一种噻唑橙衍生物及其制备和应用的制作方法

本申请属于小分子光热材料的技术领域，尤其涉及一种噻唑橙衍生物及其制备和应用。

背景技术：

荧光造影成像技术由于具有灵敏度高、成本较低廉、操作简便和对机体组织无损害，而且能够实现实时的示踪成像，近年来在早期癌症的检查与诊断方面取得了许多进展。

线粒体是细胞存活的重要细胞器，是细胞的能量工厂，在细胞凋亡过程中扮演关键作用。肿瘤细胞中线粒体异常活跃，和肿瘤的无限增殖能力密切相关。因而，线粒体一直被认为是抗肿瘤治疗的理想靶点，包括物质运输，遗传信息的解释，基因表达调控，以及一些重要的生物催化作用。癌细胞的代谢要比正常细胞的代谢快9倍，线粒体含量也比正常细胞大很多。

光热治疗肿瘤是近些年的医学热门研究，原理是利用亲和性较好的材料，选择性的靶向肿瘤后，通过具有高强穿透性和低生物组织伤害性的近红外光照射下，材料的光能会转换成热能，从而达到杀死肿瘤的目的。但是，现有的线粒体光热探针的光热转化效率较低。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请提供了一种具有低生物毒性和高光热转换的噻唑橙衍生物，能有效解决现有的线粒体光热探针的光热转化效率低的技术问题。

本申请第一方面提供了一种噻唑橙衍生物，具有如式ⅰ的结构；

其中，n＝1、2或3；x为i、br或cl；r1为脂肪酰胺基、脂肪羧基或脂肪烷基；r2为三苯基磷或三苯基胺；

作为优选，其特征在于，

所述脂肪烷基的结构式如式ii所示；

所述脂肪羧基的结构式如式ii-a所示；

所述脂肪酰胺基的结构式如式ii-b所示；

其中，n＝0～5的整数；g为i、br或cl；z为i、br或cl；m为i、br或cl；

所述三苯基磷的结构式如式iii所示；

所述三苯基胺的结构式如式iii-a所示；

本申请第二方面提供了上述噻唑橙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将式ⅸ结构的化合物与式ⅶ结构的化合物反应得到所述式ⅰ结构的化合物；

其中，n＝1、2或3；所述r2为三苯基磷或三苯基胺；所述y为i、br或cl；所述x为i、br或cl；所述r1为脂肪酰胺基、脂肪羧基或脂肪烷基。

具体的，将式ⅸ结构的化合物和式ⅶ结构的化合物以摩尔比1：1添加到无水乙腈中，用无水碳酸钠和三乙胺当催化剂。100～120℃中搅拌反应，用乙酸乙酯洗涤析出固体，将固体溶解在二氯甲烷中，过滤收集溶液，在真空中干燥，得到深蓝色固体式ⅰ结构的化合物。

作为优选，

所述式ⅸ结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将式ⅷ结构的化合物与式iii结构的化合物反应得到所述式ⅸ结构的化合物；或式ⅷ结构的化合物与式iii-a结构的化合物反应得到所述式ⅸ结构的化合物；

其中，n＝1、2或3；y为i、br或cl。

具体的，将式ⅷ结构的化合物和r2以摩尔比1:1在甲苯溶液中溶解，在80～110℃下搅拌，然后加入乙醚重结晶，过滤收集沉淀，用丙酮洗涤，然后在真空中干燥，得到红色固体产物式ⅸ结构的化合物。

r2选自式iii结构的化合物或式iii-a结构的化合物。

作为优选，

所述式ⅷ结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将2-甲基苯丙噻唑与式ⅳ结构的化合物反应得到所述式ⅷ结构的化合物；

其中n＝1、2或3；y为i、br或cl。

具体的，将2-甲基苯丙噻唑和式ⅳ结构的化合物以摩尔比1:3混合，在80～110℃下搅拌，然后加入乙酸乙酯重结晶，过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤，收集沉淀物后在真空中干燥，得到白色固体产物式ⅷ结构的化合物。

作为优选，

所述式ⅶ结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将式ⅵ结构的化合物与乙酸酐反应得到所述式ⅶ结构的化合物；

其中，x为i、br或cl；r1为脂肪酰胺基、脂肪羧基或脂肪烷基。

具体的，将式ⅵ结构的化合物和乙酸酐以摩尔比1:16溶解在吡啶中，混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯，通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤三次。将所得固体悬浮在二氯甲烷中，然后在室温下搅拌。过滤去除绿色沉淀物，滤液在真空中浓缩。将所得残渣溶解在二氯甲烷中，并添加乙醚重结晶，然后通过过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤，然后在真空中干燥，得到深蓝色固体产物式ⅶ结构的化合物。

