本发明属于分子生物学与基因工程
技术领域：
，具体涉及一种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用。
背景技术：
：近年来，我国水产养殖业发展迅猛，随着高密度、集约化、大规模水产养殖业的出现，鱼类疾病频繁爆发。水产养殖向高密度、集约化发展的同时，鱼类病害问题日益突出。其中弧菌病害是危害海水养殖鱼类最严重的细菌病害之一。弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病。弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌，是海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌，该病在全球范围内广泛发生,其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失,还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡。近几年来，我国的海水养殖病害情况非常严重。据统计，在我国已发现的几十种海水养殖病害中，以弧菌病对海水养殖造成的损失最大，几乎所有海水养殖鱼类都有感染弧菌，如石斑鱼、真鲷、卵形鲳鲹、眼斑拟石首鱼、军曹鱼等均曾患弧菌病。弧菌病严重发生时，鱼类死亡率高达90％以上，每年直接经济损失达数百亿元，给养殖生产带来巨大的经济损失，严重影响了我国海水养殖业的发展。传统防治细菌性病原菌的方法是向水体中或者鱼类饲料中添加抗生素或者直接注射抗生素等方法，这种方法不仅成本高而且由此也带来一系列问题，包括滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等不良后果。因此，弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。但一直以来缺少相应的疫苗用于防控，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。利用小浮萍增殖快、培养简便和鱼类可食等优势，将小浮萍经过改造后建立生物反应器生产医药和生物活性物质，可以表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等活性物质和药品。小浮萍生物反应器与动物细胞生物反应器相比，表达的蛋白含量更高，分离纯化更简便，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，增加了效力，减少了副作用，大大降低了成本。小浮萍生物反应器制药的产品质量、成本和安全方面已显现出优势，并很快得到科学家和生物制药业的认可。有科学家预测，未来5-10年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统，而小浮萍凭借自身的特点将在生物反应器制药方面展现独特的应用优势，具有巨大的开发应用前景。开发小浮萍作为新的药用蛋白生物反应器符合时代需求，对于解决越来越突出的滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等问题有着重要的实际价值。由于小浮萍易于转化并能提供廉价的蛋白质源，因此利用转基因浮萍开发新型疫苗是一种最经济有效的途径,并且具有相当大的潜能。技术实现要素：本发明的目的是针对现有原核和真核生物为宿主的生物反应器表达外源蛋白表达量低、可溶性差、无生物活性和不安全等缺点,利用自然水体常见的可食用的小浮萍作为生物反应器,提供了一种利用小浮萍作为生物反应器表达表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)小浮萍叶状体的预培养取状态良好的小浮萍叶状体置于ms培养基上预培养，用于后续基因转化；2)目的基因的扩增提取弧菌基因组总dna作为模版，并利用pcr反应获得目的基因，即获得pcr产物omp1基因序列；反应体系的引物:omp1-f:5′-atgaagaaggtaagtsnyattg-3，omp1-r:5′-ttacccccgagcttcnrc-3′；3)omp1基因序列的修饰通过overlappcr在omp1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、pr1b信号肽序列和ncol1酶切位接头序列，同时在其3’端连接sal1保护接头序列、myc蛋白标签序列、kdel驻留信号肽序列和bamh1接头保护序列，获得的功能序列修饰的omp1基因如seqidno.1所示；4)omp1基因双元植物表达载体的构建将上述得到的功能序列修饰的omp1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pmyc2017上，获得植物表达载体pmyc2017-omp1，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌dh5ɑ进行扩增，并从大肠杆菌dh5ɑ中提取和纯化pmyc2017-omp1载体，得到pmyc2017-omp1质粒载体；5)利用基因枪法将上述得到的pmyc2017-omp1质粒载体转入步骤1)培养的小浮萍中；6)对步骤5)得到的小浮萍进行选择培养，并筛选出omp1基因表达的小浮萍转化植株。