一种具有低温活性的木聚糖酶PaXynA及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种木聚糖酶paxyna的蛋白、编码该蛋白的基因、含有该基因的表达载体和重组菌株、裂解木聚糖的方法以及应用。

背景技术：

木聚糖(xylan)是植物半纤维素的主要成分，约占地球上所有可再生有机碳的33％，是由β-1,4-糖苷键连接形成的多聚体，在自然界中含量仅仅低于纤维素，具有极大的工业利用潜力。木聚糖酶能够水解木聚糖，使得木聚糖在许多工业生产中得以运用，在许多工业领域中具有广阔的应用前景，包括硫酸盐纸浆的生物漂白、植物纤维的脱胶、烟草加工、植物油的提取、纺织纤维的回收和农业废物的生物转化，以及生物燃料生产等。

木聚糖结构复杂，完全水解需要多种酶的协同作用才能完成，该酶系主要包括：内切-β-1,4-木聚糖酶(ec3.2.1.8)，β-1,4-木糖苷酶(ec3.2.1.37)，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)及阿魏酸酯酶(ec3.1.1.6)等，木聚糖水解酶系中关键酶是断裂β-1,4-糖苷键的木聚糖酶(内切-1，4-β-xylanase；ec3.2.1.8)，其水解木聚糖后生成木糖和木二糖。由于直接参与糖苷键的断裂，内切木聚糖酶是重要的木聚糖酶。

目前已报道的木聚糖酶主要来源有细菌(bacteria)、真菌(fungi)、放线菌(actinomycetes)和酵母菌(yeast)，包括纤维素单胞菌(cellulosima)、芽孢杆菌(bacillus)、微球菌(micrococcus)、青霉菌(penicillium)、链霉菌(streptomycete)等。用于工业生产的木聚糖酶最适反应温度大多在50～60℃左右，最适作用ph在5.0～7.0左右，而最适反应温度低于40℃的低温木聚糖酶较少。

但是，在工业生产中温度的升高会伴随着能源消耗，环境污染，成本上升等问题，寻找低温适应性木聚糖酶无疑是解决问题的最佳方式。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有的木聚糖酶低温适应性差的问题，提供一种木聚糖酶paxyna的基因、蛋白、裂解木聚糖的方法及应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种蛋白，所述蛋白具有木聚糖酶活性，所述蛋白的氨基酸序列与seqidno:2具有至少99％的一致性。

可选地，所述蛋白的氨基酸序列为seqidno:2；所述蛋白作为木聚糖酶的最适作用温度为30-40℃，最适作用ph值为5.0-6.0。

本发明第二方面提供一种基因，该基因编码本发明第一方面提供的蛋白。

可选地，所述基因的核苷酸序列为seqidno:1所示的序列。

本发明第三方面提供一种表达载体，所述表达载体插入有表达框，所述表达框含有本发明第二方面提供的基因。

本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有外源的本发明第二方面提供的基因。

本发明第五方面提供一种水解木聚糖的方法，该方法包括：将含有木聚糖的原料与本发明第一方面提供的蛋白在酶促反应条件下接触。

可选地，所述酶促反应的条件包括：温度为4-80℃，ph值为3.0-10.0，时间为2-20min；

优选地，温度为30-40℃，ph值为5.0-6.0，时间为8-12min。

可选地，所述含有木聚糖的原料包括燕麦木聚糖和/或桦木木聚糖，优选为燕麦木聚糖。

本发明第六方面提供一种本发明第一方面提供的蛋白在低温水解木聚糖中的应用。

通过上述技术方案，本发明的具有木聚糖酶活性的蛋白具有良好的低温适应性，可以较低的温度下处理木聚糖，可以降低工业生产成本、减轻环境污染、节约能源。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏信息

嗜氧类芽孢杆菌r14，分类命名paenibacillusaerobic，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2019年3月29日，保藏编号为gdmccno：60620。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明实施例3的木糖标准曲线；

