一种油菜S-腺苷-L-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因BnPMT6及其应用的制作方法

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种油菜含油量相关的s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnpmt6及其应用。

背景技术：

植物油是人类营养与能量的重要来源，油料作物主要包括大豆、油菜、花生等。甘蓝型油菜(brassicanapusl.；aacc,2n＝38)是植物食用油的主要来源之一，在我国油料作物中占重要地位。油菜种子含油量与产量相关性分析数据显示，油菜种子含油量增产1％相当于油菜产量提高2-3％，因此提高油菜籽含油量对提升油菜产油率具有重要意义。菜籽油的主要成分为各种饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸中油酸含量最高，占总脂肪酸的50％以上。研究表明，高油酸植物油具有良好的保健作用，适当摄取各脂肪酸合理配比的高油酸植物油可以有效降低人类心血管疾病的发生。同时，高油酸植物油热稳定性强，高温不易被氧化，大大降低了因高温而产生有害物质的风险，符合我国传统高温烹饪习惯的需求。因此，提高油菜籽含油量及改良油脂品质是油菜育种的重要目标。

种子含油量与植物光合作用、种子发育、物质转运、脂质合成、积累和降解等多个生物学途径密切相关。研究表明，拟南芥中有超过700个基因参与了这一过程。通过超表达脂肪酸合成途径中的乙酰辅酶a羧化酶accase基因、tag合成途径基因(lpaat、dgat1)、转录因子(lec1、wri1)等，均可以提高油菜含油量。另外，还可以通过理化诱变技术、rnai技术、t-dna插入法、转座子标签法、crisprcas9技术等创建高油油菜突变体。目前，参考拟南芥油脂代谢途径确定调控油菜含油量基因，从而开发高含油量材料是油菜高油育种的分子基础，以此创造出的新材料已广泛应用于油菜高油育种。

本发明从油菜中克隆了一个s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnpmt6(该基因尚未被报道参与了种子油脂合成)。研究表明，在种子特异性表达启动子napin的作用下将bnpmt6基因在拟南芥或者油菜种子中过表达，可以显著降低种子的含油量。而利用crispr/cas9技术创建的bnpmt6突变体油菜种子的含油量显著升高。此外，过表达及突变体油菜种子中油酸含量与其对应的野生型(wt)的相比，均有显著差异。此结果暗示bnpmt6基因在调控种子含油量及脂肪酸组成方面有重要作用，可以为油菜高油育种及油脂品质改良提供新的理论及新基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一个油菜含油量相关的s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因，该基因编码s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶，在油菜a5和c5染色体上各有一个拷贝，分别是bnaa05.pmt6(bnaa05g28570d)和bnac05.pmt6(bnac05g42890d)，该基因的核苷酸序列分别如序列表seqidno:1和seqidno:2所示，由1755bp和1758bp组成；该基因编码的蛋白质序列分别如序列表seqidno:3和seqidno:4所示，分别编码584和585个氨基酸。可以采用pcr技术从基因组、mrna和cdna中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。

本发明的另一个目的在于构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加一种种子特异表达的启动子napin，构建含有s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnac05.pmt6的重组表达载体，为了便于对转基因植物进行筛选，表达载体上加入了抗生素标记物。

本发明提供一种获得高含油量作物的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnpmt6的crispr/cas9基因编辑载体转化到作物的基因组中，利用crispr/cas9基因编辑技术获得基因bnpmt6功能缺失的作物品种。

本发明的一个特点在于通过获得过表达和突变体材料，分析了转化材料的含油量，发现bnpmt6负调控含油量的积累，同时还调控脂肪酸组成。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，如：pbiloxp-napin(中国农业科学院油料作物研究所提供)、phse401(中国农业大学陈其军课题组提供)等。

本发明获得的高含油量突变体油菜，在其营养生长与生殖生长时期与正常植株没有明显的差异，该遗传资源在油菜高油育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：bnpmt6基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2：构建的植物表达载体napin-pbiloxp-bnac05.pmt6的质粒图谱。

