一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用。

背景技术：

玉米是目前反刍动物饲喂系统中精料的主要成分。淀粉约占玉米干物质的70％，是反刍动物的重要能量来源。反刍动物利用玉米淀粉的重要途径是利用瘤胃微生物对其降解。然而，尽管瘤胃环境较为复杂，存在广泛能够降解淀粉的微生物，但淀粉瘤胃消化率往往低于60％，对于干粉碎玉米通常会低于50％，而我国反刍动物养殖体系中用的最多的恰恰就是干粉碎玉米。瘤胃淀粉消化率不足会抑制瘤胃微生物蛋白合成，进而降低动物的生产性能。因此，提高淀粉的瘤胃消化率是优化淀粉能量供应和提高动物生产的重要举措。影响玉米淀粉瘤胃消化率的因素包括玉米的种类、刈割时间、淀粉组成(直链、支链淀粉比例)、加工方式以及玉米醇溶蛋白含量等。其中，近年来关于玉米中玉米醇溶蛋白含量对反刍动物瘤胃淀粉降解影响的研究备受关注。

玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要贮存蛋白质，与淀粉颗粒以交联复合体的形式存在，不溶于水、低盐溶液以及瘤胃环境，但可溶于60％～95％的乙醇溶液。玉米醇溶蛋白的瘤胃不溶特性决定了其在瘤胃中很难被微生物降解，进而限制瘤胃微生物与淀粉颗粒的接触，导致淀粉降解性下降。研究显示，玉米醇溶蛋白含量由7.6％增加至9.1％时，瘤胃淀粉有效降解率由61.9％降至46.2％。与此类似，在另外一个研究中，玉米醇溶蛋白含量由3.09％增加到6.04％，体外瘤胃淀粉降解率由62.1％降至52.9％，瘤胃有效降解率则由49.3％降至39.6％，回归统计显示，玉米醇溶蛋白与体外瘤胃淀粉降解率、瘤胃淀粉有效降解率均呈极显著的负相关关系。综上可知，玉米醇溶蛋白对玉米中淀粉的瘤胃消化起显著的抑制作用，寻找降解玉米醇溶蛋白的有效措施，是提高瘤胃淀粉消化率的重要途径。

对于如何降解玉米中的玉米醇溶蛋白，目前主要采用对玉米进行加工处理、添加外源酶制剂等措施。对玉米籽粒进行蒸汽压片、青贮发酵处理，可在一定程度上破坏或降解玉米醇溶蛋白，提高淀粉的瘤胃消化率，但存在能耗和成本较高的缺陷；而对玉米籽粒进行青贮发酵主要应用于高水分玉米，该措施不适用于我国当前的畜牧生产环境。一些工业领域尝试利用碱性、中性、酸性蛋白酶、以及微生物发酵复合酶去降解玉米醇溶蛋白，但收效甚微，即使这些酶在最适作用条件下，对玉米醇溶蛋白的降解率也仅为15-33％，这主要是因为，选择的酶在降解玉米醇溶蛋白方面缺乏专一性，这突显出选择玉米醇溶蛋白专一性降解酶的重要性。

玉米种子在萌发过程中会动用贮存蛋白以提供胚芽生长所必须的营养物质。研究发现，玉米种子在萌发过程中会通过分泌的专一性玉米醇溶蛋白降解酶(zein-degradingprotease，zdp)将贮存蛋白(含玉米醇溶蛋白)几乎全部降解。但玉米种子在萌发过程中产生的蛋白成分复杂，且分泌的玉米醇溶蛋白降解酶浓度较低，分离纯化较为困难，这阻碍了它在生产中的进一步应用。

因此，提供一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，具体步骤如下：

(1)优化玉米醇溶蛋白降解酶基因；

(2)构建重组表达载体ppiczαa-zdp；

(3)将重组表达载体ppiczαa-zdp转化毕赤酵母，获得阳性克隆，进行培养；

(4)将培养的菌液离心，获得培养上清液；进行亲和层析纯化，获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶。