图2是本发明实施例3的温度、ph值和金属离子对木聚糖酶paxyna的酶活性影响的结果图；

图3是本发明实施例3木聚糖酶paxyna的酶促反应的动力学方程图；

图4是sds-page电泳分析实施例1制备的蛋白的结果；其中，m为标准蛋白maker；1为携带重组质粒28a-paxyna未经诱导的细胞破碎上清液；2为携带本发明构建的重组质粒经诱导后的细胞破碎上清液；3为携带本发明构建的重组质粒经诱导后的细胞破碎上清液经ni柱亲和层析后的剩余蛋白；4为本发明构建的重组质粒经诱导后的细胞破碎上清液经akta仪器纯化过后的单一木聚糖酶paxyna。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种蛋白，该蛋白具有木聚糖酶活性，该蛋白的氨基酸序列与seqidno:2具有至少99％的一致性。

其中，seqidno:2的序列为myksstpglrdaavakgkhigvatqswyltdknyakiisneydmltpeyqmkmsevqaqrgvfdfteadklvkfardnnmlvrghaliwhdalpswvldgkftrdewiqilrdhitttvkhfkgkiyawdvvneafwtngqyrpsiwytnigpeyielafryaheadpnaklfyndfdtevtnskstaeyqmvkqlkakgvpingvgfqthltidgvnyadmkqnfqrfaalgvdtditemdlishtfkgtfqakmkaeadvyanvykialslpsvksfvtwglkddhswlnqdtgyqeypllldnsynkkpaydailkllkg。

根据本发明，木聚糖酶活性是指1,4-β-d-木聚糖的木聚糖水解酶(1,4-beta-d-xylanxylanohydrolase)的活性，也就是催化木聚糖中(1-4)-β-d-木糖苷键的内水解的酶，该酶的系统命名为ec3.2.1.8，该酶的活性可以根据酶学委员会(enzymecommission)规定的标准进行测定(howard,b.h.,jones,g.andpurdom,m.r.thepentosanasesofsomerumenbacteria.biochem.j.74(1960)173-180.)。

根据本发明，该蛋白作为木聚糖酶的最适作用温度可以为30-40℃，最适作用ph值可以为5.0-6.0。

在一种优选的具体实施方式中，蛋白的氨基酸序列为seqidno:2。

本发明第二方面提供一种基因，该基因编码本发明第一方面提供的蛋白。

根据本发明，可以按照如上所述的蛋白的氨基酸序列，依据密码子对照表，得到编码如上所述的蛋白的基因的核苷酸序列。

在一种具体实施方式中，该基因的核苷酸序列为seqidno:1所示的序列。

本发明第三方面提供一种表达载体，该表达载体插入有表达框，表达框含有本发明第二方面提供的基因。优选地，表达框为本发明第二方面提供的基因。

本发明第四方面提供一种重组菌株，该重组菌株含有外源的本发明第二方面提供的基因。

本发明第五方面提供一种水解木聚糖的方法，该方法包括：将含有木聚糖的原料与本发明第一方面提供的蛋白在酶促反应条件下接触。

根据本发明，酶促反应的条件可以包括：温度为4-80℃，ph值为3.0-10.0，时间为2-20min；优选地，温度为30-40℃，ph值为5.0-6.0，时间为8-12min，更优选地，温度为30-40℃，ph值为5.0-6.0，时间为10min。

根据本发明，含有木聚糖的原料可以包括燕麦木聚糖和/或桦木木聚糖，优选为燕麦木聚糖。

本发明第六方面提供一种本发明第一方面提供的蛋白在低温水解木聚糖中的应用。

下面通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。

实施例1

实施例1为嗜氧类芽孢杆菌r14木聚糖酶基因重组载体的构建。

本实施例中大肠杆菌克隆菌株感受态细胞dh5α和表达菌株感受态细胞bl21(de3)为北京全式金公司市售产品；

表达载体pet-28a(+)：novagen公司市售产品；

lb培养基由在1lddh2o中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，121℃灭菌30min制备得到；

50mg/ml的卡那霉素使用20ml灭菌ddh2o溶解1g卡那霉素，配制成浓度为50mg/ml的储存液，保存于-20℃备用。

使用嗜氧类芽孢杆菌r14作为原始菌，扩大培养并提取其基因组dna作为扩增模版；该嗜氧类芽孢杆菌r14是本发明的发明人保藏于广州微生物保藏中心的类芽孢杆菌属新种，保藏编号为gdmcc60620。

使用引物(cagcaaatgggtcgcggatccatgtacaagtcttcgaccccgg，seqidno:3；以及，tggtggtgctcgagtgcggccgcgccttttaataatttcagaattgcg，seqidno:4)，按照表1的反应体系和表2中所示的反应程序对上述扩增模板进行pcr扩增，具体方法如下：

