一种调控玉米叶夹角的正向调控因子及其应用的制作方法

本发明属于作物遗传育种领域，涉及一种调控玉米叶夹角的zmcla7-1基因，特别是指一种调控玉米叶夹角的正向调控因子及其应用。

背景技术：

粮食安全是关系到国计民生的重大问题。耕地持续减少、人口继续增长、粮食需求不断增加等不可逆转的因素，决定了粮食安全是保障我国社会和经济稳定发展的一项长期而又艰巨的任务。因此，在现有产量水平上实现单产水平的进一步突破，是实现我国粮食增产任务的核心。国内外实践证明，增加玉米种植密度是实现单产持续提高的重要技术途径。在过去80年间，美国生产上应用的玉米杂交种单株产量并没有明显提高，而单产水平的持续提高则是通过增加种植密度和提高抗逆性来实现（duvick，1997，2005）。目前，美国等发达国家平均亩产700公斤，种植密度在5500株/亩左右；而我国黄淮海玉米主产区平均亩产400公斤，种植密度为3500-4500株/亩。由此可见，目前我国玉米的种植密度和产量仍有进一步提高的空间。

提高田间种植密度的关键是选育和推广耐密高产玉米品种。光是玉米进行光合作用的能量源泉，也是调控玉米自身生长发育的重要环境因子。玉米在高密度逆境条件下如何才能更有效地接受和利用阳光；玉米在密植环境下依靠什么样的调控机制才能提高群体的光合效率；随着群体密度的提高，群体内个体间叶片相互交叠而产生互相遮荫，下部叶片受到遮蔽影响了对光能的吸收与利用，不仅显著降低了光合效率，而且诱发了避荫综合症sas（shadeavoidancesyndrome），避荫综合症是高密度逆境常常发生的一种现象，它的发生往往会改变原来的生长模式和光合产物分配方式，表现为茎秆伸长，营养生长期缩短，诱发植物提前开花结果，过早的生殖生长影响种子和果实发育，从而造成产量的下降（franklinetal.,2005;taoetal.,2008）。因此，耐密高产玉米新品种必须具有耐密的株型和耐密的特性。紧凑合理株型是耐密高产的一个重要外在形态指标，玉米光合产物源、流、库合理高效运转等是耐密高产的一个重要内在生理机制。茎叶夹角是玉米株型性状中最重要的性状之一，茎叶夹角小的品种通常种植密度高，根茎营养物质吸收力强，植株叶片向上直立从而能够截获更多的阳光，有利于提高光合效率，降低群体遮荫综合症。上世纪六、七十年代国内外对玉米茎叶夹角与种植密度及其对产量的影响就引起了人们的关注，pendleton等（1968）对玉米叶夹角与种植密度对产量的影响研究发现，在密植条件下，含有无叶舌基因liguleless2的杂交种（紧凑）与对应杂交种相比，平均亩产提高41.2%；austin等（1989）研究表明，玉米叶夹角与产量之间存在着相关性，上部叶片直立、夹角小，有利于中部叶片接收光照，增强中上部叶片的光合作用，提高干物质的生产与积累，进而提高产量。因此，叶夹角不仅是影响玉米种植密度和产量的一个重要因素，而且是当前及未来玉米高产育种的关键性状