进一步，步骤(1)根据毕赤酵母的密码子偏好性和ppiczαa载体特点，对玉米醇溶蛋白降解酶基因进行优化，优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因为seqidno.1。

进一步，步骤(2)构建重组表达载体ppiczαa-zdp的具体步骤如下：利用ecori和xbai限制性内切酶分别对玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表达质粒ppiczαa进行双酶切；胶回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和ppiczαa质粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，t4连接酶和缓冲液5μl，纯化的ppiczαa载体1μl混匀，16℃循环水浴孵育过夜；转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，于含amp的lb培养基中筛选阳性克隆；挑取白色菌落加入到含amp的液体lb培养基中，37℃震荡过夜培养，待培养基浑浊后，提取重组表达载体质粒ppiczαa-zdp，并进行酶切验证。

进一步，步骤(3)转化毕赤酵母的具体步骤如下：利用限制性内切酶saci对重组表达载体ppiczαa-zdp进行酶切，对酶切产物进行纯化；纯化的表达载体ppiczαa-zdp转入毕赤酵母x33感受态细胞，于含博来霉素的ypd培养基中培养，通过pcr扩增反应筛选阳性克隆；挑取1个阳性克隆白色菌落加入到2mlypd培养基中，30℃、160rpm震荡过夜培养；将全部菌液转入到200mlbmgy培养基中，30℃震荡过夜培养，用于发酵罐培养。

进一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在水解玉米醇溶蛋白中的应用。

进一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在促进淀粉酶降解玉米淀粉中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用，利用现代分子技术成功优化了玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达玉米醇溶蛋白降解酶的表达载体ppiczαa-zdp，利用该载体和毕赤酵母能够制备玉米醇溶蛋白降解酶，进而为玉米醇溶蛋白降解酶在生产中的应用提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明重组玉米醇溶蛋白降解酶的sds-page和westernblot分析；

其中，泳道1、蛋白质marker；泳道2、纯化的玉米醇溶蛋白降解酶sds-page分析；3、玉米醇溶蛋白降解酶的westernblot分析；

图2附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶的最适ph确定；

图3附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶的最适温度确定；

图4附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶对商品玉米醇溶蛋白的降解；

图5附图为本发明对照组干粉碎玉米的扫描电镜图；比例尺大小为20μm；

图6附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶处理组干粉碎玉米的扫描电镜图；比例尺大小为20μm；

图7附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶对干粉碎玉米的水解作用；

图8附图为本发明玉米醇溶蛋白降解酶对淀粉酶降解玉米中淀粉的协同促进作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

大肠杆菌感受态细胞dh5α购自天根生化科技(北京)有限公司(cb101-01)；毕赤酵母和表达载体ppiczαa本实验室保存；dna胶回收试剂盒(sk8743)、pcr产物纯化试剂盒(sk8741)、质粒小提试剂盒(sk8791)购自生工生物工程股份有限公司，t4-dna连接酶，premixtaq(extaqversion2.0)pcr混合液(rr003a)、限制性内切酶ecori、saci、xbai、pmd19-t克隆载体试剂盒购自大连宝生物工程公司。

实施例1玉米醇溶蛋白降解酶基因的优化

根据毕赤酵母的密码子偏好性和ppiczαa载体特点，对ncbi中玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列(genbank:nm_001137099.2，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_001137099.2/)进行优化，优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因如下：

