水稻基因OsTGA5及其在水稻抗稻瘟病中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻基因ostga5及其在抗稻瘟病中的应用。

背景技术：

水稻（oryzasativa）是我国重要的粮食作物，其产量直接关系到国家粮食战略安全。由稻瘟病菌（magnaportheoryzae）引起的稻瘟病是水稻最主要病害之一，严重影响我国稻米产量，每年造成巨大的经济损失。

植物在抵抗各种病原菌微生物侵染过程中，进化出了一套复杂、高效的免疫防御系统。其主要分为两个层次：第一层次即植物细胞通过位于细胞膜上的模式识别受体感知病原菌的保守分子模式而激发产生的具有广谱抗性的免疫反应(pattern-triggeredimmunity,pti)。第二层次即植物细胞依赖于自身编码的抗性（r）蛋白直接或间接识别病原菌分泌的效应因子而产生的具有病原小种特异性的免疫反应(effector-triggeredimmunity,eti)。尽管植物pti与eti反应在病原菌入侵不同阶段被触发，其激活的下游抗病反应通路具有相似性，比如活性氧分子的产生、抗病激素的积累、抗病基因表达等。

转录因子在各种信号转导途径中发挥重要的调控作用，从而使植物能够对环境变化和病原体侵袭做出反应。植物中bzip转录因子超级家族成员可与其他bzip蛋白或其他类型的转录因子形成同源或异源二聚体，调控生长、代谢、胁迫应答等多种基因的表达。植物bzip家族可分为13个类群，共包含34个亚家族。拟南芥的tga2、tga6和烟草的tga2.2等tga转录因子属于其中的d亚家族，它们可以与多个抗病基因启动子中的识别基序(as-1)结合，调控其转录水平。水稻中与拟南芥tga2同源且归属于同一亚家族的bzip转录因子有四个，包括ostga5、ostga3、ostga2、rtga2.1。已有研究表明，ostga2和rtga2.1在水稻抗白叶枯病免疫反应中分别发挥正调控和负调控的功能。

然而，目前仍没有关于ostga5基因在水稻抗稻瘟病中应用的报道。本发明研究发现，采用生物技术手段改变水稻ostga5的表达水平，可提高水稻抗稻瘟病能力且不影响水稻植株的正常生长。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水稻基因ostga5及其在水稻抗稻瘟病中的应用，具体采用crispr/cas9方法对ostga5基因进行敲除，对作物进行遗传改良，培育出抗稻瘟病的转基因水稻。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种水稻基因ostga5，其开放阅读框核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述水稻基因ostga5编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种水稻基因ostga5在水稻抗稻瘟病中的应用，其具体操作包括：选择合适的靶位点，构建ostga5敲除载体，然后将重组质粒转化至根癌农杆菌中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得ostga5敲除突变体，对其进行稻瘟病菌喷雾接种和活体造伤接种。

上述靶位点的核苷酸序列为seqidno.3所示。

水稻基因ostga5在水稻抗稻瘟病中的应用，敲除ostga5基因明显提高水稻对稻瘟病的抗性且未对水稻植株生长产生不利影响。

本发明具有以下有益效果：

本发明的水稻基因ostga5敲除之后，与野生型水稻中花11（zh11）相比显著提高了抗稻瘟病的能力且突变体植株生长正常，该基因可用于选育或培育抗稻瘟病水稻抗病品种。

附图说明

图1中间载体sk-grna中osu3:grna的结构图。

图2双元载体pc1300-cas9中2×35s：cas9的结构图。

图3ostga5敲除突变体的鉴定。reference：为参考基因序列；ostga5-1,ostga5-2和ostga5-3分别为ostga5基因不同位点纯合突变株系。

图4喷雾接种5天调查结果。guy11：稻瘟病菌株guy11；zh11：野生型水稻品种中花11；ostga5-1,ostga5-2和ostga5-3分别为ostga5基因不同位点纯合突变株系。

