酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及烟粉虱酚糖酰基转移酶基因、其特异性dsrna以及转基因表达特异性dsrna的植物在防控烟粉虱中的应用。
背景技术：
：烟粉虱是世界性的入侵害虫，其寄主非常广泛，包括600余种作物和观赏植物，烟粉虱通过取食韧皮部汁液、分泌蜜露和传播多种植物病毒等方式对世界范围内的农作物造成严重危害。长期以来烟粉虱的防治主要依赖于化学杀虫剂，然而，化学杀虫剂的大量使用导致烟粉虱已经对多种杀虫剂产生了抗药性，同时长期使用杀虫剂导致了非靶标生物的存活率下降、环境污染等一系列问题，对人类的食品安全造成严重威胁。因此，人们迫切需要高效、低毒、靶标特异性的策略来防治害虫，从而实现农业的可持续发展。rna干扰(rnai)是由双链rna(double-strandedrna,简称dsrna)介导的基因沉默现象，自rna干扰现象在秀丽隐杆线虫中被发现以来，该技术被广泛应用于基因功能研究，并于2006年获得了诺贝尔奖。2007年naturebiotechnology杂志发表了两篇利用转基因技术特异性表达dsrna用来防治玉米根叶甲和棉铃虫的文章，为农作物的害虫防治提供了新的策略。rna干扰的方法防治害虫具有对环境友好、杀虫专一性强、对非靶标生物无害等优点。筛选出对目标害虫具有高致死作用的靶基因是rna干扰方法应用于害虫防治的先决条件。酚糖是植物中含量最丰富的一类次生代谢产物，对多种食草性生物具有毒性。植物中的酚糖能够严重影响昆虫的生长发育和取食行为，甚至造成昆虫的死亡。烟粉虱通过水平基因转移的方式获得了植物的酚糖酰基转移酶(btpmat1)基因，并可通过该基因代谢酚糖，从而克服植物中酚糖对烟粉虱的毒害作用。因此，以烟粉虱的btpmat1为靶标，通过转基因等方法抑制该基因在烟粉虱中的表达，增加烟粉虱对酚糖的敏感性，能够实现对烟粉虱的有效防治，具有极其重要的商业价值和广泛的应用前景。技术实现要素：针对现有化学防治技术中存在的不足，本发明提供一种烟粉虱酚糖酰基转移酶btpmat1基因序列，及其dsrna在防治烟粉虱中的应用，相比于其他化学杀虫剂，具有高效低毒，对环境友好等优点。本发明提出植物次生代谢产物kaempferol3-o-glucoside、kaempferol7-o-glucoside,和rhaponiticin能够防治烟粉虱。本发明提供烟粉虱酚糖酰基转移酶btpmat1基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。其获得方法如下：(1)以烟粉虱的基因组数据为基础，筛选其中的水平转移基因（hgt），得到一个预测的植物源酚糖酰基转移酶基因；(2)将该预测基因与烟粉虱的转录组数据进行比对，校正该基因序列；(3)设计特异性的引物克隆得到烟粉虱的btpmat1基因全长序列。该序列全长1515bp，包含一个1386bp的开放阅读框(orf)，编码461个氨基酸的蛋白，其编码蛋白序列如seqidno.2所示，还包括31bp的5′-utr和92bp的3′-utr。本发明还提供了烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的dsrna，包含酚糖酰基转移酶基因的片段(核苷酸序列如seqidno.3所示)。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列seqidno.1设计含有t7启动子的特异性引物；(2)以烟粉虱成虫的cdna为模板，用特异性引物进行pcr扩增；(3)回收pcr产物，通过t7ribomaxtmexpressrnaisystem(promega,madison,wi,usa)试剂盒合成dsrna。本发明还提供了表达烟粉虱酚糖酰基转移酶基因dsrna片段(核苷酸序列如seqidno.3所示)的转基因植物。所述植物优选为单子叶，或双子叶植物，优选为农作物，更优选为番茄、烟草棉花、木薯、黄瓜等。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列seqidno.1设计含有限制性酶切位点的特异性引物；(2)以烟粉虱成虫的cdna为模板，用上述特异性引物进行pcr扩增；(3)利用特异性的核酸内切酶切割pcr产物和植物rnai表达载体；(4)用t4连接酶将pcr产物连接到植物rnai表达载体上；(5)将构建好的rnai表达载体转入农杆菌中；(6)利用上述农杆菌侵染番茄，构建表达dsbtpmat1的转基因番茄。本发明还提供含有序列如seqidno.1所示编码基因的表达盒、表达载体、重组细胞系。本发明的目的在于提供了上述的序列、各种载体、转基因植物等应用于烟粉虱的防治。目前人们主要是利用化学农药防治烟粉虱，一方面烟粉虱已经对多种化学农药产生了很高的抗药性，另一方面也容易对环境造成污染。