一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，尤其是涉及一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备与应用。
背景技术：
：吡唑醚菌酯是一种由德国巴斯夫公司(basf)在1993年开发的新型嗜球果伞菌素杀菌剂，它通过防止细胞色素b和c1之间的电子转移、抑制线粒体呼吸作用并抑制atp的产生，最终导致致病性真菌无法进行正常的生理代谢而死亡。吡唑醚菌酯作为一种环保型杀菌剂，对非目标生物危害较小，但有报道发现其对蚕、斑马鱼存在一定的线粒体毒性和神经毒性，因此在农业生产中应控制吡唑醚菌酯的使用。根据最新的国家标准(gb2763-2019)，吡唑醚菌酯在谷物中的最大残留限量为0.2-1.0mg/kg，油料作物的最大残留限量为0.05-0.4mg/kg，蔬菜的最大残留限量为0.02-20mg/kg，水果中为0.05-4mg/kg，茶叶中为10mg/kg，其他类别为0.02-5mg/kg。目前，对吡唑醚菌酯残留的检测主要使用大型精密仪器如液相色谱、气相色谱-质谱联用、超高效液相色谱-质谱联用等方式；然而，这些仪器价格昂贵、样品准备过程复杂并且需要专业人员操作，因此很有必要研发一种快速、便捷、能够现场筛查吡唑醚菌酯残留的检测技术。自上世纪末，基于抗原-抗体反应的免疫分析方法被广泛应用，该方法的核心为高灵敏度高亲和性的抗体。第一代抗体为多克隆抗体，虽然制备方式简单，但抗体特异性相对较差。第二代抗体为基于杂交瘤细胞融合技术获得的高灵敏度和高亲和性的单克隆抗体。2008年，josepv.mercader等人获得了一种抗吡唑醚菌酯的高亲和力单克隆抗体，并开发了酶联免疫吸附测定方法(elisa)用于吡唑醚菌酯的检测，其检出限(lod)低于0.1μg/l(mercader,j.v.,suárez-pantaleón,c.,agulló,c.,abad-somovilla,a.,&abad-fuentes,a..productionandcharacterizationofmonoclonalantibodiesspecifictothestrobilurinpesticidepyraclostrobin[j].journalofagriculturalandfoodchemistry.2008,56(17):7682-7690.)；2011年，他们合成了多种位点异源半抗原，以筛选出亲和力更高的吡唑醚菌酯特异性单克隆抗体(mercader,j.v.,agulló,c.,abad-somovilla,a.,&abad-fuentes,a..synthesisofsite-heterologoushaptensforhigh-affinityanti-pyraclostrobinantibodygeneration[j].organic&biomolecularchemistry.2011,9(5):1443.)；2013年，他们将elisa与quechers预处理方法相结合，用于分析六种水果中吡唑醚菌酯的残留(mercader,j.v.,agulló,c.,esteve-turrillas,f.a.,abad-somovilla,a.,&abad-fuentes,a..immunoassaysforpyraclostrobinanalysisinprocessedfoodproductsusingnovelmonoclonalantibodiesandquechers-basedextracts[j].foodcontrol.2013,32(1):42-48.)。但是，杂交瘤细胞存在基因背景复杂及长期传代和复苏冻存过程出现的基因缺失/突变现象，易导致不同批次间获得的单克隆抗体特异性识别抗原的能力有差异，影响免疫快检测方法的稳定性。第三代抗体，即重组抗体的出现可以有效提高抗体识别特异性和灵敏度的稳定性；研究者可根据单克隆抗体的基因序列构建重组表达质粒并利用哺乳动物工程细胞如hek293(f)进行重组全长抗体的表达，获得的重组全长抗体具有与亲本单克隆抗体一致的识别灵敏度，在抗体基因序列已知的情况下可以不断获得稳定的重组抗体，建立更加稳定可靠的免疫快速检测方法。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种灵敏度高、特异性强的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的制备方法和稳定生产，以及该抗体的应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为seqidno:2所示。作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为seqidno:4所示。作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。本发明还公开了一种抗吡唑醚菌酯重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如seqidno:2所示。作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如seqidno:1所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如seqidno:4所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。本发明又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链igg1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的轻链蛋白。本发明将一株能稳定分泌抗吡唑醚菌酯高特异、高灵敏单抗的杂交瘤细胞株的重链和轻链可变区基因成功扩增出来、测序和合成，采用同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，并共转染至哺乳动物细胞hek293(f)中，最终获得抗吡唑醚菌酯的重组全长抗体。经elisa技术验证，该重组全长抗体与传统的抗吡唑醚菌酯天然小鼠腹水单抗相比，有一致的高灵敏度和高选择性，可以代替腹水单抗，应用于吡唑醚菌酯残留的免疫快速检测。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明公开的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株高特异性的抗吡唑醚菌酯的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组全长抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗吡唑醚菌酯抗体可大批量稳定生产，为吡唑醚菌酯残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。