一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法与流程

本发明属于苏云金杆菌技术领域，具体涉及一种筛选抗蚜cry蛋白的方法。

背景技术：

苏云金杆菌(bacillusthuringiensis,bt)制剂是迄今最为成功的微生物杀虫剂，已被广泛应用于农林卫生害虫的防治。苏云金杆菌产生的最主要杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白(cry蛋白)，其编码基因已经被广泛应用于构建抗虫转基因植物，已成为抗鳞翅目和鞘翅目害虫的常规手段。但是，仍然有不少重要的农林卫生害虫，现有苏云金杆菌制剂及其cry蛋白对其防效低下。尤其是蚜虫这类体型很小的刺吸式昆虫，其能够通过取食、蜜露污染、传播病毒等方式危害众多植物，造成植株生长迟缓、萎蔫，并诱发多种病毒病、黑霉病等，严重时可导致植株死亡，是重要的农林业害虫。当下，对蚜虫具有高效的cry蛋白几乎没有，成为限制苏云金杆菌行业进一步做大做强的一大难题。

随着大规模分离苏云金杆菌尤其是高通量测定样品中的苏云金杆菌基因组序列的突飞猛进，当下已经实现了新型cry蛋白的大规模发掘，一个研究团队一年的工作，即可超过过去三五十年全球所发掘的新型cry蛋白的总和。苏云金杆菌领域，已经走到了需要对海量cry蛋白进行系统的杀虫活性测定的阶段了，尤其是针对蚜虫进行筛选获得抗蚜cry蛋白，成为一项巨大的挑战。

目前，针对蚜虫筛选抗蚜蛋白的生物测定方法有膜囊法、叶片浸润法和转基因植物法三种。叶片浸润法(植物叶片表面浸润蛋白后接上蚜虫在叶片上取食)，由于用于生测的蛋白只能喷洒或浸泡在植物表面，而作为刺吸性昆虫的蚜虫它的进食方法决定了它对叶表面的蛋白无法有效摄入；膜囊法，无法确认蚜虫究竟取食了多少；转基因法，由于cry基因在植株韧皮部中的表达量不好定量，无法确定蚜虫取食了多少。而且人们在生物测定中需要考虑很多因素如蚜虫本身的生殖、生存潜能等生物学特性，还与温度、湿度和光照等主要环境因子等有关。因此，传统的筛选抗蚜cry蛋白的方法存在着共同缺陷：不同实验室测定的数据之间差异极大导致检测结果不精准，无法大批量测定导致不能实现大规模筛选。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种精准的抗蚜cry蛋白筛选方法，本发明提供的筛选方法检测结果精准，能够大批量测定，进而实现大规模筛选。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；

本发明提供了一种筛选抗蚜cry蛋白的方法，包括：

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白混合、静置反应，得到混合酶液，将所述混合酶液与底物混合、反应后，得到检测液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到检测值；

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂混合、静置反应，得到混合抑制剂酶液，将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后，得到抑制剂对照液，检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值，得到抑制检测值；

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂混合、静置反应，得到混合激活剂酶液，将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后，得到激活剂对照液，检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值，得到激活检测值；

当所述检测值大于等于激活检测值，或所述检测值小于等于抑制检测值时，所述苏云金杆菌cry蛋白为抗蚜cry蛋白；

所述底物包括z-arg-arg-pna和/或bsa；

所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。

优选的，所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白体积比为9:4:1；

所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂体积比为9:4:1；

所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂体积比为9:4:1。

优选的，所述将混合酶液与底物混合后，得到混合液，所述混合液中底物的浓度为2μg/ml；所述将混合抑制剂酶液与底物混合后，得到抑制剂混合液，所述抑制剂混合液中底物的浓度为2μg/ml；所述将混合激活剂酶液与底物混合后，得到激活剂混合液，所述激活剂混合液中底物的浓度为2μg/ml。

