ALS类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因、筛选方法及应用与流程

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因、筛选方法及应用。

背景技术：

棒头草（polypogonfugax）为夏熟作物田中常见的一年生或越年生禾本科杂草，每年在9-10月出苗，来年的4-6月开花，其生长周期与许多夏熟作物吻合，因而多发生在小麦，油菜及蔬菜等夏熟作物田中。由于棒头草为喜湿性杂草，常发生于低洼，潮湿和土壤肥沃的地区，因此在稻麦和稻油轮作模式下的田块中发生尤为严重，对粮食产量造成严重影响。目前，利用化学除草剂是对农业生产上防治棒头草的主要方式，但是随着除草剂的大量使用，棒头草在田间的抗药性问题越来越严重，探索除草剂对棒头草的作用机理和抗药性机理将有助于棒头草的防治。由于棒头草是六倍体植物，全基因组信息的获得较困难，因此从转录水平来研究萌发或开花等生理过程的调控机制是更可行且有效的方法。

实时定量荧光pcr（rt-pcr）技术是研究某种特定条件下基因表达量的常用方法，具有特异性强，敏感性高，可重复等特点，而筛选出一个能够在特定环境条件或器官组织中均能稳定持续表达的内参基因，是决定rt-pcr结果可靠性的前提条件。因此在进行rt-pcr实验前，利用统计学的方法分析并筛选出待测样本的最佳稳定表达的内参基因是非常必要的。

目前，关于棒头草内参基因的开发筛选的研究报道一片空白，若要对棒头草在除草剂胁迫条件下相关分子生物学机制进行研究，内参基因的开发和筛选至关重要。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供棒头草稳定表达的内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检测棒头草转录表达水平的要求，提高了棒头草基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本发明的另一目的在于提供上述内参基因的筛选方法。本发明还有一目的是提供一种上述内参基因的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因，为内参基因ubq，所述内参基因ubq的核苷酸序列如seqidno.1所示。

作为本发明的进一步优选，所述内参基因ubq的引物序列如下：

正向引物f:gcaagaagaagacctacaccaag；

反向引物r:ccttctggttgtagacgtaggtg。

作为本发明的进一步优选，内参基因ubq的在als类除草剂胁迫下棒头草荧光定量中的应用。

作为本发明的进一步优选，内参基因ubq的引物序列的在als类除草剂胁迫下棒头草荧光定量中的应用。

作为本发明的进一步优选，内参基因ubq的检测als类除草剂抗性基因表达量中的应用。

本发明提供一种als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因筛选方法，包括样品处理、提取rna与制备cdna、候选内参基因设计与分析，其中，候选内参基因设计与分析包括以下步骤：

（1）筛选5个候选内参基因，分别为ubq、ef1、18srrna、25srrna、26srrna，并设计上述候选内参基因的扩增引物；

（2）以所述cdna作为扩增模板，利用pcr对所述扩增引物特异性进行测定；

（3）利用荧光定量pcr反应后得到的ct值，对所述候选内参基因进行稳定性分析；

（4）计算分析所述内参基因在als类除草剂处理下及在不同器官组织中的表达量稳定性。

作为本发明的进一步优选，所述候选内参基因设计与分析的步骤（3）中荧光定量pcr反应体系包含：10μlitaq™universalsybr®greensupermix(2x)、2μlcdna模板、上游或下游引物（10μm）各1μl、6μl无菌超纯水；反应条件为：95°c预变性30s，95°c变性5s，60°c退火34s，40个循环。

作为本发明的进一步优选，所述样品处理中的采集对象为：对als类除草剂表现3~4倍抗性水平的ar棒头草种群和对als类除草剂敏感的as棒头草种群。

作为本发明的进一步优选，所述样本处理包括：a.分别选择所述ar棒头草种群和as棒头草种群两个种群中的种子进行分组播种，生长至3~4叶期后喷施浓度为4.0~5.0g.a.i/ha范围内的als类除草剂；b.以喷施als类除草剂0h、24h、48h、72h为四次取样时间，取叶片并在液氮中速冻用于rna提取。

本申请通过bestkeeper,normfinder和genorm这三个软件对5个内参基因进行稳定性评价，综合软件分析结果进行综合分析，筛选出实验条件下棒头草稳定表达的内参基因，可以获得ubq是棒头草种群（as和ar）在除草剂处理下最稳定表达的内参基因，可以用于分析棒头草在als类除草剂处理条件下功能基因表达水平的研究。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