图3：油菜bnpmt6突变体的获得和鉴定。sgrna位于基因bnaa05.pmt6和bnac05.pmt6的第二个外显子区，获得的5个突变体的靶位点的编辑情况：l1、l20和l21为bnaa05.pmt6和bnac05.pmt6均被编辑的双突，l4为bnac05.pmt6被编辑的单突，l7为bnaa05.pmt6被编辑的单突。

图4：bnac05.pmt6基因转化拟南芥的含油量表型鉴定。(a)拟南芥材料wt和转基因株系(oe1、oe4)的含油量分析；(b)拟南芥材料wt和转基因株系的脂肪酸组成分析。每个材料使用6个独立line。*表示在student’sttest中p<0.05，**表示在student’sttest中p<0.01。

图5：bnpmt6在油菜的表型鉴定。利用近红外分析油菜种子含油量，l1、l20和l21是bnaa05.pmt6和bnac05.pmt6的crispr双突变体，l4是bnac05.pmt6的crispr突变体，l7是bnaa05.pmt6的crispr突变体。oe5、oe6和oe15是超表达株系。每个株系有6-8个不同单株，*和**分别表示在student’sttest中p<0.01和p<0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(newyork：coldspringharborlaboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。

实施例1bnpmt6基因的克隆

pmt6基因编码s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶，在油菜a5和c5染色体上各有一个拷贝，分别命名为bnaa05.pmt6(bnaa05g28570d)和bnac05.pmt6(bnac05g42890d)。cds序列分别为序列表seqidno:1和seqidno:2所示的序列，含有完整的orf阅读框及起始密码子atg，它们分别编码584和585个氨基酸(分别见序列表seqidno:3和seqidno:4所示)，通过blast比对发现这2个拷贝蛋白同源性为94％，其相似度很高。随机选基因bnac05.pmt6进行克隆。

(1)rna的提取

总rna的提取采用全式金公司的tanszol(目录号et101)，取甘蓝型油菜叶片于液氮中研磨粉碎，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml的transzol，上下剧烈颠倒数次使之充分混匀，室温静置5分钟；加0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；10000xg4℃离心15分钟；转移无色的水相于新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟；10000xg4℃离心10分钟，去上清；加1ml75％乙醇(depc处理的水配制)，剧烈涡旋；7500xg4℃离心5分钟；弃上清，室温晾干沉淀；沉淀溶于50-100μlrna溶解液中；55℃孵育10分钟。取lμl抽提的总rna在nanodrop下测定rna浓度，依据1.8＜od260/od280＜2.0鉴定rna纯度。同时取lμl进行1％agrose电泳，检测完整性。

(2)cdna的合成

反转录使用的是全式金one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(目录号ae311)。以5μg总rna为模板，依次加入anchoredoligo(dt)18primer1μl，2×esreactionmix10μl，rt/rienzymemix1μl，gdnaremover1μl，rnase-freewater补充至20μl。将以上体系轻轻混匀后置于42℃30min，此步是合成第一链cdna和去除gdna。85℃加热5秒钟失活rt/ri和gdnaremover。加入180μlrnase-freewater溶解合成的cdna，待用。

(3)bnpmt6基因的扩增

以上述cdna为模板，用正向引物pmt6-f1序列为5’-gcgcccgggaccatggccagaggttacaacgtgtt-3’，反向引物pmt6-r1序列为5’-gcgggcgcgcctcatttgtcgtcgtcgtccttgtagt-ccatg-atgattgcccagaat-3’，扩增得到含有bnac05.pmt6全长cds的片段。采用i-5^tm2×high-fidelitymastermix(tsingkebiologicatechnology)进行pcr扩增。pcr扩增体系如下：

pcr扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，34circles；72℃总延伸5min。

扩增后产物通过琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，扩增获得1758bp的bnac05.pmt6全长，产物挖胶回收使用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(http://www.tiangen.com/)。