进一步的，上述方法还包括步骤7)小浮萍转化植株的鉴定：从最初的小浮萍转化植株中提取总基因组dna，用pcr验证omp1基因的存在，来筛选小浮萍转化植株；提取小浮萍转化株系的总rna，以总rna为模板，进行rt-pcr鉴定omp1基因发生转录。进一步的，所述步骤1)中小浮萍叶状体的预培养采用混合营养培养，具体培养条件：ms培养基中添加有机碳源，25～28℃、光周期为14l:10d，光照强度为5000lux。进一步的，所述步骤3)中pst1酶切位保护序列：5’-tgcactgcag；烟草组成型启动子增强序列：aatactagcctattttatttcaattttagcttaaaatcagccccaattagccccaatttcaaattcaaatggtccagcccaattcctaaataacccacccctaacccgcccggtttccccttttgatccaggccg；pr1b信号肽序列：atgggattttttctcttttcacaaatgccttcattttttcttgtctctacacttctcttattcctaataatatctcactcttcccgtgcc；ncol1酶切位接头序列：5’–ccatgg；sal1保护接头序列：5’-ggtgggtcgac；myc蛋白标签序列：5’-gaacagaaactgatctctgaagaagatctg；kdel驻留信号肽序列：5’-aaggatgagctc；bamh1接头保护序列：5’-ggatccgcg。进一步的，所述步骤5)中基因枪法进行基因转化的具体过程如下：金粉准备：a、取金粉40mg，放入lml无水乙醇中，置于1.5mleppendorf管内；b、于冰上，做超声处理；c、用乙醇洗涤，离心去除乙醇；d、用无菌水洗涤，离心去除无菌水；e、在冰上重复c和d步骤2次；f、加入1ml乙醇或无菌水，使金粉重悬，取出50μl金粉重悬液于1.5ml新eppendorf管内，-20℃储存备用；dna微子弹的制备：a、将5μl、1μg/μl的pmyc2017-omp1质粒dna加入到装有50μl金粉重悬液的离心管内，涡旋混匀；b、加入50μl、2.5mo1/l的cacl2，涡旋振荡；c、加入20μl、0.1mo1/l的亚精氨，充分涡旋振荡，置于冰上15min；d、超声处理三次，离心，弃上清，加250μl、70％乙醇，超声处理，离心，弃上清；e、加入60μl无水乙醇重悬金粉，再次超声处理5秒，以分散金粉颗粒；基因枪轰击操作：a、超净台紫外灯灭菌20min；b、将载体膜、可裂膜和阻拦网事先置于70％乙醇中浸泡，在灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到1500psi；c、取10μldna包裹好的微粒悬浮液加到载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击；d、将可裂膜、阻拦网、涂有微粒的载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为9/12cm各一次，压力1350psi，真空度25mmhg；e、轰击结束后，将小浮萍置于等渗培养基ms培养基上，25℃，14h/10h培养一天一夜。进一步的，所述步骤6)中选择培养的选择培养基：1/2ms培养基、1％蔗糖、0.8％琼脂、300mg/lcefotaximesodium、60mg/lhygromycin，且其ph值为5.8。进一步的，所述步骤6)中选择培养的培养条件：25～28℃、光周期为14l:10d，光照强度为5000lux；选择培养至少一个月，且选择培养过程中每周更换一次相同的选择培养基。另外，本发明还提供了采用上述方法生产的鱼类抗弧菌病口服疫苗在制备鱼饲料或鱼饲料添加剂中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果：(1)本发明提供的这种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法采用优化得到的适宜于小浮萍的特异表达启动子和信号肽，构建专用双元表达载体，结合一种利用基因枪的、特有的稳定遗传转化方法将包含疫苗重组蛋白基因的双元表达载体转入小浮萍，获得表达疫苗重组蛋白的转基因株系，实现抗弧菌病疫苗蛋白在小浮萍中的高效表达和积累，大大提高了小浮萍作为生物反应器表达外源蛋白的可操作性，克服现有其他表达系统外源蛋白表达量低、可溶性差、无生物活性等问题,以及杜绝动物病原菌的污染问题。(2)本发明提供的这种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法充分利用小浮萍结构简单，生长繁殖快，生物量大，富含淀粉和蛋白质等优势，将其作为生物反应器，生产效率高、成本低、可口服，解决了以往注射免疫劳动成本高的问题，也为利用小浮萍表达其他抗病物质打下了基础。(3)本发明提供的这种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法利用基因枪法进行基因转化，与通常采用的农杆菌介导转化方法相比，操作更为简便，转化效率高，转化周期缩短到9-10周左右。