一种4D打印智能水凝胶的制备、打印方法及其应用与流程

本发明渉及一种4d打印智能水凝胶的制备、打印方法及其应用，属于生物墨水技术领域。

背景技术：

3d生物打印技术是近几年来兴起的一项技术，其已被尝试用于构建复杂的组织和器官。4d打印使用与3d打印相同的技术，通过计算机编程沉积连续层中的材料来创建三维物体。但是，4d打印增加了时间转换的维度。因此，这是一种可编程物质，其在制造过程之后，印刷产品与环境的参数(湿度，温度等)反应并随着时间的推移，相应地改变其原有形式。

支架材料是组织工程研究的三个要素之一，要求既具备生物3d可打印性，又拥有相当的机械强度和细胞相容性。由于缺乏生物可打印性，在生物打印中水凝胶应用有限。4d打印技术通过增加时间这一维度，使3d打印出的图像在水中随着时间的推移发生形变。

生物4d打印作为一种新兴的技术，应用于生活的方方面面，其生物墨水的选择至关重要。但是由于一般生物墨水存在受外界刺激响应迟缓、流变学表征错综复杂、生物相容性差等缺陷，故制备出具有良好打印性、受外界刺激相应性和生物相容性的生物墨水是至关重要的。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种4d打印智能水凝胶的制备、打印方法及其应用。本发明是采用纤维素纳米纤维(cnf)为主要原料，编程制作复杂物体，其包含许多微小纤维的胶状物质，硬度及水溶性都能根据不同排列方式发生变化，在“编码”后将打印出的物体变为更加复杂的形状。该智能墨水具有良好打印性和4d形变性能，具有受外界刺激相应的性质以及生物相容性，未来能较广泛应用于仿生器官模型的构建。

为了实现上述发明目的，解决已有技术中所存在的问题，本发明采取的技术方案是：一种4d打印智能水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、向三颈烧瓶中依次加入40～60g的纤维素纳米纤维(nfc)、2～4g的n,n-二甲基丙烯酰胺、0.1～0.2g的光引发剂irgacure2959、0.1～0.2g的葡萄糖氧化酶、1～2g的葡萄糖、浓度为200μg/ml的3～4g内皮细胞生长因子及浓度为20μg/ml的1～2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；

步骤2、向三颈烧瓶中3～5次缓慢加入2～4g硅酸镁锂；

步骤3、采用10～15g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；

步骤4、取出三颈烧瓶，室温下反应0.5-1.0h，制得目标材料4d打印智能水凝胶；

所述制备方法制备的4d打印智能水凝胶的打印方法，包括以下步骤：

步骤1、构建三维模型，将模型导入到切片软件中，设置填充率为30～80％，填充方式选自六边形或交叉90°中的一种，然后导入本公司自组装3d生物打印机中进行打印；

步骤2、对3d生物打印机打印后得到的图案采用紫外灯连续照射5～8min，使其交联完全；

所述打印方法得到的图案在生物打印方面中的应用。

本发明有益效果是：一种4d打印智能水凝胶的制备、打印方法及其应用，其中制备方法包括以下步骤：(1)向三颈烧瓶中依次加入纤维素纳米纤维(nfc)、n,n-二甲基丙烯酰胺、光引发剂irgacure2959、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、内皮细胞生长因子及肝素，均匀混合后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；(2)向三颈烧瓶中每次缓慢加入硅酸镁锂，(3)采用去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；(4)取出三颈烧瓶，室温下反应，制得目标材料4d打印智能水凝胶。与已有技术相比，本发明制备的4d打印智能水凝胶具有良好打印性和4d形变性能，具有受外界刺激相应的性质。对该水凝胶进行包被后，在进行细胞培养的实验中，内皮细胞能够表现出良好的粘附性。