优选的，所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度为50mm/l；

所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为2.5mm/l；

所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度2.5mm/l。

优选的，所述反应缓冲液的ph值为5.5。

优选的，所述cathepsinb酶活激活剂包括谷胱甘肽。

优选的，所述cathepsinb酶活抑制剂包括e-64。

优选的，所述检测的温度为37℃。

优选的，所述静置反应的温度为37℃；所述静置反应的时间为5min；所述反应的时间为30min。

优选的，所述蚜虫cathepsinb蛋白酶的氨基酸序列的登录号为q64g01。

本发明提供了一种筛选抗蚜cry蛋白的方法，包括将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白混合、静置反应，得到混合酶液，将所述混合酶液与底物混合、反应后，得到检测液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到检测值；将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂混合、静置反应，得到混合抑制剂酶液，将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后，得到抑制剂对照液，检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值，得到抑制检测值；将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂混合、静置反应，得到混合激活剂酶液，将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后，得到激活剂对照液，检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值，得到激活检测值；当所述检测值大于等于激活检测值，或所述检测值小于等于抑制检测值时，所述苏云金杆菌cry蛋白为抗蚜cry蛋白；所述底物包括z-arg-arg-pna和/或bsa；所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。通过测定cry蛋白对蚜虫细胞凋亡的关键蛋白cathepsinb酶活是否影响及影响程度，进一步确定cry是否抗蚜及抗蚜活性高低。利用本发明提供的的筛选方法检测结果精准，能够大批量测定，进而实现大规模筛选。

附图说明

图1为在大肠杆菌中表达桃蚜cathepsin-b纯化结果；

图2为不同处理后的cathepsinb的酶活。

具体实施方式

本发明提供了一种筛选抗蚜cry蛋白的方法，包括：

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白混合、静置反应，得到混合酶液，将所述混合酶液与底物混合、反应后，得到检测液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到检测值；

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂混合、静置反应，得到混合抑制剂酶液，将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后，得到抑制剂对照液，检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值，得到抑制检测值；

将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂混合、静置反应，得到混合激活剂酶液，将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后，得到激活剂对照液，检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值，得到激活检测值；

当所述检测值大于等于激活检测值，或所述检测值小于等于抑制检测值时，所述苏云金杆菌cry蛋白为抗蚜cry蛋白；

所述底物包括z-arg-arg-pna和/或bsa；

所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。

本发明将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白混合、静置反应，得到混合酶液，将所述混合酶液与底物混合、反应后，得到检测液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到检测值。在本发明中，所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和苏云金杆菌cry蛋白体积比优选为9:4:1；将所述混合酶液与底物混合后，得到混合液，所述混合液中底物的浓度优选为2μg/ml；所述静置反应的温度优选为37℃；所述静置反应的时间优选为5min；所述反应的时间优选为30min；所述检测的温度优选为37℃；所述反应缓冲液的ph值优选为5.5。

在本发明中，所述底物包括z-arg-arg-pna和/或bsa；所述反应缓冲液的组分优选包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。在本发明中，所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mm/l；所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mm/l；所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mm/l。

在本发明中，所述蚜虫cathepsinb蛋白酶的氨基酸序列的登录号优选为q64g01，所述蚜虫cathepsinb蛋白酶的制备方法优选包括将蚜虫cathepsinb基因克隆表达，得到混合物；将混合物进行亲和层析纯化，得到蚜虫cathepsinb蛋白酶，更优选包括将蚜虫cathepsinb基因去掉其n端20个氨基酸，进行克隆表达得到混合物；将所述混合物进行亲和层析纯化，得到蚜虫cathepsinb蛋白酶；所述克隆表达的载体优选为pet-30a+，所述克隆表达的基因工程菌优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌bl21(de3)；所述亲和层析纯化优选为ni-ntaresin亲和层析纯化。

在本发明中，所述苏云金杆菌cry蛋白的制备方法优选包括包括将苏云金杆菌cry基因克隆表达，得到混合物；将混合物进行亲和层析纯化，得到苏云金杆菌cry蛋白。本发明对苏云金杆菌cry基因没有特殊要求，采用本领域常规苏云金杆菌cry基因即可。