尽管有关玉米叶夹角的qtl被定位，但到目前为止还没有通过图位克隆技术获得相应的候选基因。而一些与玉米叶夹角相关的基因通过比较基因组学和突变体技术被研究。ku等（2011）利用比较基因组学方法，克隆了位于第二染色体上的qla2的候选基因。研究表明，紧凑型亲本自交系豫82和松散型亲本自交系沈137其5’-utr端”ctcc”变为”cccc”，影响了zmtac1的表达水平，从而进一步影响叶夹角的大小。由此表明zmtac1基因表达水平的高低是通过5’-utr位点序列‘ctcc'–‘cccc'的变化调控的。moreno等（1997）对lgl突变体的研究发现，该突变体为ligulelessl基因表达缺失突变体，该突变体表现为不能形成叶舌和叶耳，叶片和叶鞘的连接处不能够发育。利用活化剂(ac)转座因子作为一个分子标签，将lgl的等位基因lgl-ml从中分离和克隆出来，研究证实lg1基因以一种细胞自主方式产生功能。juarez等（2004）发现rld1和lbl1突变体表现出近轴/向上的叶部形态。通过克隆其相对应的基因发现，rld1编码一个hd-zipiii蛋白，通过远轴端的mir166-directed的转录裂解限定了空间近轴端表达。半显性rldl-o突变体在mir166互补位点一个单核苷酸替换导致远轴端的突变体转录本的持续表达，这引起叶子偏向近轴端。遗传分析表明lbl1和rldl-o彼此相互抑制，说明这2个基因在同一路径中起作用。对yabby基因的研究发现其直接引起侧生器官向外生长。与已鉴定的qtl相比，已鉴定出的与叶夹角有关的基因数目远远不够，说明大量的与叶夹角相关的候选基因有待进一步鉴定。

技术实现要素：

为解决现有技术中选育密植型的高产玉米新品种存在的问题，本发明提出一种调控玉米叶夹角的正向调控因子及其应用，涉及的基因zmcla7-1是通过图位克隆技术发现的调控叶夹角大小的一个由317个氨基酸组成包含duf822家族保守功能结构域的未知基因，其分子生物学功能目前在植物中尚未报道。本发明研究了该基因及其启动子调控玉米叶夹角的分子生物学功能，并为选育密植型的优良高产玉米新品种提供了一个潜在的新基因资源。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种调控玉米叶夹角的正向调控因子，正向调控因子为基因zmcla7-1或基因zmcla7-1的启动子，基因zmcla7-1的碱基序列如seqidno.1所示，启动子序列如seqidno.5所示，zmcla7-1基因的启动子有碱基突变和插入/缺失，如图5所示。

所述基因zmcla7-1编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，包含duf822家族保守功能结构域。

上述的正向调控因子在调控玉米叶夹角中的应用，步骤为：

（1）以紧凑型自交系豫537a为供体亲本，以松散型玉米自交系沈137为受体亲本，采用回交转育结合分子标记辅助选择构建位于第七染色体的主效qla7的近等基因系豫沈137-nil76；

（2）采用图位克隆技术从沈137-nil76中分离zmcla7-1基因，然后利用rnai技术构建玉米内源zmcla7-1基因的表达载体；

（3）将玉米内源zmcla7-1基因的表达载体转化农杆菌感受态细胞，用于转化玉米自交系b104，得到叶夹角表现不同程度减小的转基因阳性株。

所述步骤（2）中，玉米内源zmcla7-1基因的表达载体以自交系豫537a的cdna为模板，以根据b73的cla7-1cdna序列设计的引物对为引物构建而得。

所述引物对为rnai-f和rnai-r，其中rnai-f序列如seqidno.3所示，rnai-r序列如seqidno.4所示

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的目的在于提供一种控制玉米叶夹角大小的基因zmcla7-1及其启动子，采用正向遗传学方法（通过构建作图群体对叶夹角进行qtl初步定为、精细定位）准确无误的分离候选基因。该基因具有如seqidno.1所示的dna片段，启动子有如seqidno.5所示。本发明也包括如seqidno.2所示的蛋白质序列，该基因mrna积累量降低，导致玉米叶夹角减小，因此该基因的克隆有助于理解玉米叶夹角形成的分子机制。

2、本发明利用rnai技术，抑制玉米内源zmcla7-1基因的表达。具体的说就是将zmcla7-1基因与其它调控元件，如组成型启动子（如camv35s启动子）或器官特异性启动子融合构建基因抑制表达载体，通过转基因技术（如反义rna或rnai）创造叶夹角小、株型紧凑的玉米自交系，用于培育玉米耐密新品种。