酚糖是植物中广泛存在的次生代谢产物，利用其对食草性害虫具有毒性的特点，可以实现害虫的绿色防控。本发明公开了烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白和其编码基因btpmat1，及其双链ran(dsrna)的应用，dsrna可以特异性沉默btpmat1基因使烟粉虱对酚糖苷类植物次生代谢产物更加敏感，同时，转基因植物表达dsrna能够特异性沉默烟粉虱btpmat1基因，并导致烟粉虱的死亡。本发明还公开了btpmat1基因片段，核苷酸序列如seqidno.3所示，用于dsrna的合成和转基因植物表达载体构建，该dsrna的摄入能够使酚类物质对烟粉虱成虫致死作用增强，取食表达dsbtpmat1的转基因番茄能够导致烟粉虱成虫的死亡。本发明通过rnai技术干扰烟粉虱酚糖酰基转移酶基因，增加了烟粉虱对酚糖类代谢产物的敏感性，实现了对烟粉虱的有效防控。本发明为rna干扰和转基因的方式防治田间烟粉虱提供了新的靶标，具有明显的商业价值和广泛的应用前景，其特点在于(1)靶标基因仅存在于烟粉虱中，具有高度的害虫专一性，对非靶标生物安全；(2)利用植物的次生代谢产物防治烟粉虱，对环境无污染。附图说明图1：酚糖kaempferol3-o-glucoside、kaempferol7-o-glucoside,和rhaponiticin对烟粉虱成虫的致死作用。*表示饲喂液中添加酚糖的处理组烟粉虱与不添加酚糖的对照组烟粉虱的成虫死亡率存在显著性差异(p>0.05;holm-sidak’stest;n=3)。图2：在烟粉虱取食的饲喂液中添加seqidno.3合成的dsrna，待烟粉虱取食48h后，利用qpcr的方法测定烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的表达量，以dsegfp处理的烟粉虱为对照，确定dsrna对靶标基因的干扰效率(a)；干扰烟粉虱酚糖酰基转移酶48h后，测定kaempferol3-o-glucoside(b)、kaempferol7-o-glucoside(c),和rhaponiticin(d)对烟粉虱成虫的致死作用。dsegfp的为实验对照处理，不同的字母表示不同处理间存在显著性差异(p>0.05;holm-sidak’stest;n=3)。图3：烟粉虱取食转基因番茄1d，3d，5d，7d时，利用qpcr的方法测定烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的表达量，以非转基因番茄为对照，确定转基因番茄对烟粉虱靶标基因的干扰效率。以取食非转基因番茄的烟粉虱为对照，不同的字母表示不同处理间存在显著性差异(p>0.05;holm-sidak’stest;n=3)。图4：转基因番茄对烟粉虱的致死作用。比较取食转基因番茄和非转基因番茄7d后，烟粉虱的死亡率，不同的字母表示取食转基因番茄的烟粉虱与对照组烟粉虱的成虫死亡率存在显著性差异(p>0.05;holm-sidak’stest;n=5)。图5：转基因番茄对桃蚜(a)和二斑叶螨(b)的影响，相同的字母表示节肢动物取食转基因番茄与对照处理间不存在显著性差异(p>0.05;holm-sidak’stest;n=5)。具体实施方式昆虫种群：(1)烟粉虱种群：烟粉虱于2009年采集自中国农业科学院蔬菜花卉研究所的一品红上，而后在棉花上持续饲养。(2)桃蚜种群：桃蚜于2017年在采集自福建省宁德市赤溪镇的小油菜上，随后在实验室的萝卜苗上持续饲养。(3)二斑叶螨种群：二斑叶螨于2009年采集自山东省泰安市的苹果上，然后在豌豆苗上持续饲养。引物合成：本发明用的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。表1引物primersprimersequences(5′-3′)cbtpmat1-facagcgttctccgacttttagcbtpmat1-ractccttttttcctctttgccdsbtpmat1-ftaatacgactcactatagggagatctgcagacatggagacgacdsbtpmat1-rtaatacgactcactatagggagatacagccaaacacgcagttcsense-btpmat1-fccctcgagtctgcagacatggagacgacsense-btpmat1-rgaagatcttacagccaaacacgcagttcanti-sense-btpmat1-fgcgtcgactctgcagacatggagacgacanti-sense-btpmat1-rcgggatcctacagccaaacacgcagttcdbtpmat1-ftctgcagacatggagacgacdbtpmat1-raacgaatagagtagtacggtc实施例1：烟粉虱酚糖酰基转移酶btpmat1的克隆(1)烟粉虱btpmat1基因的发现在烟粉虱全基因组和转录组测序的基础上，分析烟粉虱中水平转移基因，发现烟粉虱中存在一个植物源的水平转移基因——酚糖酰基转移酶btpmat1。