附图说明图1为本发明以反转录获得的cdna为模板，吡唑醚菌酯抗体重链可变区基因、轻链可变区基因pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果。图2为本发明sds-page验证全长抗体在哺乳动物细胞hek293(f)中的表达。图3为本发明抗吡唑醚菌酯重组全长抗体和小鼠腹水单抗对吡唑醚菌酯的elisa竞争曲线(基于小鼠腹水单抗和重组全长抗体的elisa检测中吡唑醚菌酯浓度从低到高依次为0.195、0.391、0.781、1.563、3.125、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00μg/l)。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围，如无特殊说明，实施例中的实验方法均为常规方法。本发明涉及的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其重链恒定区序列为小鼠igg1的重链恒定区序列，该抗体的轻链恒定区序列为小鼠κ抗体轻链恒定区序列。小鼠抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的制备1)抗吡唑醚菌酯单克隆抗体可变区基因扩增采用吡唑醚菌酯半抗原偶联载体蛋白获得人工抗原进行小鼠免疫，待尾血效价上升稳定后进行末免，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，采用竞争elisa法测试杂交瘤细胞上清，筛选制备了一株能分泌高特异性的抗吡唑醚菌酯抗体的杂交瘤细胞株c7，轻链亚型κ，重链亚类igg1，采用trizol法提取c7的总rna，经琼脂凝胶电泳鉴定rna完整性较好可满足本实验的要求。以rna为模板，利用5’race技术(smarterrace5/3’kit)反转录合成特异性cdna。其中，重链和轻链上游引物为试剂盒中自带的接头引物(5’-3’)序列为gcagtggtatcaacgcagagt，igg1亚类重链下游特异性引物为ctcaattttcttgtccaccttggt，κ亚型轻链下游特异性引物为ctcattcctgttgaagctcttgacaatggg。pcr扩增的程序为：pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果参见图1，扩增出含有vh和vl基因片段的条带。用凝胶提取试剂盒纯化，将纯化后的产物克隆到peasy-blunt载体上，转化、测序，序列经ncbi数据库blast比对后，鉴定出序列完整、亚型相符和正确表达框的vh和vl基因。抗吡唑醚菌酯抗体的重链可变区核苷酸序列为：gaagtggagctggtcgagtctgggggtggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagtctctggattcactttcagtacctatgccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggaatgggtcgcatccattcgtagtggtggtgacacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagataatgccaggaacattctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaagactaagtcatttctacgtctacggggactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(seqidno:1)功能性重链可变区全长为354个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码118个氨基酸，该有功能的重链v区基因为ighv5-6-5*01，匹配率为96.49％；j区基因为ighj2*01，匹配率为91.49％。以imgt法定义结构域，具体结构域划分为：结构域fr1cdr1fr2cdr2fr3cdr3fr4碱基序列1-7576-99100-150151-171172-285286-321322-354抗吡唑醚菌酯抗体的重链可变区氨基酸序列为：evelvesggglvkpggslklscavsgftfstyamswvrqtpekrlewvasirsggdtyypdsvkgrftisrdnarnilylqmsslrsedtamyyctrlshfyvygdywgqgttltvss(seqidno:2)抗吡唑醚菌酯抗体的轻链可变区核苷酸序列为：gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattatggcattagttttatgaactggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatccggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgatagtgcaatttatttctgtcagcaaagtaaggaggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(seqidno:3)功能性轻链可变区全长为个333个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码111个氨基酸，该有功能的轻链v区基因为igkv3-2*01，匹配率为98.97％，j区基因为igkj1*01，匹配率为100％。以imgt法定义结构域，具体结构域划分为：结构域fr1cdr1fr2cdr2fr3cdr3fr4碱基序列1-7879-108109-159160-168169-276277-303304-333抗吡唑醚菌酯抗体的轻链可变区氨基酸序列为：divltqspaslavslgqratiscrasesvdnygisfmnwyqqkpgqppklliyaasnqgsgvparfsgsgsgtdfslnihpmeeddsaiyfcqqskevpptfgggtkleik(seqidno:4)2)表达质粒的构建在鉴定出正确的抗吡唑醚菌酯抗体的重链和轻链可变区基因后，合成正确的基因序列。采用同源重组法分别将重链和轻链可变区基因连接到线性化的表达载体pcdna3.4-mouse-igg1和pcdna3.4-mouse-kappa上。