attgaatttgatgagagagatttggcttctgatgaagctttgtgggatttgtacgagagatggcaaactcatcacagagttcatagacatcacggtgaaaagggtagaagatttggtactttcaaagagaacgctagattcattcatgctcacaataagagaggagatagaccatatagattgagattgaacagattcggagatatgggtagagaagagtttagatctggtttcgctgattccagaattaacgatttgagaagagagccaactgctgctccagctgttcctggttttatgtacgatgatgctactgatttgcctagatctgttgattggagacaaaagggtgctgttactgctgttaaaaaccaaggtagatgtggttcttgttgggctttctctactgttgttgctgttgaaggtattaatgctattagaactggttctttggtttctttgtctgaacaagagttgattgattgtgatactgatgaaaacggttgtcaaggtggtttgatggaaaacgctttcgagttcattaagtctcatggtggtattactactgagtctgcttacccttatcacgcttctaacggtacttgtgatggtgctagagctagaagaggtagagttgttgctattgatggtcatcaagctgttccagctggttctgaagatgctttggctaaagctgttgctcaccaacctgtttctgttgctattgatgctggtggtcaagctttgcaattttactctgagggtgttttcactggagattgtggtactgatttggatcacggtgttgctgctgttggttacggtgtttctgatgatggtactccatactggatcgttaaaaattcttggggtccttcttggggtgaaggtggttatattagaatgcaaagaggtactggtaacggtggtttgtgtggtattgctatggaggcttctttcccaattaagacttctccaaatccttccagaaaacctagaagagctttgattactagagatgcttcttctcaa；seqidno.1。

并在优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因片段两端添加限制性内切酶ecori和xbai位点，获得玉米醇溶蛋白降解酶基因片段。

实施例2重组表达载体ppiczαa-zdp的构建

利用ecori和xbai限制性内切酶分别对玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表达质粒ppiczαa进行双酶切，酶切体系为：10×quickcutbuffer5μl，ecori1μl，xbai1μl，质粒8μl，灭菌水35μl，37℃孵育10-15min。胶回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和ppiczαa质粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，t4连接酶和缓冲液5μl，纯化的ppiczαa载体1μl混匀，16℃循环水浴孵育过夜。转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，于含100μg/mlamp的lb培养基中筛选阳性克隆。挑取白色菌落加入到含100μg/mlamp的液体lb培养基中，37℃震荡过夜培养，待培养基浑浊后，利用质粒提取试剂盒提取重组表达载体质粒ppiczαa-zdp，并进行酶切验证。

构建的ppiczαa-zdp基因序列如下：

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctgaattcattgaatttgatgagagagatttggcttctgatgaagctttgtgggatttgtacgagagatggcaaactcatcacagagttcatagacatcacggtgaaaagggtagaagatttggtactttcaaagagaacgctagattcattcatgctcacaataagagaggagatagaccatatagattgagattgaacagattcggagatatgggtagagaagagtttagatctggtttcgctgattccagaattaacgatttgagaagagagccaactgctgctccagctgttcctggttttatgtacgatgatgctactgatttgcctagatctgttgattggagacaaaagggtgctgttactgctgttaaaaaccaaggtagatgtggttcttgttgggctttctctactgttgttgctgttgaaggtattaatgctattagaactggttctttggtttctttgtctgaacaagagttgattgattgtgatactgatgaaaacggttgtcaaggtggtttgatggaaaacgctttcgagttcattaagtctcatggtggtattactactgagtctgcttacccttatcacgcttctaacggtacttgtgatggtgctagagctagaagaggtagagttgttgctattgatggtcatcaagctgttccagctggttctgaagatgctttggctaaagctgttgctcaccaacctgtttctgttgctattgatgctggtggtcaagctttgcaattttactctgagggtgttttcactggagattgtggtactgatttggatcacggtgttgctgctgttggttacggtgtttctgatgatggtactccatactggatcgttaaaaattcttggggtccttcttggggtgaaggtggttatattagaatgcaaagaggtactggtaacggtggtttgtgtggtattgctatggaggcttctttcccaattaagacttctccaaatccttccagaaaacctagaagagctttgattactagagatgcttcttctcaatttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc；seqidno.2。

实施例3转化毕赤酵母

利用限制性内切酶saci对重组表达载体ppiczαa-zdp进行酶切，酶切体系为：10×quickcutbuffer5μl，saci1μl，质粒8μl，灭菌水36μl，37℃孵育10-15min。利用pcr产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化；利用电穿孔仪将纯化的表达载体ppiczαa-zdp转入毕赤酵母x33感受态细胞，于含30μg/ml博来霉素的ypd培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中培养，利用zdp特异性引物(5’-gatttgtacgagagatggc-3’；seqidno.3；和5’-tctggaaggatttggagaagtc-3’；seqidno.4)通过pcr扩增反应筛选阳性克隆，pcr反应条件为：94℃预变性1min；98℃10s，55℃15s，68℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。挑取1个阳性克隆白色菌落加入到2mlypd培养基中，30℃、160rpm震荡过夜培养。将全部菌液转入到200mlbmgy培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源基础，4×10^-5％生物素，100mm磷酸钾缓冲液ph6.0，1％甘油)中，30℃震荡过夜培养，用于发酵罐培养。