利用生物信息学方法将预测的btpmat1基因的核苷酸序列与转录组序列进行比对，对btpmat1基因进行校正。(2)克隆烟粉虱btpmat1基因序列基于校正后的btpmat1基因序列，利用primerpremier6.0软件设计基因全长特异性引物cbtpmat1-f和cbtpmat1-r。收集烟粉虱成虫50头，利用trizol提取烟粉虱成虫rna，并通过primescript™ii第一链cdna试剂盒合成烟粉虱成虫cdna。以烟粉虱的cdna为模板，cbtpmat1-f和cbtpmat1-r为引物，通过pcr克隆烟粉虱的btpmat1基因。回收、纯化pcr产物并连接转化至大肠杆菌中，进行测序，得到烟粉虱btpmat1基因全长序列如seqidno.1所示。实施例2：烟粉虱btpmat1基因的dsrna制备根据克隆得到的烟粉虱btpmat1基因的全长序列，设计含有t7启动子的特异性引物dsbtpmat1-f和dsbtpmat1-r。以烟粉虱成虫cdna为模板，用上述含有t7启动子的特异性引物进行pcr扩增。通过胶回收的方式收集pcr产物，并通过t7ribomaxtmexpressrnaisystem(promega,madison,wi,usa)试剂盒合成烟粉虱btpmat1基因特异性的dsrna。实施例3：酚糖对烟粉虱的致死作用利用饲喂小袋的方法测定酚糖类植物次生代谢产物对烟粉虱的致死作用。生测装置由两通玻璃管(内径，20mm；长，50mm)，黑色棉塞，黑色管套和封口膜制成的双层饲喂小袋组成。添加0.2ml含有酚糖的饲喂液于生测装置的饲喂小袋中，用饲喂小袋封闭玻璃管的一端，向其中转移50头初羽化的烟粉虱成虫，用棉塞封闭玻璃管的另一端，然后用黑色管套覆盖玻璃管。将生测装置放置于25°c，湿度为80%的光照培养箱中，饲喂小袋一侧向上放置，朝向光源，96小时后测定烟粉虱成虫的死亡率。以不添加酚糖的饲喂液为对照，明确酚糖对烟粉虱的致死作用。结果如图1所示，酚糖kaempferol3-o-glucoside、kaempferol7-o-glucoside,和rhaponiticin能够显著增加烟粉虱成虫的死亡率，kaempferol3-o-glucoside对烟粉虱的致死效果是对照组的7.3倍，kaempferol7-o-glucoside对烟粉虱的致死效果是对照组的8.7倍，kaempferol7-o-glucoside对烟粉虱的致死效果是对照组的4.3倍。实施例4：取食btpmat1基因的dsrna导致烟粉虱成虫对酚糖的敏感性增加将初羽化烟粉虱成虫50头置于上述的生测装置中，在饲喂液中添加100μg(50μl)合成的dsrna，以dsegfp为对照。待烟粉虱取食48h后，提取成虫的rna，通过qpcr测定btpmat1基因的表达量。结果如图2a所示，取食合成的dsrna能够显著降低烟粉虱成虫btpmat1基因的表达水平，dsrna对烟粉虱btpmat1基因的沉默效率达到50%。烟粉虱成虫取食dsrna饲喂液48h后，将烟粉虱转移到新的生测装置内，以dsegfp处理的烟粉虱为对照，测定干扰btpmat1基因后，酚糖对烟粉虱成虫的致死作用。结果表明，干扰btpmat1基因，烟粉虱成虫对酚糖kaempferol3-o-glucoside(图2b)、kaempferol7-o-glucoside(图2c),和rhaponiticin(图2d)的敏感性显著增强，干扰btpmat1基因能够使kaempferol3-o-glucoside对烟粉虱的致死效果增加0.7倍，kaempferol7-o-glucoside对烟粉虱的致死效果增加0.9倍，rhaponiticin对烟粉虱的致死效果增加0.7倍。实施例5：取食表达btpmat1基因dsrna的转基因番茄导致烟粉虱成虫死亡基于rnai载体pcambia-rnai的序列信息，利用primerpremier6.0设计表达btpmat1基因dsrna（核苷酸序列如seqidno.3所示）的特异性引物sense-btpmat1-f、sense-btpmat1-r、anti-sense-btpmat1-f和anti-sense-btpmat1-r。以烟粉虱成虫cdna为模板，sense-btpmat1-f和sense-btpmat1-r为引物，克隆表达dsrna的上游片段，用特异性内切酶xhoi和bglii切割pcr产物和pcambia-rnai载体，回收目的片段，并用连接酶将dsrna的上游片段连接到pcambia-rnai载体上，得到重组载体pcambia-rnai-sense-btpmat1。