(4)将本发明提供的这种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法生产得到的表达抗弧菌病疫苗的小浮萍作为鱼类的饲料或饲料添加剂使用，可以通过刺激鱼类肠道等免疫器官产生抗体，达到防病、治病的效果。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：1、小浮萍叶状体的预培养：取状态良好的小浮萍叶状体置于ms培养基上预培养，用于后续基因转化。本实施例采用混合营养培养的方式对小浮萍叶状体进行预培养，具体过程如下：ms培养基中添加有机碳源，在25～28℃、光周期为14l:10d，光照强度为5000lu条件下培养；其中，有机碳源可以选用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖和蔗糖中任一种；更优选的，选用葡萄糖作为有机碳源。对比本实施例的混合营养培养与传统的光合自养(即ms培养基中不添加有机碳源)、异养(即黑暗条件培养)的培养方式培养小浮萍，小浮萍在不同营养条件下最大生物量、淀粉和蛋白质产量如表1所示。结果表明，小浮萍在混合营养条件下获得的生物量、淀粉、蛋白质含量显著高于其它两种培养方式，本实施例采用混合营养培养方式对小浮萍进行预培养更有利于后续基因转化。表1：2、目的基因的扩增：在28℃培养箱中过夜培养溶藻弧菌(vibrioalginolitycus)，用于提取细菌dna。1)将1-5ml细菌培养物以10,000rpm离心1分钟；2)除去上清液，获得溶藻弧菌菌体备用；3)使用细菌dna提取试剂盒(tianampbacteriadnakit)进行溶藻弧菌dna的提取；4)通过nanodrop测定dna浓度，将提取物稀释至50μg/ml浓度。以提取的弧菌dna作为模版，利用pcr反应获得目的基因，即获得pcr产物omp1基因序列。pcr反应体系的组成如表2所示：表2：反应体系的引物:omp1-f:5′-atgaagaaggtaagtsnyattg-3；omp1-r:5′-ttacccccgagcttcnrc-3′。pcr反应条件：95℃变性5min；95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。凝胶电泳：称取0.6g琼脂糖，加入50ml的1×tae，微波加热2分钟至沸腾，冷却2-3分钟，倒入插有梳子的凝胶电泳槽，凝固45分钟；用移液枪取1μldna加载缓冲液(trans)，5μlpcr产物，混合并加入到凝胶电泳孔中；同时在第一泳道加入5μl1kbmaker；设置凝胶电泳仪电压180v，进行凝胶电泳大约15-20分钟；然后将凝胶在溴化乙锭溶液中染色10分钟。在300nmuv下观察染色凝胶，成像，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因dna。3、omp1基因序列的修饰：通过overlappcr在omp1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、pr1b信号肽序列和ncol1酶切位接头序列，同时在其3’端连接sal1保护接头序列、myc蛋白标签序列、kdel驻留信号肽序列和bamh1接头保护序列，获得的功能序列修饰的omp1基因如seqidno.1所示。其中，pst1酶切位保护序列：5’-tgcactgcag；烟草组成型启动子增强序列：aatactagcctattttatttcaattttagcttaaaatcagccccaattagccccaatttcaaattcaaatggtccagcccaattcctaaataacccacccctaacccgcccggtttccccttttgatccaggccg；pr1b信号肽序列：atgggattttttctcttttcacaaatgccttcattttttcttgtctctacacttctcttattcctaataatatctcactcttcccgtgcc；ncol1酶切位接头序列：5’–ccatgg；sal1保护接头序列：5’-ggtgggtcgac；myc蛋白标签序列：5’-gaacagaaactgatctctgaagaagatctg；kdel驻留信号肽序列：5’-aaggatgagctc；bamh1接头保护序列：5’-ggatccgcg。4、omp1基因双元植物表达载体的构建：将上述得到的功能序列修饰的omp1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pmyc2017上，获得植物表达载体pmyc2017-omp1；采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌dh5ɑ进行扩增，并从大肠杆菌dh5ɑ中提取和纯化pmyc2017-omp1载体，得到pmyc2017-omp1质粒载体。其中，功能序列修饰的omp1基因与植物表达双元载体pmyc2017连接的具体步骤如下：1)根据选择的植物表达载体设计引物，在上述获得的功能序列修饰的omp1基因两端加上酶切位点，pcr及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，pcr检测；2)使用相同的内切酶同时双酶切上一步获得的目的基因和植物表达载体，反应体系：1μldna或植物表达载体，1μl内切酶a，1μl内切酶abuffer，1μl内切酶b，1μl内切酶bbuffer，补水至20μl，37℃培养至少4h；3)将上述双酶切目的基因与双酶切植物表达载体连接，10μl反应体系为：2×rapidligationbuffer5μl，酶切植物表达载体1μl，酶切目的基因3μl，t4dnaligase1μl，反应体系于4℃过夜。