1.利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)小浮萍叶状体的预培养
取状态良好的小浮萍叶状体置于ms培养基上预培养,用于后续基因转化;
2)目的基因的扩增
提取弧菌基因组总dna作为模板,并利用pcr反应获得目的基因,即获得pcr产物omp1基因序列;
反应体系的引物:omp1-f:5′-atgaagaaggtaagtsnyattg-3,omp1-r:5′-ttacccccgagcttcnrc-3′;
3)omp1基因序列的修饰
通过overlappcr在omp1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、pr1b信号肽序列和ncol1酶切位接头序列,同时在其3’端连接sal1保护接头序列、myc蛋白标签序列、kdel驻留信号肽序列和bamh1接头保护序列,获得的功能序列修饰的omp1基因如seqidno.1所示;
4)omp1基因双元植物表达载体的构建
将上述得到的功能序列修饰的omp1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pmyc2017上,获得植物表达载体pmyc2017-omp1,采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌dh5ɑ进行扩增,并从大肠杆菌dh5ɑ中提取和纯化pmyc2017-omp1载体,得到pmyc2017-omp1质粒载体;
5)利用基因枪法将上述得到的pmyc2017-omp1质粒载体转入步骤1)培养的小浮萍中;
6)对步骤5)得到的小浮萍进行选择培养,并筛选出omp1基因表达的小浮萍转化植株。
2.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,还包括步骤7)小浮萍转化植株的鉴定:
从最初的小浮萍转化植株中提取总基因组dna,用pcr验证omp1基因的存在,来筛选小浮萍转化植株;
提取小浮萍转化株系的总rna,以总rna为模板,进行rt-pcr鉴定omp1基因发生转录。
3.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,所述步骤1)中小浮萍叶状体的预培养采用混合营养培养,具体培养条件:ms培养基中添加有机碳源,25~28℃、光周期为14l:10d,光照强度为5000lux。
4.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,所述步骤3)中pst1酶切位保护序列:5’-tgcactgcag;
烟草组成型启动子增强序列:
aatactagcctattttatttcaattttagcttaaaatcagccccaattagccccaatttcaaattcaaatggtccagcccaattcctaaataacccacccctaacccgcccggtttccccttttgatccaggccg;
pr1b信号肽序列:
atgggattttttctcttttcacaaatgccttcattttttcttgtctctacacttctcttattcctaataatatctcactcttcccgtgcc;
ncol1酶切位接头序列:5’–ccatgg;
sal1保护接头序列:5’-ggtgggtcgac;
myc蛋白标签序列:5’-gaacagaaactgatctctgaagaagatctg;
kdel驻留信号肽序列:5’-aaggatgagctc;
bamh1接头保护序列:5’-ggatccgcg。
5.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,所述步骤5)中基因枪法进行基因转化的具体过程:
金粉准备:a、取金粉40mg,放入lml无水乙醇中,置于1.5mleppendorf管内;b、于冰上,做超声处理;c、用乙醇洗涤,离心去除乙醇;d、用无菌水洗涤,离心去除无菌水;e、在冰上重复c和d步骤2次;f、加入1ml乙醇或无菌水,使金粉重悬,取出50μl金粉重悬液于1.5ml新eppendorf管内,-20℃储存备用;
dna微子弹的制备:a、将5μl、1μg/μl的pmyc2017-omp1质粒dna加入到装有50μl金粉重悬液的离心管内,涡旋混匀;b、加入50μl、2.5mo1/l的cacl2,涡旋振荡;c、加入20μl、0.1mo1/l的亚精氨,充分涡旋振荡,置于冰上15min;d、超声处理三次,离心,弃上清,加250μl、70%乙醇,超声处理,离心,弃上清;e、加入60μl无水乙醇重悬金粉,再次超声处理5秒,以分散金粉颗粒;
基因枪轰击操作:a、超净台紫外灯灭菌20min;b、将载体膜、可裂膜和阻拦网事先置于70%乙醇中浸泡,在灭菌滤纸上自然风干;将气瓶调节压力到1500psi;c、取10μldna包裹好的微粒悬浮液加到载体膜中央,稍微晾干后马上进行轰击;d、将可裂膜、阻拦网、涂有微粒的载体膜安装进固体装置中,射击参数为:轰击微粒运行距离为9/12cm各一次,压力1350psi,真空度25mmhg;e、轰击结束后,将小浮萍置于等渗培养基ms培养基上,25℃,14h/10h培养一天一夜。
6.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,所述步骤6)中选择培养的选择培养基:1/2ms培养基、1%蔗糖、0.8%琼脂、300mg/lcefotaximesodium、60mg/lhygromycin,且其ph值为5.8。
7.如权利要求6所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法,其特征在于,所述步骤6)中选择培养的培养条件:25~28℃、光周期为14l:10d,光照强度为5000lux;选择培养至少一个月,且选择培养过程中每周更换一次相同的选择培养基。
8.采用如权利要求1~7任一项所述的方法生产的鱼类抗弧菌病口服疫苗在制备鱼饲料或鱼饲料添加剂中的应用。