实施例2bnpmt6基因过表达转化载体的构建

(1)对上述获得的bnac05.pmt6片段用快速限制性内切酶xmai和asci进行双酶切，双酶切体系如下：

酶切反应在37℃水浴锅进行，时间1小时。酶切产物用天根的dna纯化试剂盒回收。

(2)酶切产物连接到载体pbiloxp，该载体含有种子特异表达基因的napin启动子和抗生素标记物，具体可参考文献：thebngrf2gene(grf2-likegenefrombrassicanapus)enhancesseedoilproductionthroughregulatingcellnumberandplantphotosynthesis。

连接方法如下：

(3)转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取3个阳性克隆送样测序，分析结果显示，bnac05.pmt6基因的cds序列成功连接上载体，即成功构建了转化植株的植物表达载体napin-pbiloxp-bnac05.pmt6(如图2所示)。

(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株gv3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。导入方法如下：

a.清洗电转杯：先用纯水洗，再用超纯水洗，倒掉，再用无水乙醇清洗(用1ml枪头吹打)，倒掉无水乙醇，置于超净台晾干；

b.取农杆菌感受态gv310120μl；

c.取构建正确的重组质粒0.8μl，加入到20μl感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；

d.将洗好吹干的电转杯置于冰中预冷，再将上述混合液靠杯壁打入；

e.将电转仪调至1800v；

f.将电转杯从冰中取出，用吸水纸擦干净电转杯外壁；

g.将电转杯放入仪器，连续按两下“push”键，几秒钟之后听到“滴”的一声则成功；

h.电击成功后，向电转杯中加入400μl无抗lb，吸打几下，转移到无菌离心管中；

i.28℃活化2h左右，取100μl涂到含有双抗(庆大霉素和卡那霉素)，用封口膜封好，倒置于28度培养箱培养2天，挑斑检测。

(5)农杆菌菌落检测

挑选菌落于双抗(庆大霉素和卡那霉素)lb中，28℃培养2小时，取适量菌液进行pcr检测，保存阳性农杆菌菌液。

实施例3bnpmt6-crispr载体的构建

利用中国农业大学生物学院陈其军团队的sgrna-cas9系统创建油菜bnpmt6突变体。实验操作步骤如下：

(1)登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/crisprsearch.html，筛选靶点。靶点序列为5’-actagtcatacccgaaact-3’，位于基因的第二个外显子区。

(2)设计引物

dt1-bsf:atatatggtctcgattgactagtcatacccgaaactgtt

dt1-f0:tgactagtcatacccgaaactgttttagagctagaaatagc

dt2-r0:aacagtttcgggtatgactagtcaatctcttagtcgactctac

dt2-bsr:attattggtctcgaaacagtttcgggtatgactagtcaa

(3)pcr扩增：以稀释100倍的pcbc-dt1t2为模板进行四引物pcr扩增。dt1–bsf和dt2-bsr为正常引物浓度；dt1-f0和dt2-r0稀释20倍。扩增体系为：

pcr扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性15sec，56℃退火25sec，72℃延伸25sec，34circles；72℃总延伸5min。

(4)纯化回收pcr产物，建立如下酶切-连接体系(restriction-ligation)：

反应条件：5hoursat37℃，5minat50℃，10minat80℃

(5)转化转化大肠杆菌dh5α，取5μl转化大肠杆菌感受态，kan板筛选。阳性克隆筛选，u626-idf+u629-idr＝726bp菌落pcr鉴定，u626-idf和u629-idf测序，测序正确的载体即为bnpmt6的crispr载体。

(6)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株gv3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存，转化方法同实施例2中所示。

实施例4遗传转化实验

(1)拟南芥的遗传转化与除草剂筛选

构建好的bnpmt6过表达载体转化拟南芥。将成熟拟南芥(生态型columbia)种子播种于温室中，16h光照/8h黑暗条件下22℃种植，直至其现蕾，打顶后一周左右侧枝出现花蕾，去除已开的花，准备侵染。将上述保存于-80℃的农杆菌菌株接种到50ml的液体lb中，28℃180r/min培养，摇至od600＝0.3-0.5(约需12-14h)，4000r/min离心收集菌体，加等体积悬浮液(ms基本培养基+5％蔗糖+0.05％silwet-77，ph＝5.8)重悬，重悬液侵染拟南芥花序，黑暗处理24h；一周后重复侵染一次。收获成熟的t0代种子，晾干，待用。