采用电转化的方法将植物表达载体pmyc2017-omp1转化至大肠杆菌dh5ɑ进行扩增，具体步骤如下：1)每50μl大肠杆菌dh5ɑ电转感受态细胞中加入2μl植物表达载体pmyc2017-omp1，置于冰上9-11分钟，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min；2)打开电转仪，调节电压为2kv，将步骤1)过夜混合物转移至预冷的电极杯底部轻轻敲击电极杯；3)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μlsoc液体培养基，重悬细胞后转移至1.5ml灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时。4)将步骤3)的转化产物于添加了50mg/l卡那霉素的固体lb培养基涂布平板，37℃过夜培养；5)挑取3-5个单克隆置于5ml液体lb培养基摇菌，扩大培养；6)采用康为世纪质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒后于-20℃保存，并进行pcr检测和序列分析。检测表明，通过overlappcr获得的omp1基因成功转化到大肠杆菌dh5ɑ中。5、利用基因枪法将pmyc2017-omp1质粒载体转入小浮萍：(1)金粉准备(洗至悬液较清亮):a、取金粉40mg，放入lml无水乙醇中，置于1.5mleppendorf管内；b、于冰上，超声处理超声参数如表3所示；表3：功率超声间隔循环次数200w-250w9sec2sec10cyclesc、10000rpm离心1mim，弃乙醇；d、加入1ml无菌水，充分振荡混匀后，10000rpm离心lmin，弃上清；e、加入无水乙醇400μl，置于冰上超声处理，10000rpm离心lmin，弃上清；f、加入lml无菌水，振荡混匀，10000rpm离心lmin，弃上清；g、再加入无水乙醇400μl，置于冰上超声处理，10000rpm离心lmin，弃上清；h、加入lml无菌水，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清；i、最后加入1ml乙醇(或无菌水)，使金粉重悬，取出50μl金粉重悬液于1.5ml新eppendorf管内，-20℃储存备用或接着进入下一步。(2)dna微子弹的制备a、将5μlpmyc2017-omp1质粒dna(1μg/μl)加入到装有50μl金粉重悬液的1.5mleppendorf管内(冰上操作)，涡旋混匀；b、加入50μl2.5mo1/l的cacl2，涡旋振荡；c、加入20μl0.1mo1/l的亚精氨(spermine，现配现用)，充分涡旋振荡，置于冰上15min；d、超声处理，5秒一次，共三次，4200g离心10秒，弃上清，加250μl70％乙醇，超声处理(方法同上)，4200g离心10秒，弃上清；e、加入60μl无水乙醇重悬金粉，再次超声处理5秒，以分散金粉颗粒。下步操作中，吸取10μl包被质粒dna的金粉重悬浮液，点于微弹载体中心。(3)基因枪轰击操作(无菌条件下进行)a、超净台紫外灯灭菌20min；b、载体膜，可裂膜，阻拦网及holder等事先置于70％乙醇中浸泡，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到1500psi；c、10μl已用dna包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击；d、将可裂膜，阻拦网，涂有微粒的载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为9/12cm各一次，压力1350psi，真空度25mmhg；e、轰击结束后，将小浮萍置于等渗培养基ms培养基上，25℃14h/10h培养一天一夜(酌情延长)。6、小浮萍选择培养，并筛选出omp1基因表达的小浮萍转化植株：将上述暗培养后的小浮萍转入选择培养基：1/2ms培养基、1％蔗糖、0.8％琼脂、300mg/lcefotaximesodium(头孢噻肟钠)、60mg/lhygromycin(潮霉素)、ph值为5.8，进行转化植株的筛选，选择培养需至少保持一个月，观察空白对照组全部死亡，每周更换一次选择培养基，随后进行pcr阳性株系检测。7、小浮萍转化植株的鉴定：从最初的小浮萍转化植株中提取总基因组dna，用pcr验证omp1基因的存在，来筛选小浮萍转化植株；提取小浮萍转化株系的总rna，以总rna为模板，进行rt-pcr鉴定omp1基因发生转录。实施例2：本实施例以弧菌对石斑鱼进行攻毒实验，并采用a组、b组、c组三种不同处理方式对石斑鱼进行处理，a组为向石斑鱼注射生理盐水，b组为饲小浮萍口服疫苗，c组为注射弧菌疫苗，实验结果如4所示。表4：组别实验鱼数(尾)存活鱼数(尾)存活率相对保护率a组30620％--b组301653％41.3％c组302790％87.5％由表4可知，免疫组(即b组和c组)与对照组(即a组)相比，石斑鱼的死亡率显著下降，且口服小浮萍疫苗对石斑鱼的相对保护率可达到41％。