作为优选，

所述式ⅵ结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将式ⅴ结构的化合物与n，n'-二苯基甲脒反应得到所述式ⅵ结构的化合物；

其中，x为i、br或cl；r1为脂肪酰胺基、脂肪羧基或脂肪烷基。

具体的，将式ⅴ结构的化合物和n，n′-二苯基甲脒以摩尔比1:2溶解在乙醇中，50～70℃回流加热。冷却至室温后，通过过滤收集沉淀，用乙醇洗涤三次，然后在真空中干燥，得到棕色固体产物式ⅵ结构的化合物。

作为优选，

所述式ⅴ结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将2、4-二甲基喹啉与式ii结构的化合物反应，得到式ⅴ结构的化合物，或，将2、4-二甲基喹啉与式ii-a结构的化合物反应，得到式ⅴ结构的化合物，或，将2、4-二甲基喹啉与式ii-b结构的化合物反应，得到式ⅴ结构的化合物；

具体的，将2、4-二甲基喹啉与r1(式ii结构的化合物、式ii-a结构的化合物或式ii-b结构的化合物)以摩尔比1:1加入到乙腈溶剂中，40～60℃反应18～24小时，冷却至室温，滴加适量的乙酸乙酯，有固体析出，收集固体，提纯，得到产物式ⅴ结构的化合物。

本申请第三方面公开了所述噻唑橙衍生物或所述制备方法制得的噻唑橙衍生物在制备靶向光热治疗肿瘤药物或靶向细胞光声成像信号药物中的应用。

作为优选，所述肿瘤的靶向细胞器和所述细胞的靶向细胞器为线粒体。

作为优选，所述肿瘤细胞选自人前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞和肝癌细胞中的一种或多种；但是，所述肿瘤的细胞不限于以上癌细胞。

具体的，所述靶向光热治疗肿瘤药物为线粒体光热探针，本申请提供的噻唑橙衍生物在激光的照射下将光能转化为热能，使得肿瘤细胞的温度上升，从而破坏肿瘤细胞的结构，抑制肿瘤活性。

本申请公开的噻唑橙衍生物以噻唑喹啉类小分子、具有靶向线粒体的配体三苯基磷、三苯基胺、双乙烯键共轭平面为骨架的化合物，本噻唑橙衍生物可作为线粒体光热探针。本申请的噻唑橙衍生物具备大共轭平面和柔性链，噻唑橙衍生物分子内的电荷转移效应可影响分子的荧光发射强度，特有的侧链基团能够在细胞实验中特异性识别线粒体，在能量为2j/cm²的808nm激光器的照射五分钟内光能转化为热能，细胞内升温30～80℃，具备高光热转换效率，从而破坏细胞的结构，抑制活性；本申请的噻唑橙衍生物的双乙烯键能增加小分子的波长达到近红外区域，近红外光能增强小分子的组织穿透能力和深度，能够靶向线粒体异常活跃和丰富的肿瘤细胞，当设计的小分子化合物绝大部分靶向到肿瘤细胞后，能够荧光定位线粒体的位置此外，该新型噻唑橙光热探针具备高生物亲和性，在光热治疗领域有着广阔的应用前景；可见，本申请公开的噻唑橙衍生物作为一种靶向线粒体的光热转化小分子，在肿瘤治疗应用领域中是有力工具并发挥着至关重要的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例提供的式ⅰ的结构式图；

图2为申请实施例提供的噻唑橙衍生物的制备方法的流程图；

图3为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)溶解在氘代dmso中的氢谱图。

图4为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)和icg在照射能量为2j/cm²的808nm激光器照射下5分钟内的升温折线图；

图5为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)在808nm激光器照射下5分钟内的红外热成像图；

图6为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)与人前列腺癌pc3、乳腺癌mcf7、非小细胞肺癌a549和肝癌hepg2细胞和hacat表皮细胞的细胞毒性柱状图；

图7为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)和dapi，mitogreen线粒体染色剂染pc3细胞成像图。

具体实施方式

本申请提供了一种具有低生物毒性和高光热转换的噻唑橙衍生物，用于解决现有技术中线粒体光热探针的光热转化效率低的技术缺陷。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制；