使用所述的pcr体系及程序，扩增木聚糖酶基因paxyna片段，并经电泳验证，切胶回收纯化；同时，将pet-28a(+)质粒用bamhi(seqidno:3所含酶切位点)和noti(seqidno:4所含酶切位点)进行双酶切消化，回收得到线性化pet-28a(+)载体片段，用诺唯赞公司的2×cloneexpressmix连接酶，按照所述的连接体系，将纯化的目的片段及线性化pet-28a(+)质粒在50℃处理15min，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上于37℃恒温培养12-16h，挑取单菌落进行pcr验证，得到的重组质粒进一步进行酶切鉴定，同时，送华大基因进行测序验证。将构建成功的菌株加入75％甘油(3:1,v:v)置于-80℃冰箱保存。

将构建成功的重组大肠杆菌dh5α活化，并扩大培养，使用magen质粒提取试剂盒提取质粒，转化大肠杆菌表达菌株感受态细胞bl21(de3)，在含50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上于37℃恒温培养12-16h，挑取单菌落进行pcr验证，同时，送华大基因进行测序验证。将构建成功的菌株加入75％甘油(3:1,v:v)置于-80℃冰箱保存。

表1pcr反应体系

表2pcr反应程序

实施例2

实施例2为嗜氧类芽孢杆菌r14木聚糖酶重组蛋白的诱导表达。

本实施例中1mol/l的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)由称取2.383giptg溶于10ml灭菌ddh2o中，配置成浓度为1mol/l的iptg的储存液，保存于-20℃备用；

lb培养基和卡那霉素制备方法和组成如实施例1所示；

nta-0溶液由将7.8gnah2po4，17.5gnacl溶于1lddh2o，调节ph7.5-8.0得到；

500mmol/l的咪唑溶液由将34.04gc3h4n2溶于1lnta-0溶液中，调节ph＝8.0得到。

将实施例1构建好的重组载体转化大肠杆菌bl21(de3)在含50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上活化，从平板上挑取单菌落分别于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中培养，37℃，220rpm，培养12h。测量培养12h的母液od600，按最终od600＝0.1转接于相应培养基，37℃，220rpm，培养直至od600＝0.6左右。加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，16℃，220rpm，培养15h进行木聚糖酶paxyna的诱导表达，同时设置未加iptg的处理作为对照。

收集诱导后的细胞，进行超声波破碎，提取细胞总蛋白，利用sds-page检测目的蛋白的表达情况及蛋白的可溶性。将细胞破碎液在4℃条件下，10000×g离心30min，收集上清液，使用ge公司的akta蛋白纯化仪采用his标签亲和层析法对所得粗酶液进行纯化。

经sds-page检测，目的蛋白在重组大肠杆菌中成功表达，经akta蛋白纯化仪对所得粗酶液进行纯化，目的蛋白(木聚糖酶paxyna)成功得到纯化，纯化后条带单一，结果如图4所示。

实施例3

实施例3为木聚糖酶paxyna的酶学性质测定。

本实施例中燕麦木聚糖为megazyme公司在售产品；

dns试剂：称取50g3,5-二硝基水杨酸溶于4000ml水中，不断搅拌，缓缓加入80gnaoh，使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000ml。如果溶液不澄清，用滤纸过滤，然后棕色瓶室温贮藏，一周后方可使用；

1％的木聚糖：加1g燕麦木聚糖于80ml0.1mol/lph7.0tris-hcl缓冲液中，沸水浴加热10min，冷却后调ph至7.0，再加缓冲液定容至100ml。10000×g离心5min，取上清，置于4℃备用；

0.1mol/ltris-hcl缓冲液通过称取15.67gtris-hcl，溶于1000ml的ddh2o中，配制成0.1mol/ltris-hcl缓冲液，调节ph为7.0而得到；