图5打孔接种7天调查结果。guy11：稻瘟病菌株guy11；zh11：野生型水稻品种中花11；ostga5-1,ostga5-2和ostga5-3分别为ostga5基因不同位点纯合突变株系。

图6抽穗期植株田间生长表型调查结果。zh11：野生型水稻品种中花11；ostga5-1,ostga5-2和ostga5-3分别为ostga5基因不同位点纯合突变株系。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1ostga5基因的获得

bzip转录因子在调控各种信号转导途径中发挥重要功能，从而使植物在基因转录水平层面对生物及非生物胁迫做出有效响应。在水稻bzip转录因子超级家族中，ostga5与拟南芥tga2同源性最高。水稻品种zh11在接种毒性稻瘟菌株guy11后不同时间点，ostga5的转录水平与对照处理相比呈现明显降低趋势。据此，我们推测该基因在水稻免疫反应激活过程中具有重要调节作用。根据nbci网站上对水稻品种日本晴基因组中该基因的预测cdna序列（xm_015766218.1），我们成功从zh11叶片总cdna中克隆到ostga5的开放阅读框全长990bp，经测序发现与预测序列一致。克隆ostga5开放阅读框所用引物的核苷酸序列如下：

ostga5orf-fseqidno.4：5’-atggcagatatgagcccta-3’，

ostga5orf-rseqidno.5：5’-ctattctttcggccgagcaa-3’

实施例2ostga5敲除载体的构建

在ostga5基因的开放阅读框编码区中选取一个靶位点（序列如seqidno.3所示），构建grna表达盒，然后将靶标grna表达盒连接到敲除载体pc1300-cas9中，获得ostga5敲除载体。详细pc1300-cas9载体的创制方法参照文献“wang,c.,shen,l.,fu,y.,yan,c.andwang,k.(2015).asimplecrispr/cas9systemformultiplexgenomeeditinginrice.journalofgeneticsandgenomics,42:703-706”。详细载体构建方法参照专利“植物多基因敲除载体的构建及应用，cn105112435b”，具体如下：

（1）靶标序列的选择及引物设计

在ostga5基因的开放阅读框编码区中找含有5’-（n）x-ngg-3’结构的靶标序列，其中n表示a、t、c和g中的任意一个，x为19。根据以上原则设计一条靶标序列ostga5-t1，序列如：

ostga5-t1seqidno.3：5’-gtcacctgcagcttgaaccagg-3’

设计用于构建grna的引物对：在ostga5-t1正向序列前加ggca获得引物ostga5-t1f；在ostga5-t1反向互补序列前加aaac，获得引物ostga5-t1r。具体序列如下：

ostga5-t1fseqidno.6：5’-ggcagtcacctgcagcttgaacc-3’，

ostga5-t1rseqidno.7：5’-aaacggttcaagctgcaggtgac-3’

（2）grna表达盒的构建：

sk-grna（图1）进行aari酶切(购自ferment公司)，形成带有粘性末端的载体。详细sk-grna载体的创制方法参照文献“wang,c.,shen,l.,fu,y.,yan,c.andwang,k.(2015).asimplecrispr/cas9systemformultiplexgenomeeditinginrice.journalofgeneticsandgenomics,42:703-706”。酶切反应体系如下：

ddh2o32μl

10×buffer5μl

50×oligonucleotide1μl

aari2μl

载体sk-grna（0.1μg）10μl

总体积50μl

37℃酶切3小时，用biomed胶回收试剂盒（biomed，dr0103）按产品说明书进行纯化；得线性载体sk-grna/aari。

100μm的引物ostga5-t1f与ostga5-t1r各20μl混合，100℃放置5分钟后置于室温，逐渐冷却，变性退火，形成带有粘性末端的片段。将载体和片段进行t4酶（购自neb公司）连接，反应如下：