3、本发明将含有seqidno.1所示序列的基因进行改造，导入玉米植株中，可以创建株型紧凑、叶夹角小的玉米育种材料，对玉米育种具有重要的实际应用意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为沈137-nil76和沈137的田间表型图。图中a：稳定时期（玉米开花后10天）沈137-nil76（左）与沈137（右）的植株形态；b：沈137-nil76（左）与沈137（右）的穗上部叶夹角平均值。

图2为图位克隆zmcla7-1基因的分子鉴定结果。图中a：利用bc3f2:3-8群体112个家系进行定位将qla7-1定位到标记pze-07122629825和pze-107077981区间内；b：利用bc4f2群体共8723个单株，共筛选到19株交换单株，对19个交换单株进行精细定位将qla7-1缩小的标记ssr7-35和ssr7-157区间内；c：通过精细定位将qla7-1的区间缩小到43.6kb的区域内，该区域包含1个候选基因。d：该候选基因zm00001d021927（zmcla7-1）在沈137-nil76与沈137中的表达量（mrna积累量）。

图3为zmcla7-1基因的表达模式，qrt-pcr检测zmcla7-1基因从7-9叶期在沈137和沈137-nil76在叶片中的表达量（mrna积累量），18s基因作为内对照；

图4为采用rnai技术，zmcla7-1的转基因使自交系b104叶夹角减小的植株表型。图中a：稳定时期过表达zmcla7-1对照植株（右）和阳性植株（左）的形态；b：稳定时期过表达zmcla7-1对照植株（右）和阳性植株（左）穗上部叶夹角平均值。

图5为zmcla7-1基因的启动子碱基突变和插入/缺失导致基因表达量改变。图中a：沈137和沈137-nil76间该基因启动子在沈137和沈137-nil76间存在较多差异比较；b：沈137和沈137-nil76启动子启动报告基因的相对表达量；两个灰色方框分别表示起始密码子和终止密码子。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明是利用河南农业大学选育的紧凑型玉米自交系豫537a为母本，以沈阳市农业科学院选育的松散型玉米自交系沈137（图1）为父本杂交获得f1，通过多代连续自交获得的重组自交系群体群体为定位群体，通过3个地点的叶夹角表型鉴定，对叶夹角进行了qtl定位，共定位到2个与叶夹角有关的qtl，其中位于第七染色体上的主效qla7-1的效应值最大。为此，以自交系豫537a为供体亲本，自交系沈137为受体亲本构建qla7-1的近等基因系。采用回交转育结合分子标记辅助选择方法构建而成，构建的近等基因系为沈137-nil76（图1），为进一步理解本发明的内容与目的，下面的实施例1将详细介绍本发明的具体技术实施步骤。

实施例1

近等基因系的构建

以叶夹角小、株型紧凑的玉米自交系豫537a为供体亲本，叶夹角大、株型松散的玉米自交系沈137为受体亲本通过回交转育结合分子标记辅助选择技术构建近等基因系（图1）。

2014年春在郑州两亲本组配获得f1；2014年冬在海南种植f1代及受体亲本沈137，用沈137与f1回交获得bc1f1；

根据bc1f1的表型选择叶夹角小的13株于2015年春在郑州种成穗行，继续与沈137回交获得bc2f1；从中选择叶夹角小的15个单株于2015年冬在海南三亚种成穗行，继续与沈137回交获得bc3f1；

2016年春，将bc3f1在郑州种成穗行，从bc3f1中根据植株叶夹角大小、结合qla7-1的双侧标记进行基因型分析，获得16个交换单株继续与沈137回交获得bc4f1，同时对交换单株bc3f1-8自交获得bc3f2-8；2016年冬在海南三亚，将bc4f1和bc3f2-8种植（同时，用snp玉米3k芯片对bc3f2-8的112个单株进行基因型分析），根据bc4f1群体的表型结合基因型选择了11株交换单株自交获得bc4f2；

