用于同步检测NRAS基因的第2、3、4号外显子基因突变的方法与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其是涉及用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的引物组及检测方法。
背景技术：
：神经母细胞瘤大鼠肉瘤(neuroblastomaratsarcoma，nras)基因全长85kb，位于1号染色体，编码含495个氨基酸的蛋白质。属于具有gtp酶活性的ras家族成员，是细胞增殖和分化中的关键调节因子。nras常见突变位点位于该基因2、3、4号外显子上。大量转移性结肠癌研究表明nras突变与较短的整体生存期显著相关，且其pfs(progression-free-survival，无进展生存期)有缩短的趋势。临床研究表明，nras基因突变的转移性结直肠患者对西妥昔、帕尼单抗等egfr靶向治疗药物产生耐药，根据检测结果决定是否使用egfr靶向药物作为临床治疗措施。目前，nras基因检测已被欧美地区列为大肠癌患者内科治疗前必做的常规检查。nras基因突变检测已被美国癌症综合网络(nccn)的《nccn结肠癌临床实践指南》与《nccn直肠癌临床实践指南》列为临床用药必检项目。2013年欧洲癌症大会上公布的fire-3研究数据显示，ras野生型(指nras和kras外显子2、3、4无突变)转移性结直肠癌患者中，使用西妥昔单抗+folfir(5-氟尿嘧啶(5-fu)/亚叶酸钙(lv)+伊立替康)比使用贝伐珠单抗+folfir，中位总生存期(os)显著延长7.5个月，而在ras突变型(指nras和kras外显子2、3、4中至少一个基因突变)患者中，两组的中位生存期(os)相似。2018jsmo临床指南：结直肠癌治疗的分子检测(第3版)几个随机临床研究表明，抗egfr单克隆抗体治疗不能使ras突变型患者获益。pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。目前，可针对nras基因的第2、3、4号外显子分别设计pcr检测试验，以进行基因突变情况的检测。由于每个pcr反应只针对一个外显子，故检测通量较低。多重pcr是在常规pcr基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重pcr在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。技术实现要素：为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供一种同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的引物组及检测方法，有益于检测通量的提高。为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：首先提供一种用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的引物组，包含下述三对引物对中的至少两对：第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列由seqidno.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由seqidno.3所示，下游引物的核苷酸序列由seqidno.4所示；第三组引物对的上游引物的核苷酸序列由seqidno.5所示，下游引物的核苷酸序列由seqidno.6所示。本发明的引物组尤其是针nras基因的第2、3、4号外显子基因的特异性扩增所特别设计的，其中第一组引物对是用于检测nras基因第2号外显子的引物对；第二组引物对是用于检测nras基因第3号外显子的引物对；第三组引物对是用于检测nras基因第4号外显子的引物对。采用多重pcr技术可以同时同步、高效率、高特异性、准确地扩增出所述基因的特异性基因片段，再通过测序，检测其基因突变情况。该引物组优选是三组引物对同时使用，以相对最大程度的提高检测通量，也可以按照情况选取其中任意两组、有针对性的针对某个外显子基因进行扩增反应；当同时使用该三组引物对进行多重pcr扩增反应时，nras基因的第2、3、4号外显子基因同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含其中任一突变的3个外显子。通常情况下，利用上游引物seqidno.1和下游引物seqidno.2来扩增nras基因第2号外显子时，相应扩增产物的片段长度为472bp；利用上游引物seqidno.3和下游引物seqidno.4来扩增nras基因第3号外显子时，相应扩增产物的片段长度为566bp；利用上游引物seqidno.5和下游引物seqidno.6来扩增nras基因第4号外显子时，相应扩增产物的片段长度为332bp。进而对该dna片段进行切胶回收，并进行序列的测定。经过多次试验证明，本发明提供的引物对具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的结果。所述试剂盒，主要是包括本发明提供的引物组，其中单条引物的终浓度优选为20-400nm。其他pcr试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含dna聚合酶、pcr缓冲液、4种dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)的混合物和超纯水。其中dna聚合酶的用量为0.5-5u，每种dntp的终浓度均为50-500μm。dna聚合酶可以选用taq、kodfx等dna聚合酶，如此，pcr缓冲液即为与所选用dna聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。举例来说，选用kodfx这一dna聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配置上述pcr反应体系，体系中各个组分的用量可以为：dna聚合酶0.5～2μl、pcr缓冲液18～30μl、各种dntp的混合物2～12μl、3个引物对的混合物2-10μl、dna5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配置的其他体积大小。在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品dna的试剂或者专业的dna提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的dna，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有人类dna的血液、血清、血浆、细胞、组织或口腔拭子样本。在本发明提供的引物组的基础上，本发明进一步提供一种用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的检测方法，采用所述的引物对进行pcr检测。根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：(1)从待测样品中提取dna，作为扩增模板；(2)配置包含所述引物组和所述扩增模板的多重pcr反应体系；(3)对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增反应，得到pcr产物；(4)根据所述pcr产物，测定nras基因的第2、3、4号外显子基因突变。其中pcr扩增反应的最优选的反应条件为：94～98℃：1～10min；94～98℃：5～60s，50～68℃：10～120s，68～72℃：20s～4min，共25～45个循环；68～72℃：0～30min。在上述方法和条件的基础上，本发明的检测方法可以快速、有效、方便地同时同步得到待检测样品的nras基因的第2、3、4号外显子基因突变，可用于非诊断目的。根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(4)，包括：电泳检测所述pcr产物，以验证所述pcr产物的扩增片段大小；验证正确后对所述pcr产物进行序列测定，以获得所述待测样本的nras基因的第2、3、4号外显子基因突变情况。详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳检测pcr扩增的片段。同现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：(1)提高检测通量：普通pcr每个反应只针对一个外显子，而多重pcr可以同时检测3个外显子，通过一次反应可以对nras基因的第2、3、4号外显子基因突变进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。