收获的t0代拟南芥种子均匀的播撒在潮湿的土壤中，置于4℃下放置2天；移至22℃16h光照/8h黑暗条件的生长室；第10天，喷洒120mg/l的草铵膦溶液(glufosinateammonium,cas:77182-82-2)(0.05％silwet-77)；第12天，喷洒第二次；第15天，第三次喷洒，这时候会出现非转基因苗黄化死掉；第17天，最后一次喷洒；对筛选出来的苗子进行正常生长管理，待成熟，收获种子。

(2)油菜的遗传转化

对构建好的bnpmt6过表达载体和crispr载体进行油菜的遗传转化，使用农杆菌介导的遗传转化方式，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜westar。

转化流程如下：先将成熟饱满的甘蓝型油菜种子‘westar’用75％的酒精浸泡1min，0.15％升汞溶液消毒12min，无菌ddh2o清洗5-6次；将灭菌的种子播于编号为m0培养基中，于22℃培养室暗培养6-7天；挑取实施例2和3转化后的农杆菌，接种到50ml的液体lb中，28℃180r/min培养至od600＝0.3-0.5(约需12-14h)，4000r/min离心收集菌体，用悬浮液dm悬浮，28℃200r/min培养1小时，倒入培养皿中待用；用无菌镊子和解剖刀切幼苗下胚轴，每个长度为0.8-1.0cm(切外植体时尽量一刀垂直切下)；将切好的外植体置于放有菌液的皿中，浸染10min，隔一会摇晃一次；将已侵染的外植体用无菌滤纸吸干，转入编号为m1培养基中，22℃暗培养36-48h，至外植体周围有云雾状的细菌菌落出现；将共培养后的下胚轴外植体移至诱导愈伤的m2培养基中，培养基中含有抑制农杆菌生长的特美汀(tmt)和筛选抗生素，光照培养21天；淘汰一些褐化死亡的外植体，将生长正常，两端膨大的外植体转移到分化培养基m3中光照培养，每2-3周继代一次，直至出现绿芽；将分化出来的绿芽转入m4培养基中，待生根后将其移栽到大田，观察植株田间生长表型(本发明中培养基配方见表1)。

表1甘蓝型油菜遗传转化步骤中所用的培养基配方及编号

表1的说明：ms全称为murashigeandskoogstock。

(3)过表达转化单株的鉴定

提取获得的拟南芥和油菜过表达转化单株的基因组dna，通过pcr检测外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为napin-pbiloxp，在骨架载体上设计引物napin-f(5’-gcgtgcat-gcattattacac-3’)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行pcr(napin-f和pmt6-r1，pmt6-r1序列如实施例1所示)，在pcr水平检测转基因苗。pcr体系为：easytaqpolymerase0.15μl,10mmdntp0.4μl,10×buffer2μl,dna模板2μl,napin-f2μl,引物pmt6-r12μl，补ddh2o至20μl。pcr条件：94℃总变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，34circles；72℃总延伸5min。

对pcr获得的拟南芥和油菜转基因阳性苗进行qrt-pcr，以检测基因表达量。提取转化单株种子的rna并进行cdna的合成(方法同实施例1)，定量引物利用primer3软件设计得到，产物大小在100bp-200bp之间，设计好后用参考序列进行blast比对，确保引物rt-pmt6-f1(5’-gtggttccctggtggtggtact-3’)和rt-pmt6-r1(5’-t-ctcgaacaatgaaccatctcaaa-3’)的特异性。tub4-1(5’-agaggttgacgagcaga-tga)和tub4-2(5’-cctcttcttcctcctcgtac-3’)作为拟南芥的内参基因(详见marksetal1987:therelativelylargebeta-tubulingenefamilyofarabidopsiscontainsamemberwithanunusualtranscribed5'noncodingsequence)，bnactin7-l(5’-cgcgccta-gcagcatgaa-3’)和bnactin7-r(5’-gttggaaagtgctgagagatgca-3’)作为油菜qrt-pcr的内参引物(详见zhouetal2012:bnms3isrequiredfortapetaldifferentiationanddegradation,microsporeseparation,andpollen-wallbiosynthesisinbrassicanapus)。反应体系为：