2017春在郑州将获得bc4f2种植，根据bc4f2群体的表型结合基因型分析，获得19个交换单株并与沈137回交获得bc5f2；2017年冬在海南三亚将bc5f2种植，根据bc5f2群体的表型结合基因型分析，获得9株交换单株并对9个交换单株采用上述snp玉米3k芯片进行遗传背景分析，从中选择遗传背景回复率高的2个交换单株自交，进而获得在该位点纯合、遗传稳定的近等基因系。

实施例2

采用图位克隆技术分离zmcla7-1基因

利用bc4f2群体8723株作为精细定位群体，从中选择叶夹角小于或等于20°的单株有株812，用qla7-1双侧的标记pze-07122629825和pze-107077981分析其基因型，从中选择在pze-07122629825或pze-107077981处发生重组交换单株12株；同时选择叶夹角大于25°以上的单株673株，并结合分子标记选择筛选出7株叶夹角大的交换单株。利用新开发并具有多态性强的12对引物ssr7-1、ssr7-2、ssr7-3、ssr7-4、ssr7-5、ssr7-6、ssr7-8、ssr7-9、ssr7-10、ssr7-11、ssr7-12（标记开发方法参照张君，玉米叶夹角有关的zmcla4基因图位克隆与功能分析，河南农业大学博士学位论文，2014）分析交换单株基因型。根据交换单株目标区段的标记基因型，可以把qla7-1限定在标记ssr7-6和ssr7-10之间(图2a)。

为了进一步确定qla7-1为1个或多个候选基因，利用bc5f2群体6851株作为精细定位群体，从中选择叶夹角小于或等于20°单株有452株，用qla7-1双侧的标记ssr7-6和ssr7-10分析其基因型，从中选择在ssr7-6或ssr7-10处发生重组交换单株12株；同时选择叶夹角大于25°以上的单株386株并结合分子标记选择筛选出5株叶夹角大的交换单株。再利用具有多态性强的10标记（ssr7-7,ssr7-8,ssr7-9,ssr7-13,ssr7-14,ssr7-15,ssr7-16,ssr7-17,ssr7-18,ssr7-19）分析交换单株基因型。根据交换单株目标区段的标记基因型，可以把qla7-1限定在标记ssr7-15和ssr7-17之间（图2b）。

通过对标记ssr7-15/ssr7-17区间包含豫537a基因的纯合重组子与平展型自交系沈137的比较，表明来自于豫537a的等位基因减小穗上部叶夹角，而来自于沈137的等位基因增加穗上部叶夹角，ssr7-15/ssr7-17区间可能存在控制穗上部叶夹角的基因。结合b73基因组序列，标记ssr7-15/ssr7-17之间。利用maizegbd数据库搜索显示，有一个预测基因位于该区间之内，zm00001d021927和（图2c）。以沈137和沈137-nil76的mrna反转录成cdna为模板，分该候选基因，同时以上述2个材料的dna为模板，分离该候选基因的启动序列。通过序列差异性分析结果显示，该候选基因启动子序列在沈137和沈137-nil76中存在差异，而发现zm00001d021927基因的编码区和3’-utr区域没有有重要的碱基突变和插入/缺失。说明沈137和沈137-nil76的叶夹角大小存在差异是由于zm00001d021927在启动子区域序列的差异引起的。为进一步验证此结论，采用qtr-pcr技术（参照张君，玉米叶夹角有关的zmcla4基因图位克隆与功能分析，河南农业大学博士学位论文，2014）以9叶期的沈137和沈137-nil76叶片为材料，提取mrna并反转录成cdna；以这些cdna为模板分析zm00001d021927的表达量，结果表明，zm00001d021927在2个材料中存在显著差异（图2d）。这些结果表明沈137和沈137-nil76叶夹角存在差异是由zm00001d021927的表达量不同引起的，由此说明zm00001d021927就是qla7-1区域内调控玉米叶夹角的候选基因，命名为zmcla7-1。

