物1-14。收率：85％；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.85(s,1h),7.75(s,1h),2.85(d,j＝4.0hz,3h)；esi-ms：m/z＝221.9[m+1]+。
步骤2.5-溴-n4-甲基嘧啶-2,4-二胺(中间体1-15)合成
将化合物1-14(800mg,3.62mmol)置于封管中，加入氨气饱和的乙醇溶液(15ml)，100℃下反应24h,冷却至室温，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(2:1)为洗脱剂，得到化合物1-15,收率：78％；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.86(s,1h),5.22(s,1h),4.85(s,2h),2.99(d,j＝6.0hz,3h)；esi-ms：m/z＝202.9[m+1]+。
步骤3.n4-甲基-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺(中间体1-16)合成
在氮气保护下，将化合物1-15(60mg,0.29mmol)，4-硼酸频哪醇酯-1-(三氟甲基)-1h-吡唑(100mg,0.38mmol)，[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(6mg,0.0058mmol)，碳酸钾(81mg,0.59mmol)溶于甲苯溶液中,回流搅拌12h,冷却至室温，过滤，减压回收溶剂得残余物，用硅胶柱层析纯化，以pe:ea(2:1)为洗脱剂，得到化合物1-16。收率：46.2％；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.84(s,1h),7.80(s,1h),7.70(s,1h),4.95(s,1h),4.78(s,1h),2.95(d,j＝5.0hz,1h)；esi-ms：m/z＝259.1[m+1]+。
步骤4.3-((3-氨基丙基)氨基)-5-((4-甲基氨基)-5-(1-三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物28)合成
合成步骤参考制备实施案例1的步骤4；收率:40％；esi-ms：m/z＝433.2[m+1]+。
制备实施例9化合物29-32合成
合成步骤参考实施例8，以n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺，2-n-boc-2-甲基-1,2-丙二胺，n-叔丁氧羰基-反式-1,4-环己二胺，n-叔丁氧羰基-顺式-1,4-环己二胺替代n-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺，得到化合物29-32，该系列目标分子如下表3所示。
表3
制备实施例103-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物33)的制备
合成步骤参考制备实施案例1的步骤4，收率:60.0％；esi-ms：m/z＝434.1[m+1]+。
制备实施例113-((1s，4s)-4-氨基环己基)氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物34)的制备
步骤1.3-((1s,4s)-4-叔丁氧羰基氨基环己基氧基)-5-溴-2-氰基吡啶(中间体1-17)合成
合成步骤参照实施案例1步骤3。esi-ms：m/z＝396.1[m+1]+。
步骤2.3-((1s，4s)-4-氨基环己基)氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(1-(三氟甲基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶(化合物34)合成
合成步骤参考制备实施案例1的步骤4，esi-ms：m/z＝474.2[m+1]+。
制备实施例123-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶盐酸盐(化合物35)的制备
步骤1.3-(3-氨基丙氧基)-5-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氰基吡啶盐酸盐(化合物35)的合成
将化合物1(100mg,0.27mmol)溶于乙醇溶液中(2ml),将浓盐酸(0.03ml)缓慢滴加到化合物1的乙醇溶液中，搅拌下加入适量的乙醚溶液，抽滤得到粗品，用乙醚洗涤，干燥即得化合物35。
生物活性测试部分
本发明提供的化合物对细胞周期检测点激酶1(chk1)激酶的抑制活性测试。
仪器：酶标仪envisiontm(perkinelmer,usa)；
材料：人源重组chk1，购自sinobiological公司，融合gst的chk1蛋白片断(aa1-476)；
样品处理：样品用dmso溶解，低温保存，dmso在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
实验步骤：chk1和底物用htrf激酶缓冲溶液(1xkinasebuffer,5mmmgcl2,1mmdtt)稀释。将4μl酶、4μl底物和2μl不同浓度的待测化合物分别加入384反应板中(proxiplatetm-384plus,perkinelmer)，具体反应体系为2％dmso，0.075ng/μlchk1，1μmstk1，50μmatp。室温孵育1个小时后，加入抗体进行检测。同时设以dmso替代待测化合物的溶剂对照组、空白对照组，每个样品每个浓度设3个复孔。初筛选择单一浓度条件下，例如10μm，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即ic50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为graphpadprism5，拟合所使用的模型为sigmoidaldose-response(varibleslope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。测试结果如表4所示。
表4代表性化合物对chk1激酶的ic50(nm)
a<100nm；100nm<b<500nm；
表4的结果表明大部分化合物都表现出良好的chk1抑制活性，说明这类化合物具有治疗癌症的潜力。
本发明提供的化合物对细胞增殖抑制活性。
细胞株：mv-4-11(人急性髓性单核细胞白血病)，z-138(人套细胞株淋巴瘤细胞),mm1s(人骨髓瘤细胞)
实验步骤：运用mts法检测细胞存活率。将生长在对数生长期的细胞，吸取培养基，轻轻吹打，计数。以相应的细胞密度接种在96孔板中90ul，加10μl化合物，每一化合物设浓度梯度，每一浓度设三复孔，每一浓度分别加入到对应孔中，dmso的终浓度是0.2％，于含有4.5％co2的37℃培养箱内培养3天，加入20μl的mts。37℃孵育3小时后，使用spectramax340测490nm(l1)光吸收值，参考波长690nm(l2)，将(l1-l2)值对抑制剂不同浓度作图，百分比活性(％)＝化合物od值-blankod值/dmsood值-blankod*100％用graphpad，经公式拟合得ic50。结果如表5和表6。
表5化合物8和化合物24对各种肿瘤细胞的增殖抑制活性
表6化合物23对各种肿瘤细胞的增殖抑制活性
表5和表6的结果表明，所选的代表性化合物对mv-4-11，z-138，mm1s细胞株具有明显的增殖抑制活性。