0.2mol/lna2hpo4溶液通过称取28.40gna2hpo4粉末，溶于1000ml的ddh2o中，配制成0.2mol/l的na2hpo4溶液而得到；

0.1mol/l柠檬酸(c6h8o7)溶液通过称取21.01gc6h8o7·h2o粉末，溶于1000ml的ddh2o中，配制成0.1mol/l柠檬酸溶液而得到；

0.2mol/l甘氨酸溶液通过称取15.01g甘氨酸粉末，溶于1000ml的ddh2o中，配制成0.2mol/l甘氨酸溶液而得到；

0.2mol/l氢氧化钠溶液通过称取8.0g氢氧化钠粉末，溶于1000ml的ddh2o中，配制成0.2mol/l氢氧化钠溶液而得到。

(1)dns法测定木聚糖酶活性

将相应的木聚糖溶于0.1mol/ltris-hcl缓冲液中，配成终浓度为1％的底物溶液。将100μl合理稀释的酶液和900μl底物溶液混匀。50℃温育10min，反应液中加入1.5mldns溶液终止反应。沸水浴5min显色，放置室温后540nm处测其od540值，使其落于标准曲线的准确范围内。对照管在加入高温失活的酶液。

(2)木糖标准曲线测定

木糖用0.1mol/l的tris-hcl缓冲液配成10mmol/l溶液。按表3加入不同量的木糖溶液和0.1mol/l的tris-hcl缓冲液，最后加入1.5mldns溶液，总体积2ml，沸水浴5min显色，放置室温后测定od540的光吸收。绘制标准曲线，如图1所示。

酶活(u/mg)单位定义：在最适温度和最适ph条件下每分钟分解底物释放1μmol还原糖所需的酶量被定义为一个酶活单位。

表3dns法木糖标准曲线样品配制

(3)木聚糖酶paxyna的最适温度及温度稳定性测定

最适温度的测定在ph值为7.0的0.1m的tris-hcl缓冲液体系及不同的温度(4～80℃)下进行酶促反应，绘制最适温度曲线，测定重组酶酶活力，以最高酶活为100％，计算不同温度条件下的相对酶活，测定其最适反应温度，结果如图2a所示。将酶液分别在30℃、40℃和50℃条件下保温处理0、2、5、10、15、20、25和30min后，在40℃，ph＝6.0条件下测定处理后的酶活，以未经处理的酶液作为对照，计算剩余酶活力，测定其温度稳定性，结果如图2b所示。

(4)木聚糖酶paxyna的最适作用ph值及ph稳定性测定

经纯化的木聚糖酶50℃，在不同的ph值(3.0～10.0)下进行酶促反应以测定其最适作用ph值，所用缓冲液为ph值为3.0～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以及ph值为9.0～10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(见表4)。以最高酶活为100％，计算不同ph值条件下的相对酶活，测定其最适反应ph，结果如图2c所示。将酶液在不同ph值条件下，置于4℃处理1h，用ph＝6.0的缓冲液在40℃条件下测定处理后的酶活，以未经处理的酶液作为对照，计算剩余酶活力，测定其ph稳定性，结果如图2d所示。

表4不同ph缓冲液配制

(5)金属离子对木聚糖酶paxyna的酶活性的影响

在酶促反应体系中加入终浓度为10mm/l的相应的金属离子及化学试剂(mncl2,crcl2,cucl2,licl2,kcl,cocl2,nacl,srcl2,mgcl2,cacl2,feso4,zncl2,pbcl2,sds和edta)，在40℃，ph＝6.0条件下测定相应酶活性，以未加金属离子和化学试剂的酶液作为对照，测定不同金属离子及化学试剂对木聚糖酶paxyna的酶活性的影响，结果见图2e。

(6)木聚糖酶paxyna的动力学参数测定

将酶与底物混合后在在40℃，ph＝6.0条件下，分别反应0、1、3、5、7、9、11、13和15min，测定相应的酶活，计算酶活性与反应时间的比值，该比值在一定时间内保持恒定，则该时间作为酶促反应的一级反应时间，可作为测定km和vmax的反应时间。在一级反应时间内，测定在不同底物浓度下paxyna的酶活，计算相应的反应速度，利用米氏方程，通过双倒数法作图，结果如图3所示，确定km和vmax值。

由上，最适ph值和最适温度实验表明：paxyna的最适反应ph值为6.0(图2c)，在ph值为4.0-7.0范围内具有较强稳定性(图2d)；最适反应温度为40℃，但是在20℃下仍有50％的活性(图2a)；热稳定实验表明木聚糖酶paxyna为温度敏感型木聚糖酶，在40℃和50℃处理2min后基本丧失酶活力，而在30℃条件下处理2min后仍然具有约60％的酶活(图2b)，表明木聚糖酶paxyna具有良好的低温适应性。