本申请的噻唑橙衍生物的结构式如图1所示。

请参阅图2所示，本申请的噻唑橙衍生物的具体反应步骤为：

(1)将2、4-二甲基喹啉与r1以摩尔比1:1加入到乙腈溶剂中，60℃反应24小时，冷却至室温，滴加适量的乙酸乙酯，有固体析出，收集固体，提纯，得到产物式ⅴ结构的化合物；其中，r1选自式ii结构的化合物、式ii-a结构的化合物或式ii-b结构的化合物；

(2)将式ⅴ结构的化合物和n，n′-二苯基甲脒以摩尔比1:2溶解在乙醇中，60℃回流加热1小时。冷却至室温后，通过过滤收集沉淀，用乙醇洗涤三次，然后在真空中干燥，得到棕色固体产物式ⅵ结构的化合物；

(3)将式ⅵ结构的化合物和乙酸酐以摩尔比1:16溶解在吡啶中，混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯，通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤三次。将所得固体悬浮在二氯甲烷中，然后在室温下搅拌30分钟。过滤去除绿色沉淀物，滤液在真空中浓缩。将所得残渣溶解在二氯甲烷中，并添加乙醚重结晶，然后通过过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤，然后在真空中干燥，得到深蓝色固体产物式ⅶ结构的化合物；

(4)将2-甲基苯丙噻唑和式ⅳ结构的化合物以摩尔比1:3混合，在110℃下搅拌12小时，然后加入乙酸乙酯重结晶，过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤，收集沉淀物后在真空中干燥，得到白色固体产物式ⅷ结构的化合物；

(5)将式ⅷ结构的化合物和r2以摩尔比1:1在甲苯溶液中溶解，在100℃下搅拌12小时，然后加入乙醚重结晶，过滤收集沉淀，用丙酮洗涤，然后在真空中干燥，得到红色固体产物式ⅸ结构的化合物；r2选自式iii结构的化合物或式iii-a结构的化合物；

(6)将式ⅸ结构的化合物与式ⅶ结构的化合物以摩尔比1：1添加到无水乙腈中，用无水碳酸钠和三乙胺当催化剂。110℃中搅拌反应24小时后，用乙酸乙酯洗涤析出固体，将固体溶解在二氯甲烷中，过滤收集溶液，在真空中干燥，得到深蓝色固体式ⅰ结构的化合物。

实施例1

本申请实施例提供了一种噻唑橙衍生物(ⅰ-b)，其合成方法包括：

(1)将2、4-二甲基喹啉与碘甲烷以摩尔比1:1加入到乙腈溶剂中，60℃反应24小时，冷却至室温，滴加适量的乙酸乙酯，有固体析出，收集固体，提纯，得到产物式(ⅴ-b)；

式(ⅴ-b)的nmr数据为：¹hnmr(dmso,400hz)：δ8.13(d,j＝8.4hz,1h),8.04(d,j＝8.4hz,1h),7.68(m,2h),6.92(s,1h),4.33(s,3h),2.68(s,3h),2.59(s,3h)；esi-msm/z299.02[m-i]⁺；

(2)将式(ⅴ-b)和n，n′-二苯基甲脒以摩尔比1:2溶解在乙醇中，60℃回流加热1小时。冷却至室温后，通过过滤收集沉淀，用乙醇洗涤三次，然后在真空中干燥，得到棕色固体产物式(ⅵ-b)；

式(ⅵ-b)的nmr数据为：¹hnmr(dmso,400hz)：δ11.24(m,2h),8.68(d,j＝8.4hz,1h),8.60(d,j＝8.2hz,2h),8.26(d,j＝8.4hz,1h),8.15(m,3h),7.45(m,4h),7.29(m,4h),6.89(d,j＝8.2hz,2h),6.19(m,2h),4.39(s,3h)；esi-msm/z505.10[m-i]⁺；

(3)将式(ⅵ-b)和乙酸酐以摩尔比1:16溶解在吡啶中，混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯，通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤三次。将所得固体悬浮在二氯甲烷中，然后在室温下搅拌30分钟。过滤去除绿色沉淀物，滤液在真空中浓缩。将所得残渣溶解在二氯甲烷中，并添加乙醚重结晶，然后通过过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤，然后在真空中干燥，得到深蓝色固体产物式(ⅶ-b)；