实施例4发酵罐培养

将1.5-2l的发酵基础盐培养基(每升含26.7ml85％磷酸，0.93g硫酸钙，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，40g甘油)加入到发酵罐中，121℃下高压灭菌20min，冷却至室温；将4-5ml微量元素盐培养基通过0.22μm滤头加入到发酵罐中；调试发酵罐，使其温度为30℃，ph为5-6；将实施例3中的菌液在无菌条件下全部加入到发酵罐中，进行培养；培养至溶氧量大于60％，补加50％甘油培养基(纯甘油稀释为50％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甘油含12-13ml微量元素盐培养基)，培养24h，停止补加50％甘油培养基，溶氧量大于60％的状态持续4-5h后，开始补加100％甲醇培养基(纯甲醇为100％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甲醇含12-13ml微量元素盐培养基，微量元素盐培养基每升含6g五水硫酸铜，0.08g碘化钠，3g一水硫酸锰，0.2g二水钼酸钠，0.02g硼酸，0.5g氯化钴，20g氯化锌，65g七水硫酸亚铁，0.2g生物素，5ml硫酸，加水至1l)，流速为3-10ml/每小时每初始培养液体积，调节转速和通气量，保证发酵液溶氧量不低于20％，持续培养72-120h。

将培养的菌液离心，获得培养上清液。通过装备有10kda有机膜的膜分离系统，对获得的上清液进行浓缩，并用ph8.0的bindingbuffer(含0.05m磷酸二氢钠和0.3m氯化钠)换液，之后通过5ml镍柱和低压层析系统进行亲和层析，流速为1.5ml/min。结合在镍柱上的玉米醇溶蛋白降解酶首先用ph8.0的washingbuffer(含0.05m咪唑，0.05m磷酸二氢钠和0.3m氯化钠)冲洗，最后用elutionbuffer(含0.25m咪唑，0.05m磷酸二氢钠和0.3m氯化钠)冲洗收集，获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶。

利用sds-page和westernblot技术测定纯化的玉米醇溶蛋白降解酶的分子量和纯度，结果见图1。图1结果显示，本发明重组的玉米醇溶蛋白降解酶表达成功，分子量为41kda，纯度为30％。

实施例5玉米醇溶蛋白降解酶的特性鉴定

将0.5微克纯化的玉米醇溶蛋白降解酶，0.25％偶氮酪蛋白，100mm柠檬酸缓冲液(ph3.0-7.0)的反应体系置于40℃的气浴摇床中，震荡培养2h，之后用12％三氯乙酸溶液按照1:1比例添加到反应体系中，冰中放置30min，340nm下测定吸光度，计算与对照组(不添加酶)吸光度的差值，确定玉米醇溶蛋白降解酶对ph的依赖性，结果见图2。图2结果显示，玉米醇溶蛋白降解酶在ph5.0条件下的活性最强。同理，将反应体系置于ph5.0的缓冲液中，20-80℃下震荡培养2h，确定玉米醇溶蛋白降解酶对温度的依赖性，结果见图3。图3结果显示，本发明中玉米醇溶蛋白降解酶的最适温度为40℃。将玉米醇溶蛋白降解酶提前在20-80℃放置1h，之后再按照上面程序在40℃和ph5.0下测定剩余的酶活性，确定玉米醇溶蛋白的温度耐受性；结果显示，提前在20-40℃下放置1h几乎不影响玉米醇溶蛋白降解酶的活性；在50-80℃下放置1h后，玉米醇溶蛋白降解酶仍然保留有70％以上的活性，说明本发明中的玉米醇溶蛋白降解酶对温度具有较好的耐受性。