附图说明

图1是本发明实施例1中所打印填充率为30％、填充方式为六边形的切片图案和打印后的图案图。

图中：(a)为切片图案图，(b)为打印后的图案图。

图2是本发明实施例2中所打印填充率为60％、交叉90°的切片图案和打印后的图案图。

图中：(a)为切片图案图，(b)为打印后的图案图。

图3是本发明实施例3中所打印填充率为80％、交叉90°切片图案和打印后的图案图。

图中：(a)为切片图案图，(b)为打印后的图案图。

图4是本发明实施例3中填充率为80％、交叉90°时，打印后实物随时间发生形变过程图。

图中：(a)为形变0分钟实物图，(b)为形变3分钟实物图，(c)为形变5分钟实物图，(d)为形变10分钟实物图。

图5是本发明实施例5制备的4d打印智能水凝胶的g-ω曲线图。

图6是本发明实施例5制备的4d打印智能水凝胶的黏度随角频率变化曲线图。

图7是本发明实施例5制备的4d打印智能水凝胶的g′-g″-γ曲线图。

图8是本发明实施例5制备的4d打印智能水凝胶电镜下交联水凝胶图像图。

图9是细胞在本发明4d打印智能水凝胶打印实物上生长情况图。

图中：(a)为细胞生长3天时，显微镜观察明场图，(b)为细胞生长3天时，显微镜观察暗场图，(c)为细胞生长10天时，显微镜观察明场图，(d)为细胞生长10天时，显微镜观察暗场图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例14d打印智能水凝胶的制备

向三颈烧瓶中依次加入40g的纤维素纳米纤维(nfc)、2g的n,n-二甲基丙烯酰胺、0.1g的光引发剂irgacure2959、0.1g的葡萄糖氧化酶、1g的葡萄糖、浓度为200μg/ml的4g内皮细胞生长因子(ecgf)及浓度为20μg/ml的2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；再向三颈烧瓶中3次缓慢加入2g硅酸镁锂，采用10g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；取出三颈烧瓶，室温下反应0.5h，制得目标材料4d打印智能水凝胶。

实施例24d打印智能水凝胶的制备

向三颈烧瓶中依次加入50g的纤维素纳米纤维(nfc)、3g的n,n-二甲基丙烯酰胺、0.1g的光引发剂irgacure2959、0.1g的葡萄糖氧化酶、1.5g的葡萄糖、浓度为200μg/ml的4g内皮细胞生长因子(ecgf)及浓度为20μg/ml的2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；再向三颈烧瓶中4次缓慢加入2.5g硅酸镁锂，采用10g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；取出三颈烧瓶，室温下反应0.5h，制得目标材料4d打印智能水凝胶。

实施例34d打印智能水凝胶的制备

向三颈烧瓶中依次加入50g纤维素纳米纤维(nfc)、4gn,n-二甲基丙烯酰胺、0.1g光引发剂irgacure2959、0.1g葡萄糖氧化酶、1.5g葡萄糖、浓度为200μg/ml的4g内皮细胞生长因子(ecgf)及浓度为20μg/ml的2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；再向三颈烧瓶中3次缓慢加入4g硅酸镁锂，采用10g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；取出三颈烧瓶，室温下反应0.5h，制得目标材料4d打印智能水凝胶。

实施例44d打印智能水凝胶的制备

向三颈烧瓶中依次加入60g纤维素纳米纤维(nfc)、3gn,n-二甲基丙烯酰胺、0.1g光引发剂irgacure2959、0.1g葡萄糖氧化酶、2g葡萄糖、浓度为200μg/ml的4g内皮细胞生长因子(ecgf)及浓度为20μg/ml的2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；再向三颈烧瓶中3次缓慢加入2g硅酸镁锂，采用10g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；取出三颈烧瓶，室温下反应0.5h，制得目标材料4d打印智能水凝胶。

实施例54d打印智能水凝胶的制备

向三颈烧瓶中依次加入60g纤维素纳米纤维(nfc)、4gn,n-二甲基丙烯酰胺、0.1g光引发剂irgacure2959、0.1g葡萄糖氧化酶、2g葡萄糖、浓度为200μg/ml的4g内皮细胞生长因子(ecgf)及浓度为20μg/ml的2g肝素，均匀混合反应后置于打开的机械搅拌装置中，通入氮气进行保护；再向三颈烧瓶中5次缓慢加入4g硅酸镁锂，采用10g去离子水冲洗三颈烧瓶进料口径，将附着在瓶口的物质冲入三颈烧瓶中；取出三颈烧瓶，室温下反应0.5h，制得目标材料4d打印智能水凝胶。