式(ⅶ-b)的nmr数据为：¹hnmr(dmso,400hz)：δ8.68(d,j＝8.4hz,1h),8.53(d,j＝8.2hz,2h),8.19(d,j＝8.2hz,2h),7.72(m,2h),7.58(m,6h),7.46(m,4h),6.12(m,2h),4.33(s,3h),2.04(s,6h)；esi-msm/z589.12[m-i]⁺；

(4)将2-甲基苯丙噻唑和1，4-二碘丁烷以摩尔比1:3混合，在110℃下搅拌12小时，然后加入乙酸乙酯重结晶，过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤，收集沉淀物后在真空中干燥，得到白色固体产物式(ⅷ-b)；

式(ⅷ-b)的nmr数据为：¹hnmr(dmso,400hz)：δ8.04(d,j＝8.4hz,1h),7.72(d,j＝8.4hz,1h),7.54(t,j＝8.2hz,2h),4.04(m,2h),3.01(m,2h),2.85(s,3h),1.92(m,4h)；esi-msm/z458.90[m-i]⁺；

(5)将式(ⅷ-b)和式(iii)以摩尔比1:1在甲苯溶液中溶解，在100℃下搅拌12小时，然后加入乙醚重结晶，过滤收集沉淀，用丙酮洗涤，然后在真空中干燥，得到红色固体产物式(ⅸ-b)；

式(ⅸ-b)的nmr数据为：¹hnmr(dmso,400hz)：δ8.09(d,j＝8.4hz,1h),7.66(d,j＝8.4hz,1h),7.53(m,2h),7.36–7.25(m,15h),4.06(m,2h),2.91(s,3h),2.35(m,2h),1.96(m,2h),1.52(m,2h)；esi-msm/z233.59[m-2i]⁺；

(6)将式(ⅸ-b)和式(ⅶ-b)以摩尔比1：1添加到无水乙腈中，用无水碳酸钠和三乙胺当催化剂。110℃中搅拌反应24小时后，用乙酸乙酯洗涤析出固体，将固体溶解在二氯甲烷中，过滤收集溶液，在真空中干燥，得到深蓝色固体式(ⅰ-b)；

式(ⅰ-b)的nmr数据为：¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.77–8.68(m,1h),8.45(dd,j＝34.5,10.8hz,2h),8.25–8.16(m,2h),8.10(s,1h),8.00(d,j＝8.2hz,1h),7.83–7.68(m,31h),7.63–7.60(m,4h),7.58–7.56(m,2h),7.11–6.99(m,3h),6.56–6.44(m,2h),5.76–5.57(m,2h),3.89(d,j＝4.5hz,3h),3.01(dd,j＝14.4,7.0hz,4h),1.52(s,2h),1.23(s,2h),1.15(t,j＝7.2hz,4h)；esi-msm/z:374.81[m-3i]⁺。

(7)将本申请实施例提供的式(ⅰ-b)溶解在氘代dmso中，测定其中的氢谱图，结果如图3所示，图3为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)溶解在氘代dmso中的氢谱图。

实施例2

本申请实施例提供了实施例1的式ⅰ-b结构的化合物的光热转换性能试验，包括：

将实施例1制得的式(ⅰ-b)和商业化icg(吲哚菁绿icg是一种用于医学诊断的花青染料)用去离子水稀释到1mm，2mm，3mm，4mm，5mm五个梯度的浓度，然后用808nm激光器照射5分钟，照射能量为2j/cm²，用近红外温度检测仪每隔1分钟检测环境温度，对照组用去离子水，测定实施例1制得的式(ⅰ-b)和商业化icg在照射能量为2j/cm²的808nm激光器照射下5分钟内的升温情况，结果如图4～图5所示，图4为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)和icg在照射能量为2j/cm²的808nm激光器照射下5分钟内的升温折线图；图5为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)在808nm激光器照射下5分钟内的红外热成像图，从图4和图5中得出结论，实施例1的探针具备高的光热转换功能，在5mm的浓度中照射10分钟可以升温71℃，同浓度下icg升温40℃，而对照组去离子水几乎没有温度变化。