实施例6玉米醇溶蛋白降解酶对纯玉米醇溶蛋白的水解

处理组：称取20mg玉米醇溶蛋白(z3625，sigma公司)，加入1ml含0.7、1.4、2.8微克纯化的玉米醇溶蛋白降解酶、5mm二硫苏糖醇的0.1m的柠檬酸缓冲液，40℃下震荡培养2h，测定氨基酸含量。对照组不加玉米醇溶蛋白降解酶，其他条件与处理组相同，结果见图4。图4结果显示，与对照组相比，0.7、1.4、2.8微克纯化的玉米醇溶蛋白降解酶在降解玉米醇溶蛋白过程产生的氨基酸增加了4.3、6.9、6.3微摩尔。表明本发明中的玉米醇溶蛋白降解酶对纯的玉米醇溶蛋白具有明显的降解能力。

实施例7玉米醇溶蛋白降解酶对玉米颗粒结构的影响

为了表明玉米醇溶蛋白降解酶能够降解玉米颗粒表面的醇溶蛋白，称取50mg干粉碎的玉米分别放入离心管中，加入1ml含纯化的玉米醇溶蛋白降解酶2.8微克的0.1m的柠檬酸缓冲液，40℃下震荡培养12h，离心，将获得的残渣干燥，进行扫描电镜观察，结果见图5-图6。图5-图6结果显示，对照组(没有加入玉米醇溶蛋白降解酶)玉米颗粒的表面和经玉米醇溶蛋白降解酶处理后的玉米颗粒的表面具有明显的不同。对照组的玉米颗粒中大部分淀粉颗粒深深嵌入在玉米醇溶蛋白基质中，使淀粉-玉米醇溶蛋白交联结构更加致密。而玉米醇溶蛋白降解酶处理明显损伤和降解了交联淀粉的玉米醇溶蛋白，导致淀粉-玉米醇溶蛋白交联结构解体，释放出疏松光滑的淀粉球状颗粒。这些结果清晰直观地显示并验证了玉米醇溶蛋白降解酶对玉米醇溶蛋白的降解。

实施例8玉米醇溶蛋白降解酶对干粉碎玉米的水解以及对淀粉酶降解玉米淀粉的协同促进作用

处理组：称取50mg干粉碎的玉米分别放入离心管中，加入1ml含纯化的玉米醇溶蛋白降解酶2.8微克的0.1m的柠檬酸缓冲液，40℃下震荡培养4、8、12h，离心，测定上清液中释放的氨基酸浓度。将固体残渣重悬于1mlpbs溶液中，加入淀粉酶，40℃下孵育30min，测定释放的还原糖含量。对照组不加玉米醇溶蛋白降解酶，其他条件与处理组相同，结果见图7-图8。结果显示，与对照组相比，随着培养时间的延长，玉米醇溶蛋白降解酶使上清液中氨基酸的释放量由4h的2.5微摩尔增加到12h的6.1微摩尔(图7)，再一次表明玉米醇溶蛋白降解酶能够降解干粉碎玉米中的玉米醇溶蛋白。另外，淀粉酶降解经玉米醇溶蛋白降解酶处理后的玉米残渣产生的还原糖较对照组高了83.3(8h)和95.0微摩尔(12h)(图8)，表明玉米醇溶蛋白降解酶协同促进了淀粉酶对玉米的降解。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>江西农业大学