与现有技术相比，本发明从5个候选内参基因中筛选出棒头草在als类除草剂胁迫下表达稳定的内参基因，数据真实可靠，为棒头草抗als类除草剂等响应机制的分子生物学研究提供校正工具，填补了棒头草研究领域中缺少合适的内参基因的空白。

筛选出的内参基因适用于棒头草在als类除草剂胁迫下关键基因的表达分析，可提高数据的准确性。

本发明还给出了内参基因ubq在实际检测抗性和敏感棒头草对除草剂解毒代谢能力的差异实验中的应用，证明了本发明筛选的内参基因ubq具有在棒头草胁迫条件下相关分子生物学机制进行研究的价值。

附图说明

附图1为本发明中以棒头草的cdna模板，候选内参基因的片段电泳图。

附图2为本发明中抗性棒头草ar和敏感棒头草as在甲磺隆处理和未处理条件下的cyp81b1基因的表达量的柱状示意图。

具体实施方式

实施例1

1.材料选择与处理：

选择两个棒头草种群（ar和as），前期研究结果表明棒头草ar对甲磺隆表现3-4倍的抗性水平，而as对甲磺隆敏感，甲磺隆是一种广泛使用的als类除草剂。

试验步骤：将种子播种于直径为7.5cm塑料盆钵中，每盆20粒种子，种植12盆，生长至3-4叶期后喷施浓度为4.5ga.i./ha的甲磺隆，在喷施甲磺隆0h、24h、48h、72h后取叶片并在液氮中速冻用于rna提取，每次取样选取三株以上植株叶片为一份样本，每个实验材料设有3组重复，因此每次取样时间得到6份样本，4次取样时间共获得24份待测样本用于分析候选内参基因在不同除草剂处理时间段的表达稳定性。

2.rna的提取与crna的制备

样本总rna提取使用植物总rna提取试剂盒（天根，中国）完成，rna样本的浓度及纯度由超微量分光光度计（nanodrop，美国）测定的od260/od280和od260/od230比值来确定。1μg的rna样本用primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒进行反转录，最终产物稀释400倍用来作为rt-pcr的模板。

3.候选内参基因引物设计：

发明人根据近缘禾本科杂草大穗看麦娘（alopecurusmyosuroides）中的同源基因进行引物设计，引物序列信息及扩增产物大小如表1所示。所有引物采用primerpremier5.0软件设计并选择出满足以下条件引物：退火温度在50-65℃，引物长度为18-24bp，gc含量为50%-60%，pcr产物大小为100-225bp。

表1.候选内参基因的相关信息

4.候选内参基因的特异性分析：

利用常规pcr对引物特异性进行测定，pcr产物通过2%凝胶电泳观察，如图1所示，扩增产物条带单一，大小符合预期，这表明引物的特异性良好。

5.实时定量荧光pcr（rt-pcr）反应体系和反应条件：

rt-pcr反应体系（20μl）包含：10μlitaq™universalsybr®greensupermix(2x)、2μlcdna模板、上游或下游引物（10μm）各1μl、6μl无菌超纯水；反应条件为：95°c预变性30s，95°c变性5s，60°c退火34s，40个循环。

rt-pcr反应条件如下：95°c预变性30s，95°c变性5s，60°c退火34s，40个循环。通过对每一个候选内参基因进行荧光定量pcr扩增，得到ct值，用于计算内参基因稳定性。

6.候选内参基因的扩增效率分析

将反转录的cdna稀释成5个浓度梯度（稀释倍数为1000、100、10、1、0.1），作为标准曲线建立的模板，对每一对引物进行荧光定量pcr，计算每对待测引物的扩增效率（e）和相关系数（r2），如表2所示：

表2.候选内参基因扩增效率

结果表明，所有基因的扩增效率（97%-109%）及其相关系数（0.94-0.99）均在可接受范围内，可以用于接下来的稳定性分析。

7.候选内参基因的基因序列分析

利用常规pcr方法，以棒头草cdna为模板，使用各对引物，将ubq、ef1、18srrna、25srrna和26srrna的基因片段进行扩增，测序分析，序列信息如seqidno.1~seqidno.5所示。