本发明生产周期短，小浮萍大约2-3天繁殖一代，生物量每36小时翻一番；表达的蛋白含量高，约占鲜重的30％左右；便于分离和纯化表达产物，表达的外源蛋白可直接分泌到培养液中，价值培养成分简单，便于分离纯化，小浮萍还可以直接食用；表达产物安全，小浮萍的整个生活史可以在严格的无菌条件下完成，排除了微生物和动物细胞反应器中病院微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病原微生物的程序，大大降低了成本；表达产物易于糖基化，增加了效力，减少了副作用；成本低于50usd/g，而动物细胞生物反应器的生产成本高达300-10000usd/g。以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。序列表<110>青萍湾（武汉）生物科技有限责任公司<120>利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用<130>wh2008174-1<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1567<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcactgcagaatactagcctattttatttcaattttagcttaaaatcagccccaattag60ccccaatttcaaattcaaatggtccagcccaattcctaaataacccacccctaacccgcc120cggtttccccttttgatccaggccgatgggattttttctcttttcacaaatgccttcatt180ttttcttgtctctacacttctcttattcctaataatatctcactcttcccgtgccccatg240gatgaagaaggtgtccgtgatcgccgccgccgtggccgccaccctcgccgccggctccgc300cttcgccgtggacttccacggctacatgagggccggcgtgggcgtgaacgccgacggcgg360ccagcagctcaccttcgagaagaacgagaccggcaggctcggcaacgagtccgacatcta420cggcgagatccagctcggcaaggaggtgtacaacaacaacggcaagaccttctacgtgga480ctccatggtggccatgacctccaacggctccaacgactgggagtccacctccgccaactg540cggcctcgacaacggcgaggtgaagtgcgtggacgacgcccagttcgccctcaggcagtt600caacgtgcaggccaagggcctcctcaacttcgcccccgaggccaccctctgggccggcaa660gaggtactaccagaggcacgacatccacatctccgacttctactactggaacatctccgg720cgccggcgccggcgtggagggcatcgaggccggccccggcaaggtgtccttcgcctgggt780gaggaacgacaggggcgacatcgccgaccccggcaacgacggcggcgccaccaacgtgaa840caccctcgacgtgaggtacgccggcctccccctctgggacaacggctccctcgagatggg900cctcaactacgccatcctcaacgagaccgacgccgcccccaacggcaccaaggacgccaa960gaacggcgtgatgttcaccgccgagctcacccagggcctcgacgccggcttcaacaagac1020cgtgctccagtacggcaccgagggctactccaagaccatggccttctacggcgacggctc1080ctggtacggcgccgaggccgacaacggcgcctccggctacaggctcatcaactggggcgt1140gatcggcatgggcgactcctgggagatgggccaccagctcgtgtacggcgtgggcgagga1200catgtgggccggccaggacaagtgggagaccatgtccgtggtggtgaggcccatgtacaa1260gtgggacgacaaccacaagaccatcttcgaggccggctacgccatcgacgacaacgacgg1320cgaggagaacaagtacggcaagctcaccgtggcccaggcctggtccgccggctcctcctt1380ctgggccaggcccgagatcagggtgtacgcctcctacctcaccgccgacaaggaggacaa1440ctccaacaccttcgacaacggcaggtccgacgacaccttccagttcggcgtgcaggtgga1500ggcctggtgggtcgacgaacagaaactgatctctgaagaagatctgaaggatgagctcgg1560atccgcg1567当前第1页12