金属离子和化学试剂对paxyna酶活性的影响实验表明：一价阳离子k⁺，li⁺，na⁺，以及二价阳离子sr²⁺，mg²⁺，ca²⁺对木聚糖酶paxyna的活性没有明显影响，而cu²⁺,zn²⁺,pb²⁺,mn²⁺,cr²⁺,co²⁺和sds，edta，对木聚糖酶paxyna的活性有明显的抑制作用。

酶促动力学结果表明：木聚糖酶paxyna的vmax和km分别为97.56mol/(min·mg)和44.37mg/ml。在最佳条件下(温度40℃，ph＝6.0)，酶活力为66.5±1.5u/mg(图3)。

综上所述，本发明的木聚糖酶paxyna具有良好的低温适应性，适用于在较低温度下处理木聚糖，可以降低工业生产成本，减轻环境污染，节约能源，可带来显著的社会效益、经济效益和环境效益。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>一种具有低温活性的木聚糖酶paxyna及其编码基因与应用

<130>17555caas-b-zw

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>972

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtacaagtcttcgaccccggggcttcgtgatgctgccgtagctaaaggcaagcatatc60

ggtgtggccacgcaatcttggtatctgacggataagaattatgccaagattattagtaac120

gaatatgatatgctgacgcctgagtatcaaatgaaaatgagcgaagtgcaggctcagcga180

ggcgtgtttgattttactgaagcggacaagcttgtgaagttcgcaagagacaataatatg240

ctggttcggggccatgcgctcatctggcatgacgctttgccttcttgggtactagacgga300

aagtttacccgtgacgaatggattcaaattttaagagaccacatcacgacgaccgtgaag360

cacttcaagggtaaaatttatgcctgggatgtcgtaaacgaagcattctggacaaacgga420

cagtaccggccttcaatctggtataccaatattggaccggaatatatcgaattggctttc480

cgttatgcacacgaagcagatccgaatgcgaagcttttctataatgatttcgataccgag540

gttacgaacagcaaatctactgcagaatatcagatggttaagcagcttaaagccaaaggg600

gttccaatcaacggtgttggcttccaaactcacctgacgatagacggcgtaaactatgcg660

gatatgaaacaaaacttccaacgttttgcggcgcttggcgtggataccgacatcacggag720

atggatctcatcagccatacctttaagggcaccttccaagcaaaaatgaaagcggaagcc780

gacgtgtatgccaatgtctacaaaattgcacttagccttccaagcgtcaaatcgtttgta840

acgtggggattgaaggatgatcatagttggctgaatcaggataccggctatcaggaatat900

ccgctgcttctcgacaactcgtataacaagaaaccagcttatgacgcaattctgaaatta960

ttaaaaggctaa972

<210>3

<211>323

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

mettyrlysserserthrproglyleuargaspalaalavalalalys

151015

glylyshisileglyvalalathrglnsertrptyrleuthrasplys

202530

asntyralalysileileserasnglutyraspmetleuthrproglu

354045

tyrglnmetlysmetsergluvalglnalaglnargglyvalpheasp

505560

phethrglualaasplysleuvallysphealaargaspasnasnmet

65707580

leuvalargglyhisalaleuiletrphisaspalaleuprosertrp

859095

valleuaspglylysphethrargaspglutrpileglnileleuarg

100105110

asphisilethrthrthrvallyshisphelysglylysiletyrala

115120125

trpaspvalvalasnglualaphetrpthrasnglyglntyrargpro

130135140

seriletrptyrthrasnileglyproglutyrilegluleualaphe

145150155160

argtyralahisglualaaspproasnalalysleuphetyrasnasp

165170175

pheaspthrgluvalthrasnserlysserthralaglutyrglnmet

180185190

vallysglnleulysalalysglyvalproileasnglyvalglyphe

195200205

glnthrhisleuthrileaspglyvalasntyralaaspmetlysgln

210215220

asnpheglnargphealaalaleuglyvalaspthraspilethrglu

225230235240

metaspleuileserhisthrphelysglythrpheglnalalysmet

245250255

lysalaglualaaspvaltyralaasnvaltyrlysilealaleuser

260265270

leuproservallysserphevalthrtrpglyleulysaspasphis

275280285

sertrpleuasnglnaspthrglytyrglnglutyrproleuleuleu

290295300

aspasnsertyrasnlyslysproalatyraspalaileleulysleu

305310315320

leulysgly