载体sk-grna/aari(30ng)1.5μl

10×t4ligasebuffer1μl

退火产物7μl

t4连接酶0.5μl

总体积10μl

室温反应1小时。连接产物5μl转化大肠杆菌感受态细胞dh5α得到连接质粒。用sk上的引物t7seqidno.8：5’-taatacgactcactatagg-3’，测序确定克隆构建正确，获得grna表达盒sk-grna。

(3)靶标grna表达盒与敲除载体pc1300-cas9的连接

sk-grna质粒用bglii和kpni双酶切，切胶回收约0.56kb大小的条带，将此片段连入pc1300-cas9（图2）双元载体的kpni和bamhi识别位点间，得到最终敲除ostga5的双元表达载体pc1300-cas9-sk-grna。

连接反应如下：

载体pc1300-cas9/kpni+bamhi(30ng)1μl

片段sk-grna/bglii+kpni(25ng)1μl

10×t4ligasebuffer1μl

ddh2o6.5μl

t4连接酶0.5μl

总体积10μl

室温反应1小时。连接产物5μl转化大肠杆菌感受态细胞dh5α得到连接质粒。

用引物pc1300-fseqidno.9：5’-acactttatgcttccggctc-3’，ostga5-t1r测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。

实施例3ostga5敲除突变体的获得

将测序正确的双元表达载体pc1300-cas9-sk-grna通过电击的方法转化到根癌农杆菌eha105中，转化子验证无误后，进行水稻粳稻品种中花11愈伤组织转化，以获得ostga5基因敲除突变体水稻植株。详细转化方法参照文献“nishimura,a.,aichi,i.,andmatsuoka,m.(2006).aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice.natureprotocols,1,2796-2802”。

实施例4ostga5敲除突变体的验证

在ostga5基因靶位点前后两端附近设计引物，引物序列分别为seqidno.10：5’-catgctaatgcctgttggtttac-3’和seqidno.11：5’-gctacagcagaacacaagtacc-3’，以ostga5敲除突变体水稻植株的基因组dna为模板，进行pcr扩增，pcr产物经测序比对，结果见图3所示，ostga5-1及ostga5-2株系为纯合插入单碱基，ostga5-3株系为纯合缺失5个碱基。

实施例5ostga5敲除突变体喷雾接种鉴定

将水稻中花11和ostga5的敲除突变体水稻植株置于人工智能培养箱培养3周分别喷雾接种稻瘟病菌guy11孢子液（浓度约为2×10⁵个/毫升），26℃黑暗保湿培养24小时后，转移到正常光照条件下继续培养，5天后调查发病情况。结果见图4所示，突变体的发病情况与野生型水稻相比明显减弱，表明对ostga5基因进行敲除突变后，其对稻瘟病的抗性明显增强。

实施例6ostga5敲除突变体打孔接种鉴定

将水稻中花11和ostga5的敲除突变体种植于人工智能培养箱，培养6周进行打孔接种。在距离叶尖1/3的位置用小型打孔器打孔，在叶片上面留下伤口即可（注意不要把叶片组织打断），以利于稻瘟菌侵染。取10μl稻瘟病菌guy11孢子悬浮液（浓度约为2×10⁵个/毫升）滴在伤口处，然后用透明胶带将此处叶片包裹成小腔室。将接种过的水稻转移到正常光照条件下继续培养，8天后调查发病情况。结果见图5所示，与野生型水稻中花11比较，ostga5敲除突变体的叶片病斑明显更小，表明对ostga5基因进行敲除突变后，其对稻瘟病的抗性明显增强，结果与实施例5相一致。

实施例7ostga5敲除突变体田间生长表型鉴定

将水稻中花11和ostga5的敲除突变体种植于福建农林大学校内水稻田中，待抽穗期对各材料单株进行拍照，以观察生长表型。结果见图6所示，ostga5敲除突变体在株高、抽穗期、分蘖数等方面与野生型水稻中花11相比较，未表现出明显差异。该结果表明，ostga5基因的敲除突变没有对水稻植株的生长产生显著不利影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>水稻基因ostga5及其在水稻抗稻瘟病中的应用