本发明将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂混合、静置反应，得到混合抑制剂酶液，将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后，得到抑制剂对照液，检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值，得到抑制检测值。在本发明中，所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活抑制剂体积比优选为9:4:1；所述将混合抑制剂酶液与底物混合后，得到抑制剂混合液，所述抑制剂混合液中底物的浓度优选为2μg/ml；所述cathepsinb酶活抑制剂优选包括e-64，更优选为e-64。所述静置反应的温度优选为37℃；所述反应的时间优选为30min；所述检测的温度优选为37℃；所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mm/l；所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mm/l；所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mm/l；所述反应缓冲液的ph值优选为5.5。

本发明将反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂混合、室温静置反应，得到混合激活剂酶液，将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后，得到激活剂对照液，检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值，得到激活检测值。所述反应缓冲液、蚜虫cathepsinb蛋白酶和cathepsinb酶活激活剂体积比优选为9:4:1；所述将混合激活剂酶液与底物混合后，得到激活剂混合液，所述激活剂混合液中底物的浓度优选为2μg/ml；所述cathepsinb酶活激活剂优选包括谷胱甘肽。所述静置反应的温度优选为37℃；所述反应的时间优选为30min；所述检测的温度优选为37℃；所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mm/l；所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mm/l；所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mm/l；所述反应缓冲液的ph值优选为5.5。

下面结合实施例对本发明提供的一种筛选抗蚜cry蛋白的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)制备蚜虫cathepsinb：

在大肠杆菌中表达桃蚜cathepsinb，亲和层析纯化获得。所述桃蚜cathepsinb为ncbi网上登录号为q64g01的桃蚜基因组推导的蛋白组中获取其氨基酸序列，经signal5.0软件分析发现桃蚜cathepsin-b其n端20个氨基酸为信号肽，将这20个氨基酸去除后，剩余的氨基酸序列推导出dna序列，再根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化后合成基因，插入到表达载体pet-30a+，随后导入大肠杆菌bl21(de3)，经发酵培养和加入iptg诱导表达后，采用ni-ntaresin进行亲和层析纯化，如图1所示为在大肠杆菌中表达桃蚜cathepsin-b并纯化的电泳图。

(2)制备苏云金杆菌cry：

从网上获得多种cry蛋白的氨基酸序列，其余处理与步骤(1)相同，通过同源建模构建其空间模型预测其活性区，然后合成其对应的编码dna序列，采用常规的基因克隆表达和纯化方法，在大肠杆菌中获得表达，然后经亲和层析纯化获得。

(3)将0.9ml反应缓冲液、0.4ml蚜虫cathepsinb蛋白酶和0.1ml苏云金杆菌cry蛋白混合、静置反应5min，得到混合酶液，将所述混合酶液与0.1ml底物混合，分别以z-arg-arg-pna和bsa为底物，得到底物浓度为2μg/ml的混合液，37℃下反应30min，得到检测液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到检测值；

(4)将0.9ml反应缓冲液、0.4ml蚜虫cathepsinb蛋白酶和0.1mlcathepsinb酶活抑制剂混合、静置反应5min，得到混合抑制剂酶液，将所述混合抑制剂酶液与0.1ml底物混合，得到底物浓度为2μg/ml的抑制剂混合液，37℃下反应30min，得到抑制剂对照液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到抑制检测值；

(5)将0.9ml反应缓冲液、0.4ml蚜虫cathepsinb蛋白酶和0.1mlcathepsinb酶活激活剂混合、静置反应5min，得到混合激活剂酶液，将所述混合激活剂酶液与0.1ml底物混合，得到底物浓度为2μg/ml的激活剂混合液，37℃下反应30min，得到激活剂对照液，检测所述检测液在405nm下的吸光度值，得到激活检测值；

反应缓冲液包括50mm/l乙酸钠、2.5mm/l二硫苏糖醇(dtt)和2.5mm/l乙二胺四乙酸(edta)，ph为5.5。

试验结果如图2所示，cry41蛋白显著激活了cathepsinb的酶活。cry41蛋白经测定发现其对桃蚜具有中等毒力，其lc50＝32.7μg/ml，是目前抗蚜活性最高的cry蛋白。

本发明提供了一种筛选抗蚜cry蛋白的方法，本发明提供的筛选方法检测结果精准，能够大批量测定，进而实现大规模筛选。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。