实施例64d打印智能水凝胶打印实物

构建骨头三维模型，将模型导入到切片软件中，设置填充率30％，填充方式为六边形，导入3d打印机中利用实施例1制备的4d打印智能水凝胶进行打印。由打印后得到的图案采用紫外灯连续照射五分钟，使其交联完全。完全交联后的4d打印智能水凝胶放置到清水中，计时并观察其形变过程，用照片记录下来。为了方便成像，使用罗丹明b染色剂对4d打印智能水凝胶进行染色，如图1所示。

实施例74d打印智能水凝胶打印实物

构建骨头三维模型，将模型导入到切片软件中，设置填充率60％，填充方式为交叉90°，导入3d打印机中利用实施例2制备的4d打印智能水凝胶进行打印。打印后得到的图案用紫外灯连续照射五分钟，使其交联完全。完全交联后的4d打印智能水凝胶放置到清水中，计时并观察其形变过程，用照片记录下来。为了方便成像，使用罗丹明b染色剂对4d打印智能水凝胶进行染色，如图2所示。

实施例84d打印智能水凝胶打印实物

构建骨头三维模型，将模型导入到切片软件中，设置填充率80％，填充方式为交叉90°，导入3d打印机中利用实施例3制备的4d打印智能水凝胶进行打印。打印后得到的图案用紫外灯连续照射五分钟，使其交联完全。完全交联后的4d打印智能水凝胶放置到清水中，计时并观察其形变过程，用照片记录下来。为了方便成像，使用罗丹明b染色剂对4d打印智能水凝胶进行染色，如图3所示，打印后实物随时间发生形变过程图，如图4所示。

实施例9流变性能测试

应变动态扫描(粘弹性测试)：将实施例5制备的4d打印智能水凝胶样品放置于样品台上融化，平铺在平板和样品台之间，设置行板间距为1mm，剪切频率为1.0rad/s，动态应变范围设为0.1～100％，测定室温下弹性模量(g′)和粘流模量(g″)动态曲线，如图5所示。

稳态剪切稀化测试：将实施例5制备的4d打印智能水凝胶样品放置于样品台上融化，平铺在平板和样品台之间，设置行板间距为1mm，固定应变设为0.5％，调节剪切速率从0.1rad/s到100rad/s变换，测定4d打印智能水凝胶样品的表观黏度随剪切速率变化的关系曲线，如图6、图7所示。

实施例10电镜测试

观察交联状态下实施例5制备的4d打印智能水凝胶表面的电镜图像，如图8所示。

实施例11生物相容性测定

将实施例7中打印得到的图案取出切块，在75％的乙醇中浸泡两小时，去除液体后在通风下用紫外灯照射半小时。照射结束用pbs浸泡半小时后去除液体。将5％明胶在45℃水浴中完全融化，用无菌滴管吸取适量明胶放入盛有实施例1处理后的水凝胶图案的培养皿中，使其完全被覆盖。明胶风干后，将水凝胶图案转移到新无菌皿中，用同样的方法包被海藻酸钠。海藻酸钠风干后，转移水凝胶图案到新无菌培养皿中，用氯化钙溶液进行浸泡十分钟至水凝胶图案表面变白，去除液体。将适量消化好的人脐静脉内皮细胞(huvec)转移到盛有处理好的水凝胶图案的培养皿中，最后加入适量培养液，放置到细胞培养箱中进行培养。每两天换液并在显微镜下观察。所述细胞培养液成分为dmem-f12(主要培养基)、10％的nbcs和1％的双抗，所述细胞培养箱为150i细胞培养箱，所述显微镜为奥林巴斯ⅸ71倒置荧光显微镜。培养有细胞的水凝胶图案转移至新皿中，加入适量细胞培养液，依次加入1μmol/ml钙黄绿素和25μmol/1ml的pi并摇匀，放入培养箱中染色20min后将培养液吸出，加入pbs后置于摇床5～8min/次，清洗三次，清洗结束后加入适量pbs观察拍照，如图9所示。