反应程序：94℃30s；94℃10s，60℃15s，72℃30s，45个循环；绘制溶解曲线。qrt-pcr在bio-radcfx96real-timesystem中进行。

根据内参引物进行标准化，不同重复间定量变异用delta-deltathresholdcyclerelativequantification(2-δδct)的方法计算。最后分析获得拟南芥过表达转化单株oe1和oe4，以及获得油菜过表达转化单株oe5、oe6和oe15。

(4)crispr转化单株的鉴定

对获得的油菜crispr转化单株进行测序筛选油菜突变体。首先利用引物cas9-570-f(5’-agaccgtgaaggttgtggac-3’)和cas9-570-r(5’-tagtgatctgccgtgtctc-g-3’)鉴定cas9蛋白，对于cas9蛋白阳性单株进行目的基因的特异扩增以及测序鉴定。目的基因的特异扩增的方法为：分别用引物pmt6-ac5-f(5’-atgagaggttacaacgtgttc-3’)和pmt6-a5-r(5’-ctatactatagcccctaaaata-3’)特异扩增bnaa05.pmt6；pmt6-ac5-f(5’-atgagaggttacaacgtgttc-3’)和pmt6-c5-r(5’-aaattaaagatccggccctgtg-3’)特异扩增bnac05.pmt6。扩增方法同实施例4(3)所示。

对扩增的目的片段进行pcr产物测序，测序结果用dsdecode在线网站(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)分析靶位点的编辑情况。测序结果显示，获得了bnpmt6被编辑的多个突变体独立株系(l1、l4、l7、l20和l21)。其中l1、l20和l21是bnaa05.pmt6和bnac05.pmt6同时被编辑的双突，编辑造成了基因的提前终止；l4是仅bnac05.pmt6被编辑的单突，造成c5拷贝的提前终止；l7是bnaa05.pmt6被编辑的单突，造成a5拷贝的提前终止(图3)。

(5)转化所得植株的含油量分析

①采用气相色谱-火焰离子化检测器法测定拟南芥含油量

称拟南芥种子5-10mg置于提脂管；加入2ml5％硫酸提取液(甲醇，含0.01％bht)；加入16.2μmol/ml十七烷酸(17:0，分子量270.45)25μl，盖紧盖子；85℃水浴，10分钟后，再次拧紧盖子，持续水浴2个小时；待冷却，加入2.0mlh2o和2.0ml正己烷，涡旋混匀；1000rpm离心5分钟；取1.0ml上清至进样瓶。以上提取脂肪酸过程用的有机试剂均是色谱纯级别。采用气相色谱-火焰离子化检测器法(gaschromatography-flameionizationdetector,gc-fid)测定油脂含量和脂肪酸含量，气相色谱法配有氢火焰离子化检测器和毛细管restek-蜡柱(0.25mm×30m)，氦气载体为20ml/min。工艺参数描述如下：进样1μl，分流比20:1。柱箱温度保持在170℃，持续1min，然后逐步升高至210℃，速度为3℃/min。最后，根据保留时间鉴定脂肪酸种类，并计算其峰面积。脂肪酸按nmol％计算。以十七烷酸(17:0)为内标物，测定种子含油量，最终计算含油量占干重的百分比。

含油量结果显示，与wt(35.88±2.05)相比，t1、t2和t3代oe材料含油量显著下降1.2-5.4个百分点(图4a)。脂肪酸组成结果显示，与wt相比，oe材料的c18:1和c18:2含量增加，而c18:3含量降低(图4b)。结果表明，bnpmt6在调控种子含油量和脂肪酸组成中确实发挥着作用。