<120>一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1032

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

attgaatttgatgagagagatttggcttctgatgaagctttgtgggatttgtacgagaga60

tggcaaactcatcacagagttcatagacatcacggtgaaaagggtagaagatttggtact120

ttcaaagagaacgctagattcattcatgctcacaataagagaggagatagaccatataga180

ttgagattgaacagattcggagatatgggtagagaagagtttagatctggtttcgctgat240

tccagaattaacgatttgagaagagagccaactgctgctccagctgttcctggttttatg300

tacgatgatgctactgatttgcctagatctgttgattggagacaaaagggtgctgttact360

gctgttaaaaaccaaggtagatgtggttcttgttgggctttctctactgttgttgctgtt420

gaaggtattaatgctattagaactggttctttggtttctttgtctgaacaagagttgatt480

gattgtgatactgatgaaaacggttgtcaaggtggtttgatggaaaacgctttcgagttc540

attaagtctcatggtggtattactactgagtctgcttacccttatcacgcttctaacggt600

acttgtgatggtgctagagctagaagaggtagagttgttgctattgatggtcatcaagct660

gttccagctggttctgaagatgctttggctaaagctgttgctcaccaacctgtttctgtt720

gctattgatgctggtggtcaagctttgcaattttactctgagggtgttttcactggagat780

tgtggtactgatttggatcacggtgttgctgctgttggttacggtgtttctgatgatggt840

actccatactggatcgttaaaaattcttggggtccttcttggggtgaaggtggttatatt900

agaatgcaaagaggtactggtaacggtggtttgtgtggtattgctatggaggcttctttc960

ccaattaagacttctccaaatccttccagaaaacctagaagagctttgattactagagat1020

gcttcttctcaa1032

<210>2

<211>4570

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacag60

gtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgt120

tgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaacc180

agcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctacta240

acaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgttta300

tttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctg360

agtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgct420

gtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcg480

ttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgt540

cttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtct600

ctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgct660

ttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatact720

gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaat780

atataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagctt840

actttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacga900

caacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttt960

tactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacaga1020

agatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaagggga1080

tttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaa1140

tactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggc1200

tgaagctgaattcattgaatttgatgagagagatttggcttctgatgaagctttgtggga1260

tttgtacgagagatggcaaactcatcacagagttcatagacatcacggtgaaaagggtag1320

aagatttggtactttcaaagagaacgctagattcattcatgctcacaataagagaggaga1380

tagaccatatagattgagattgaacagattcggagatatgggtagagaagagtttagatc1440

tggtttcgctgattccagaattaacgatttgagaagagagccaactgctgctccagctgt1500

tcctggttttatgtacgatgatgctactgatttgcctagatctgttgattggagacaaaa1560

gggtgctgttactgctgttaaaaaccaaggtagatgtggttcttgttgggctttctctac1620

tgttgttgctgttgaaggtattaatgctattagaactggttctttggtttctttgtctga1680

acaagagttgattgattgtgatactgatgaaaacggttgtcaaggtggtttgatggaaaa1740

cgctttcgagttcattaagtctcatggtggtattactactgagtctgcttacccttatca1800

cgcttctaacggtacttgtgatggtgctagagctagaagaggtagagttgttgctattga1860

tggtcatcaagctgttccagctggttctgaagatgctttggctaaagctgttgctcacca1920

acctgtttctgttgctattgatgctggtggtcaagctttgcaattttactctgagggtgt1980

tttcactggagattgtggtactgatttggatcacggtgttgctgctgttggttacggtgt2040

ttctgatgatggtactccatactggatcgttaaaaattcttggggtccttcttggggtga2100

aggtggttatattagaatgcaaagaggtactggtaacggtggtttgtgtggtattgctat2160

ggaggcttctttcccaattaagacttctccaaatccttccagaaaacctagaagagcttt2220

gattactagagatgcttcttctcaatttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatct2280

gaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactg2340

ttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagag2400

gatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttg2460

taacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcc2520

tgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcg2580

agtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgaga2640

ccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactcctttttta2700

ctcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcaca2760

gcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggt2820

ttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaa2880

tttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgac2940

ctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcattttt3000

cttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaa3060

tctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacga3120

caaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcg3180

cgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgt3240

ggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtcca3300

ggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagct3360

gtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccat3420

gaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaa3480

ctgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcc3540

caggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcac3600

gcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaac3660

ctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttattta3720

tatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactga3780

aaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagacca3840

acatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgt3900

ttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggt3960

ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgc4020

gctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaa4080

gcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgct4140

ccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggta4200

actatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactg4260

gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggc4320

ctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtta4380

ccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtg4440

gtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctt4500

tgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttgg4560

tcatgagatc4570

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

gatttgtacgagagatggc19

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

tctggaaggatttggagaagtc22