实施例3

本申请实施例提供了实施例1的式ⅰ-b结构的化合物的细胞毒性试验，包括：

细胞培养：将肿瘤细胞(人前列腺癌pc3、乳腺癌mcf7、非小细胞肺癌a549和肝癌hepg2细胞株)和hacat表皮细胞接种于细胞培养瓶中放于37℃，5％co2环境中培养，培养基选用含10％胎牛血清和0.5％的双抗的1640培养基。细胞接种：将培养的细胞接种于96孔板中，细胞密度为8000个/ml，继续在37℃，5％co2环境中培养48小时。加梯度化合物溶液：去除96孔板中的培养基，用预冷的pbs洗涤3次，加入含不同梯度实施例1式(ⅰ-b)的1640完全培养基，继续在37℃，5％co2环境中培养24小时。加mtt溶液：去除96孔板中的培养基，加入用完全培养基稀释成5mg/ml的mtt溶液每个孔200μl，用锡纸包裹继续培养4小时后，除去溶液，加入dmso100μl，充分溶解附着在96孔板中的甲臜。测量细胞存活率：将96孔板转移到酶标仪中，设定扫描波长为577nm，测量其吸光度，然后根据吸光度的数值来确定细胞存活率。

如图6所示，图6为实施例1中得到的式(ⅰ-b)(0～5mm)与肿瘤细胞为(人前列腺癌pc3、乳腺癌mcf7、非小细胞肺癌a549和肝癌hepg2细胞株)和hacat表皮细胞的细胞毒性柱状图。实施例1的合成的化合物细胞毒性对癌细胞和正常细胞毒性较小，说明实施例1的式(ⅰ-b)对细胞的亲和性好。

实施例4

本申请实施例提供了实施例1的式ⅰ-b结构的化合物的线粒体共定位试验，包括：

培养细胞：将前列腺癌细胞pc3细胞接种于培养瓶后，使用10％胎牛血dmem培养基，37℃、5％co2环境中培养12～72小时。接种细胞：将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为2×10⁵个/ml，然后在37℃、5％co2环境中培养12～72小时。固定：弃去上步6孔板中的培养基，用预冷的1×pbs洗3次，然后再加入预冷的甲醇1.5ml常温避光放置10分钟，最后弃去甲醇并再用预冷的1×pbs洗3次，每次浸泡5分钟。

实施例1的式ⅰ-b结构的化合物染色：弃去甲醇，用预冷的1×pbs洗3次，然后加入2ml5μm的实施例1的式ⅰ-b结构的化合物然后在避光环境中放置15分钟。

mitogreen线粒体染色剂染色：在上述6孔板中加入1μm的mitogreen溶液1ml并37℃避光放置10分钟，然后再用预冷的1×pbs洗6次，每次浸泡5分钟。

dapi染色：在上述6孔板中加入1μm的dapi溶液1ml并37℃避光放置10分钟，然后再用预冷的1×pbs洗6次，每次浸泡5分钟。

激光共聚焦显微镜检测：检测过程中，dapi选用蓝光，mitogreen线粒体染色剂选用绿光，实施例1中得到的式(ⅰ-b)选用红光。结果如图7所示，图7为本申请实施例提供的式(ⅰ-b)和dapi，mitogreen线粒体染色剂染pc3细胞成像图。

图7为实施例1中得到的(ⅰ-b)在pc3癌细胞中与线粒体特异性染料mito-green，dapi复染，通过图7可知，实施例1化合物(ⅰ-b)的染色位置与mito-green高度重叠，而不与核染料dapi重叠，证明了染料染的位置为细胞质中的线粒体。

实施例5

本申请实施例提供了式ⅰ-c结构的化合物和式ⅰ-d结构的化合物的光热转换性能试验，包括：

按照本申请提供的噻唑橙衍生物的制备方法制得式ⅰ-c结构的化合物和式ⅰ-d结构的化合物。

将式ⅰ-c结构的化合物和式ⅰ-d结构的化合物分别用去离子水稀释到1mm，2mm，3mm，4mm，5mm五个梯度的浓度，然后用808nm激光器照射5分钟，照射能量为2j/cm²，用近红外温度检测仪每隔1分钟检测环境温度，对照组用去离子水，测定式ⅰ-c结构的化合物和式ⅰ-d结构的化合物在照射能量为2j/cm²的808nm激光器照射下5分钟内的升温情况，结果如表1，从表1看出，式ⅰ-c结构的化合物和式ⅰ-d结构的化合物具备高的光热转换功能，在5mm的浓度中照射5分钟可以升温到80℃附近，而对照组去离子水几乎没有温度变化。

表1

综上所述，本发明提供的新型噻唑橙衍生物具有靶向细胞线粒体的能力，在进入肿瘤细胞内具有红色荧光定位线粒体的效果，在808nm激光器的照射下会升温30～80℃，进而达到抑制富含线粒体的肿瘤细胞生长和增殖的目的。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。