②采用近红外分析仪测定油菜种子含油量

利用近红外分析仪，对成熟期收获的油菜种子进行品质分析，获得种子含油量数据，测定仪器由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供。

含油量结果显示，受体背景材料westar的含油量是41.05±0.33，3个超表达株系oe5、oe6和oe15的含油量分别是39.21±0.74、38.49±1.21和39.76±1.14，显著降低了1.29-2.56个百分点。突变体材料l1、l4、l7、l20和l21的含油量分别是43.66±0.96、42.07±0.55、42.33±0.78、43.89±0.34和44.01±0.68，不难看出，不仅双突变体(l1、l20和l21)的含油量显著上升2.6-3.0个百分点，bnaa05.pmt6单突变体(l7)和bnac05.pmt6单突变体(l4)的含油量也显著升高1个百分点(图5)。

综上所述，基因bnpmt6在调控油菜含油量中发挥重要的作用。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种油菜s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnpmt6及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1755

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapusl.)

<400>1

atgagaggttacaacgtgttccgtgcagcgagatcgggaaagacgatactagtagctctc60

tttcttacggttggatcattttacgctggctctctcttcggcaacaacgaacccatctac120

gtctctcaatctgctctcttcaaattcccaaacaaaatcaacctcactcaccgagtctca180

ccactagtcatacccgaaactgggatgaatgtgtgtccctcaaagttcaacgagtacctc240

ccttgtcacaacgtcagttacgtgcaccagctgagcttgaacgtctctagaagagaagag300

ctcgagagacactgcccgccgctcgagcagcgtctcttctgcttggtgcctccaccaaaa360

gattacaagatacctttgagatggccaaccagtagagactacgtgtggagaagcaatgtg420

aatcatacgcatctcgctcaagttaacggtggacaaagctgggtgcaggagcatggagag480

ttctggtggttccctggtggtggtactcatttcaaacatggtgcttcagaatacatacaa540

aggttgggaggtatggtgactaatgaaacaggtgacttgcgttcagccggggtggtacaa600

gtacttgatgttggatgtggagttgcaagctttgcggcttatctacttcctctaggtata660

cagacaatgtcctttgctcctaatgatgctaatgagaatcagattcagtttgcattggag720

agaggcgtcagtgcaatgatctctgctgttgccaccaaacaactgccatatccttcatct780

tcttttgagatggttcattgttcgagatgtcgtgttgattggcatgcaaacggtggcatc840

ttacttaaagaagttcataggcttcttagacctaatggctactttgtgtatacgtcgcca900

ccagcttataggaatgataaagagtatcctatgatttgggataagttggttagtctagct960

aactcaatgtgctggaagcttgtttcccggaaggtacaaactgcaatatggattaaagaa1020

gaaaacgtggagtgccttaagaagaatgcagagctaaaggttataagcttatgtgatgtg1080

gaagatgctttgaaaccgtcctggcaagttcctcttagagattgtgtgcaaattagtgga1140

gatacagagatgagatcttcttctttagctgaacgtctctccaagtatccagaaactctg1200

agaaacaaaggtattagtgaagatgaatatacatcagatactgtcttctggagagaacaa1260

gttaaacagtattggcggtttatgagtattaatgagactgaagtgcggaatgtgatggat1320

atgaatgcattcattggtggatttgcttcagccatggactcgtatcctgtttgggtgatg1380

aacatagtacctgctaccatgaatgaaactttgtccggtgtttttgagaggggtttaact1440

ggtgctttccatgattggtgtgagccgttctcaacatatccgcggacgtatgatttgctg1500

catgccaatcatgtaatctctcactaccaaagccgtggagatggttgcttggtagaggat1560

atcatgcttgagatggaccggatgattcgccctcagggattcatcattataagggacgag1620

gaacaggtaatctcaagaatccgagacttggctcctaagtacctctgggaagtggaaact1680

catcagctggaaaacaaattcaagaagatagaaactgttctgttttgcagaaagagattc1740

tgggcaatcatctga1755

<210>2

<211>1758

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapusl.)

<400>2

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