8.内参基因表达稳定性分析的方法

内参基因表达的稳定性由三个统计软件（bestkeeper,normfinder和genorm）完成。bestkeeper是直接利用ct值计算出标准误差（sd）来确定表达量稳定性，当sd值大于1，则证明该内参基因表达不稳定；当sd值均小于1时，内参基因表达稳定性的排序由sd值的大小决定，sd值越小越稳定。normfinder和genorm是采用相对表达量进行计算：

normfinder利用相对表达量计算出表达稳定值（sv），sv越低表示基因表达量越稳定。genorm则计算出各内参基因的平均变异度（m），m值小于1.5的内参基因被认为是稳定表达的，m值越小稳定性越高。最终根据三个软件的计算结果进行综合分析，来确定在特定实验条件下最合适的内参基因。

9.候选内参基因在除草剂处理下的表达稳定性分析

为了选择出在除草剂处理下的最稳定表达内参基因，我们利用三个统计软件来综合分析两个棒头草种群在除草剂甲磺隆处理0h,24h,48h,和72h后，5个候选内参基因的表达稳定性，如表3所示：

表3.候选内参基因在除草剂处理条件下bestkeeper、normfinder和genorm的评分和排名

bestkeeper的计算结果表明在所有处理时间下的两个棒头草种群中26srrna和ef1的sd值大于1,表达不稳定，而18srrna,25srrna和ubq的sd值均小于1，表达稳定性由高到低的排序为18srrna>25srrna>ubq。

genorm计算结果表明，除了26srrna的m值超过标准阈值1.5，为不稳定表达内参基因，其他4个候选内参基因的m值均小于1.5，稳定性排序为ef1>25srrna>ubq>18srrna。

normfinder可以将所有样本分为具有单一变量的子集，用以研究植物种群或除草剂处理时间对基因表达稳定性影响。当以全部样本为研究对象时，ef1,25srrna和ubq为最稳定表达的基因；当以除草剂处理时间为研究对象时，我们将所有样本按处理时间分为4个子集（0hat、24hat、48hat和72hat），结果表明ef1、26srrna和ubq.为最稳定表达基因；当以植株种群的影响为研究对象时，我们将所有样本按种群分为2个子集（as和ar），结果表明ef1、18srrna和ubq为最稳定表达基因。综合normfinder的计算结果，ef1和ubq为最稳定表达的内参基因。

结合三个分析软件的计算结果可以证明ubq是棒头草种群（as和ar）在除草剂处理下最稳定表达的内参基因，可以用于分析棒头草在除草剂处理条件下功能基因表达水平的研究。

实施例2

为了检测抗性和敏感棒头草对除草剂解毒代谢能力的差异，本实施例在实施例1研究的基础上进一步实验：在本实施例中，本发明人选择了细胞色素p450家族的基因（cyp81b1）来进行测定，cyp81b1已被证实参与调控杂草代谢除草剂的过程，通过测定该基因在除草剂处理条件下的表达量可以反映抗性和敏感棒头草代谢除草剂能力的差异。具体方法如下：将棒头草抗性种群（ar）和敏感种群（as）的种子播种于直径为7.5cm塑料盆钵中，每盆20粒种子，种植12盆，生长至3-4叶期后喷施浓度为4.5ga.i./ha的甲磺隆，在施药24h后取叶片并在液氮中速冻保存，同时取未施药的叶片作为对照，每次取样选取三株以上植株叶片为一份样本，每个实验材料设有3组重复，因此每个种群得到6份样本，共获得12份待测样本，分别命名为as1-ck，as2-ck，as3-ck，as1-ck，as2-t，as3-t，ar1-ck，ar2-ck，ar3-ck，ar1-t，ar2-t，ar3-t。rna提取和cdna制备步骤如实施例1所述。

根据已发表的cyp81b1的基因序列设计引物，引物序列如表1所示，每个样本均进行ubq基因和cyp81b1基因的rt-pcr扩增反应，rt-pcr的反应体系和反应条件同上。rt-pcr得到ubq基因和cyp81b1基因在各样本中的ct值，进而计算基因的相对表达量。以cyp81b1为目标基因，ubq为内参基因，以未施药样本（ck）为校准样本，施药样本（t）为试验样本，根据如下公式计算表达量比值：

结果如图2所示：与0h样本相比，抗性种群ar的cyp81b1基因在24h时表达量显著上升，而敏感种群as的cyp81b1基因在24h时表达量没有显著变化。这一结果说明，抗性棒头草种群在甲磺隆的处理下，cyp81b1基因的表达量会上升，导致抗性棒头草对甲磺隆的代谢能力增强，进而产生抗药性。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>als类除草剂胁迫下棒头草不同组织稳定表达的内参基因、筛选方法及应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2065

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