以烟粉虱成虫cdna为模板，anti-sense-btpmat1-f和anti-sense-btpmat1-r为引物，克隆表达dsrna的下游片段，用特异性内切酶bamhi和salⅰ切割pcr产物和pcambia-rnai-sense-btpmat1载体，回收目的片段，并用连接酶将dsrna的下游片段连接到pcambia-rnai-sense-btpmat1上，得到重组载体pcambia-rnai-btpmat1。利用农杆菌转化体系，将重组的pcambia-rnai-btpmat1质粒转化到番茄中。待番茄苗长出7片真叶，采集一片番茄的叶片，利用植物基因组dna提取试剂盒（tiangen）提取番茄叶片的dna，用检测引物dbtpmat1-f和dbtpmat1-r对提取的dna进行pcr检测，筛选阳性转基因番茄，用于烟粉虱防治的研究。将20头烟粉虱成虫转移到夹着转基因番茄叶片的微虫笼(直径，3cm；高，2.5cm)中，以非转基因番茄为对照，通过qpcr技术测定烟粉虱btpmat1基因的表达量，明确转基因植物对烟粉虱btpmat1基因的干扰效率，每两天测定一次rnai干扰效率，持续7天。结果如图3所示，转基因番茄能够持续高效的抑制烟粉虱btpmat1基因的表达，取食转基因植物1天，烟粉虱btpmat1基因的表达降低了70%，取食转基因植物3-7天烟粉虱btpmat1基因的表达降低了90%以上。通过模拟田间试验明确转基因番茄对烟粉虱的防治效果。转移约500头烟粉虱成虫至80目纱布包裹的笼子(长60cm，宽40cm，高80cm)中，在笼子中放1株转基因番茄，在烟粉虱取食7天后计算烟粉虱的死亡率，以非转基因番茄为对照，明确转基因番茄对烟粉虱的致死效果，每个处理重复5次。结果如图4所示，取食转基因番茄能够导致90%以上的烟粉虱成虫死亡。实施例6：表达btpmat1基因dsrna的转基因番茄对非靶标节肢动物的影响选择半翅目昆虫桃蚜和蛛形纲害虫二斑叶螨进行模拟田间试验，明确转基因番茄对非靶标节肢动物的影响。转移约150头桃蚜至80目纱布包裹的笼子(长60cm，宽40cm，高80cm)中，在笼子中放1株转基因番茄，在蚜虫取食7天后统计蚜虫的数量，以非转基因番茄为对照，明确转基因番茄对蚜虫的影响，每个处理重复5次。转移约200头二斑叶螨至80目纱布包裹的笼子(长60cm，宽40cm，高80cm)中，在笼子中放1株转基因番茄，在二斑叶螨取食7天后计算二斑叶螨的死亡率，以非转基因番茄为对照，明确转基因番茄对二斑叶螨的影响，每个处理重复5次。结果表明转基因番茄对非靶标节肢动物桃蚜（图5a）种群的数量变化的影响不显著，并且转基因番茄对二斑叶螨（图2b）不存在显著的致死作用。<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>酚糖酰基转移酶基因btpmat1、及其特异性dsrna在烟粉虱防控中的应用<160>13<210>1<211>1515<212>dna<213>烟粉虱<220><221>起始密码子<222>(38)..(40)<220><221>终止密码子<222>(1421)..(1423)<400>1acagcgttctccgacttttagctttcaacgagcagtgatgtcgatatcgagctcagtggccgtactaaacgtagttcaagtttctccaccaaccgctccggtgaacaacgcctttcaagatcgcatcagtctcactcatttcgacttattggcccttcgcgctccgcccaatcagcgtctctttttttacgagacgcatcttcctatctctgcttttgcagagacagtgattccaaaactccgtgattccctttctctcacccttcaaaactttcgacctttggcggggactttgatctggtcgctgcactccgacgagccctacatccgtattaaggacgacgattcagtccctcttacgatagccgaaacggatgccgacccccaaaaattattcgacgatcccttccaacaagaaacagacctccagcaattgctgccaccactgcgagtttcagaaacggaagcatcactgttagcgttacagatcacactgttcccgagtggcgatatctgtctcggcatcaccttccaccacgctgcgcaagatggggcatcattggctcttttcctcaaatcgtgggctcacatctgcagacatggagacgacccaccgttacctcaaaatttgataccgatctttgaccgtgactttatcgacgatccgaaaaatatcaaacaactttttttggatcacttattaacacccctgacaccaggcggacctagaaataggagcgtcaaacctatggaaaagccatttaatgataggatgcacggatcatttagattaacagtcgacgacatcgaaaacctccggaggcgaataacctctttgcaggttcaaaatacctcccaagagccgccagtcaggatgtctacagttgtagttacttgtgcatacgtgttgacatgctttgttaaggccgggttgacaaagaagcacgttcggtttattttgcctgctgatcttaggaagcgattacagccccccgtgcctgacaattactacgggaactgcgtgtttggctgtactgttgatatgtctagtgatgatttagctggacaagacggtctagtagtagcagccaaaactatcagctccgtagtgagcgaattggatgcaaatgatcatcggacgttctttgagaattttctgttgaataacacgatatcccaggaggaaacaaaagtgggtgtgggagggtcaatttatttcagtcttgatgaaaaggattttggctggggtggaccaaaacatttgaagaatgtccctccgtggcctaaccacatttatttagcggagaggcgggatggtgataaaggtgtggacttttgcttgatgctagcgaaacaggaaatggcagaattcgagtcaaagttccttgatgatcttaagttattggaaaagcggagctgctgacagctctgggtgagactttaaacttttttcgatcgcgtattctaagtctccaaaaacaatattttccttttggcaaagaggaaaaaaggagt<210>2<211>461<212>氨基酸<213>烟粉虱<400>2metserileserserservalalavalleuasnvalvalglnvalserproprothralaprovalasnasnalapheglnaspargileserleuthrhispheaspleuleualaleuargalaproproasnglnargleuphephetyrgluthrhisleuproileseralaphealagluthrvalileprolysleuargaspserleuserleuthrleuglnasnpheargproleualaglythrleuiletrpserleuhisseraspgluprotyrileargilelysaspaspaspservalproleuthrilealagluthraspalaaspproglnlysleupheaspasppropheglnglngluthraspleuglnglnleuleuproproleuargvalsergluthrglualaserleuleualaleuglnilethrleupheproserglyaspilecysleuglyilethrphehishisalaalaglnaspglyalaserleualaleupheleulyssertrpalahisilecysarghisglyaspaspproproleuproglnasnleuileproilepheaspargasppheileaspaspprolysasnilelysglnleupheleuasphisleuleuthrproleuthrproglyglyproargasnargservallysprometglulyspropheasnaspargmethisglyserpheargleuthrvalaspaspilegluasnleuargargargilethrserleuglnvalglnasnthrserglngluproprovalargmetserthrvalvalvalthrcysalatyrvalleuthrcysphevallysalaglyleuthrlyslyshisvalargpheileleuproalaaspleuarglysargleuglnproprovalproaspasntyrtyrglyasncysvalpheglycysthrvalaspmetserseraspaspleualaglyglnaspglyleuvalvalalaalalysthrileserservalvalsergluleuaspalaasnasphisargthrphephegluasnpheleuleuasnasnthrileserglnglugluthrlysvalglyvalglyglyseriletyrpheserleuaspglulysasppheglytrpglyglyprolyshisleulysasnvalproprotrpproasnhisiletyrleualagluargargaspglyasplysglyvalaspphecysleumetleualalysglnglumetalagluphegluserlyspheleuaspa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