(2)降低成本：本发明可以将pcr反应体系由3个体系/程序缩减至1个体系/程序，故减少了dna聚合酶、dntp等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。附图说明图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图2是本发明一实施例提供的pcr产物序列测定结果中针对某一突变位点的部分。具体实施方式为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1设计并合成引物组，包括以下步骤：步骤1.1：基于nras基因的第2、3、4号外显子，设计特异性扩增nras基因的第2、3、4号外显子基因突变区域的上下游引物及相应测序引物。对于设计引物，采用primerquest和primerpremier5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，3对引物的退火温度基本保持一致。本实施例所提供的引物组覆盖了nras基因的第2、3、4号外显子的所有基因突变。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同位点/外显子分别设计多重pcr引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点/外显子包含情况，选取了如下述表1所示的扩增效果最佳的引物组。表1步骤1.2：合成1.1中设计好的引物组。实施例2从待测样品中提取基因组dna、肿瘤基因组dna或肿瘤游离dna(ctdna)，包括如下步骤：步骤2.1：待测样本为含有dna的新鲜外周血分离的血清\血浆样本、肿瘤组织样本、口腔拭子收集的口腔脱落细胞或新鲜外周血样本。本实施例中，样本来源为肿瘤患者和正常人体。步骤2.2：采用凯杰qiaampcirculatingnucleicacidkit(55114)，或，采用天根血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，从待测样本中提取肿瘤游离dna(ctdna)，或，肿瘤基因组dna，采用天根口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp322)，或，采用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，从待测样本中提取基因组dna，并采用np80-touch(德国implen)测定dna的浓度及纯度，保存dna。实施例3同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的多重pcr检测方法，包括以下步骤：步骤3.1：以步骤2.2中所得的dna为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，来配置多重pcr反应体系。本实施例采用东洋纺(toyobo)公司kodfx酶系(货号：kfx-101)中dna聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dntp浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重pcr扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表2所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他dna聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。表2试剂成分体积2×pcrbufferforfx25μl2mmdntp12.5μlprimermix4μlkodfx(1u/μl)1.5μldna2μl水5μl各引物等摩尔混合，引物浓度是10微摩尔；dna模板量可调整，本实施例中基因组dna可采用40ng。步骤3.2：按照下述表3所示的多重pcr反应条件，设置pcr仪器的程序。表3步骤3.3：利用程序设好的pcr仪器，对步骤3.1中配置的多重pcr反应体系，进行多重pcr扩增反应，得到pcr产物。实施例4电泳检测，包括以下步骤：步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的pcr产物，以验证pcr产物片段的大小。检测结果如图1所示，图1中所示出的883、890、djl、jyx主要用于区分不同的待测样本，图1的最右侧列展示了标尺条，标尺条左侧列展示了空白对照组的pcr产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的pcr产物的电泳结果。根据各个产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一外显子的扩增产物。比如，自上向下的3条亮带，通常是分别对应于nras-3、nras-2、nras-4号外显子的pcr扩增产物。请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的3个亮带分别对应于nras-3、nras-2、nras-4号外显子的pcr扩增产物，亮带数量与理论保持一致；3个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的pcr扩增引物组进行pcr扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。步骤4.2：验证pcr产物片段的大小正确后，可针对pcr产物进行序列测定。实施例5序列测定，包括以下步骤：步骤5.1：步骤4.2中验证pcr产物片段的大小正确后，将步骤3.3中得到的pcr产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。步骤5.2：通过chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得nras基因的第2、3、4号外显子的基因突变情况。部分测序结果如图2所示。请参考图2，图2示出了基因突变位点c.182a＞g处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知第182位处的位点为g，而不是a，即在该位点处发生基因突变。实施例6：试剂盒的配置根据上述实验结果，本实施例提供一种优选的用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：1、多重pcr引物组：第一组引物对：f上游引物(10μm)，r下游引物(10μm)；第二组引物对：f上游引物(10μm)，r下游引物(10μm)；第三组引物对：f上游引物(10μm)，r下游引物(10μm)；2、kodfx(1u/μl)；3、2×pcrbufferforfx；4、dntp(2mm)；5、样品dna提取试剂；6、样品dna采集收纳盒(如包含口腔拭子和拭子收纳盒)；7、超纯水。所述试剂在试剂盒中合理安放，再放入试剂盒的使用说明，所述使用说明包括待测样品dna的采集步骤，采集后放入收纳盒中，再进行dna提取步骤，最后按照上述的检测方法进行多重pcr扩增过程。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>北京和合医学诊断技术股份有限公司<120>用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的方法<130>ss191-211<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>1ggctcgccaattaaccctgattac24<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列()<400>2tcgctactatggcctgtgtttct23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>3gggacaaaccagataggcagaaatg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>4gttccaagtcattcccagtagcaag25<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列()<400>5gcccaggctaatctcaaactcc22<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>6ctcttgcacaaatgctgaaagctg24当前第1页12