实施例3

zmcla7-1正向调控玉米叶夹角

zmcla7-1在沈137中使叶夹角增大，在沈137-nil76中使叶夹角减小，因此我们检测了zmcla7-1基因的表达情况。qrt-pcr检测结果表明，从玉米生长发育的6-12叶期的叶片（图3）高效表达。就不同材料而言，zmcla7-1在沈137中的不同时期的表达量明显高于沈137-nil76（图3），表明zmcla7-1的表达量高玉米的叶夹角就相对增小，由此提出zmcla7-1作为正向调控因子调控玉米叶夹角的大小。

实施例4

zmcla7-1过表达转基因验证其基因功能

1、rnai（rna干扰）载体的构建

根据zmcla7-1基因的结构，我们在zmcla7-1基因的编码区域设计了一对rnai引物rnai-f序列如seqidno.3所示，其中-actagtggatcc-为酶切位点和rnai-r序列如seqidno.4所示，其中-agatctggtacc-,为酶切位点，从沈137中扩增出来，以该序列及其反向序列形成发卡结构插入到pjl1460载体中，从而形成pzmcla7-1-rnai载体。将重组质粒转化农杆菌感受态细胞，用于转化玉米自交系b104。

2、遗传转化

采用农杆菌介导的玉米遗传转化方法（参照王平安，基于rna干扰的抗粗缩病转基因玉米材料创制，河南农业大学硕士学位论文，2011）。以1.2-1.8mm的幼胚为受体材料,在od600值为0.5,侵染时间为10分钟条件下,用农杆菌lba4404侵染玉米幼胚,经共培养、静息培养、愈伤组织诱导、愈伤组织低压筛选(ppt浓度3mg/l)、高压筛选(ppt浓度6mg/l),获得再生植株；再生植株200mg/l除草剂(ppt)浓度表型筛选，剔除对除草剂敏感的幼苗，对除草剂钝感的幼苗提取叶片总dna，进行株标记基因(bar)、目的基因pcr检测，对检测出的阳性株移栽大田，自交获得t0代种子，完成对转基因t0代的鉴定过程。

本实施例共获得7株独立的转基因阳性株，其叶夹角表现不同程度的减小，而野生型对照株则叶夹角没有明显的变化（图4）。由此可见，通过rnai技术促使玉米中内源zmcla7-1基因的表达降低，导致玉米叶夹角显著减小，证明控制zmcla7-1基因的表达可应用培育株型紧凑、叶夹角小的自交系作为育种的基础材料，可用于培育耐密的育种杂交种在生产上推广应用。

实施例5

启动子的启动强弱分析

为了确定该基因表达量的差异是由于启动子还是编码区的改变，发明人对该基因的碱基序列进行了比对分析见图5a，由图5a可知，本申请的编码区含有duf822家族保守功能结构域，在差异株沈137和沈137-nil76中表达的蛋白质结构相同，而启动子序列发生了大量的缺失/插入，见图5a，两个灰色方框分别表示起始密码子和终止密码子；为进一步明确启动子差异是引起该基因表达量的改变的关键，发明人采用将沈137和沈137-nil76的启动子启动萤火虫荧光素酶报告基因（luc）（图5b上），由35s启动子启动的海肾荧光素酶为内参，检测报告基因的相对表达量，来表示启动子的启动强弱。通过农杆菌侵染烟草叶片，提取烟草蛋白，并由多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶的相对表达量，结果表明沈137的启动子启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达量显著高于沈137-nil76（图5b下），说明沈137的启动子启动基因表达的能力显著高于沈137-nil76。

由此可知，zmcla7-1基因启动子的碱基突变和插入/缺失导致基因表达量改变。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南农业大学郑州市种子站

<120>一种调控玉米叶夹角的正向调控因子及其应用

<141>2020-09-21

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