其中，pcdna3.4-mouse-igg1含有小鼠igg1重链恒定区基因，pcdna3.4-mouse-kappa含有小鼠kappa轻链恒定区基因，故构建的重/轻链重组质粒上面分别包含了重链可变区及恒定区基因和轻链可变区及恒定区基因。分别将重链/轻链表达载体转化至t1感受态细胞、摇菌培养并测序。3)重组全长抗体的表达将测序正确的质粒对应的菌液继续大体积培养扩增，提取质粒，待用。复苏hek293f细胞,120rpm，8％co2，37℃悬浮培养3代。转染前，将细胞接种至新的培养瓶，接种密度为1.5×106个/ml，悬浮培养2h后，将重链质粒、轻链质粒和转染试剂按照一定的比例静置孵育15min后，转染hek293f细胞。转染后的细胞悬浮培养，当细胞活率低于70％收集上清培养液，4000rpm离心5min后，采用proteina亲和层析柱纯化细胞上清中重组全长抗体，纯化过程中液体流速均为1ml/min。纯化后的抗体用0.01mpbs溶液进行透析过夜，透析结束后，测定抗体浓度为3mg/ml，采用sds-page(图2)进行了验证。重组全长抗体的elisa应用与性能评价将吡唑醚菌酯-ova(碳二亚胺法制备)作为包被原包被96孔板，然后用兔抗鼠igg-hrp作为检测抗体，tmb作为反应底物，吡唑醚菌酯和其他新烟碱类农药标准品作为检测物，进行elisa检测。结果(图3)如下:a)检测范围抗吡唑醚菌酯重组全长抗体用于elisa法检测范围(ic20-ic80)为：1.15-13.18ng/ml。抗吡唑醚菌酯小鼠腹水单抗用于elisa法检测范围(ic20-ic80)为：1.16-15.11ng/ml。b)灵敏度(ic50)抗吡唑醚菌酯重组全长抗体ic50为：3.88ng/ml，与其亲本抗体(ic50为：4.18ng/ml)非常接近。c)特异性本发明中通过检测与其他三种杀菌剂(醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑)的交叉反应来评价抗体的特异性，结果表明该重组全长抗体与亲本抗体的选择性一致，即对其它三种农药无显著识别(cr<2％)，即适用于吡唑醚菌酯的高特异性检测。综上，经elisa法验证，本发明的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体可代替腹水抗体，可用于后续检测试剂盒的开发。上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。sequencelisting<110>浙江大学<120>一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体<130>3<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>354<212>dna<213>musmusculus<400>1gaagtggagctggtcgagtctgggggtggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactc60tcctgtgcagtctctggattcactttcagtacctatgccatgtcttgggttcgccagact120ccagagaagaggctggaatgggtcgcatccattcgtagtggtggtgacacctactatcca180gacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagataatgccaggaacattctgtacctg240caaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaagactaagtcat300ttctacgtctacggggactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca354<210>2<211>118<212>prt<213>musmusculus<400>2gluvalgluleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalavalserglyphethrpheserthrtyr202530alametsertrpvalargglnthrproglulysargleuglutrpval354045alaserileargserglyglyaspthrtyrtyrproaspservallys505560glyargphethrileserargaspasnalaargasnileleutyrleu65707580glnmetserserleuargsergluaspthralamettyrtyrcysthr859095argleuserhisphetyrvaltyrglyasptyrtrpglyglnglythr100105110thrleuthrvalserser115<210>3<211>333<212>dna<213>musmusculus<400>3gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc60atctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattatggcattagttttatgaactggtac120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatcc180ggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat240cctatggaggaggatgatagtgcaatttatttctgtcagcaaagtaaggaggttcctccg300acgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa333<210>4<211>111<212>prt<213>musmusculus<400>4aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysargalasergluservalaspasntyr202530glyileserphemetasntrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaalaserasnglnglyserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580prometglugluaspaspseralailetyrphecysglnglnserlys859095gluvalproprothrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105110当前第1页12