<130>11

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>990

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggcagatatgagccctaggacagatacatcaacagatgataccgatgataaccacatg60

cttgaaccaggtcagcttgctcttgctgctgcttctgactctgacagatccaaggacaaa120

catgaagatcaaaagacattgcgtcggctcgcccaaaatcgcgaggctgcaaggaagagt180

cgtttgaggaaaaaggcatatgttcaacaattggagaatagcaggctaaagcttacacaa240

ctagaacaagaattgcaacgagctcgtcagcagggcatttttatatccagctcagtggac300

cagactcattccatgagtggaaatggggcattggcttttgatatggagtatgcacgttgg360

ttggaagaacacaataggcaaattaatgagctaaggtctgcagtcaatgctcatgcaggt420

gataatgagctccgtggtgttgttgacaagatcatgtcacactatgaggagattttcaag480

cagaaaggaaatgcggccaaagcagatgtctttcatgtgttatcaggcatgtggaagaca540

ccagctgagaggtgtttcttgtggctaggaggattccgaccatccgagcttttaaagctt600

ctttcgacacagcttgaacctctcactgagcagcagctgtcagggatagccaaccttcag660

cagtcttcacaacaagctgaagatgctctttcacaaggaatggaggcccttcagcagtcc720

ttggcagaaacattggctgggtctcttggttcttctggatcaacgggaaacgtggcaaac780

tacatgggccaaatggcaatggccatggggaagcttgggacccttgagaatttccttcgc840

caggctgacaacctgcggcagcagactcttcaacagatgcaaaggatactgaccactagg900

cagtctgcccgtgcgcttcttgtgataagcgattactcttcgcggcttcgtgcccttagt960

tccctctggcttgctcggccgaaagaatag990

<210>2

<211>329

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metalaaspmetserproargthraspthrserthraspaspthrasp

151015

aspasnhismetleugluproglyglnleualaleualaalaalaser

202530

aspseraspargserlysasplyshisgluaspglnlysthrleuarg

354045

argleualaglnasnargglualaalaarglysserargleuarglys

505560

lysalatyrvalglnglnleugluasnserargleulysleuthrgln

65707580

leugluglngluleuglnargalaargglnglnglyilepheileser

859095

serservalaspglnthrhissermetserglyasnglyalaleuala

100105110

pheaspmetglutyralaargtrpleuglugluhisasnargglnile

115120125

asngluleuargseralavalasnalahisalaglyaspasngluleu

130135140

argglyvalvalasplysilemetserhistyrglugluilephelys

145150155160

glnlysglyasnalaalalysalaaspvalphehisvalleusergly

165170175

mettrplysthrproalagluargcyspheleutrpleuglyglyphe

180185190

argprosergluleuleulysleuleuserthrglnleugluproleu

195200205

thrgluglnglnleuserglyilealaasnleuglnglnsersergln

210215220

glnalagluaspalaleuserglnglymetglualaleuglnglnser

225230235240

leualagluthrleualaglyserleuglyserserglyserthrgly

245250255

asnvalalaasntyrmetglyglnmetalametalametglylysleu

260265270

glythrleugluasnpheleuargglnalaaspasnleuargglngln

275280285

thrleuglnglnmetglnargileleuthrthrargglnseralaarg

290295300

alaleuleuvalileserasptyrserserargleuargalaleuser

305310315320

serleutrpleualaargprolysglu

325

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtcacctgcagcttgaaccagg22

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<212>dna

<213>人工序列

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atggcagatatgagcccta19

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<212>dna

<213>人工序列

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ctattctttcggccgagcaa20

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<212>dna

<213>人工序列

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ggcagtcacctgcagcttgaacc23

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<212>dna

<213>人工序列

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aaacggttcaagctgcaggtgac23

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taatacgactcactatagg19

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acactttatgcttccggctc20

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gctacagcagaacacaagtacc22