共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及共表达分泌型il-7和选择性ccl19的表达载体及其应用。

背景技术：

嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell，car-t)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(car)的基因序列转导入t细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞。

近年来，car-t疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得令人瞩目的成果，美国fda已经批准了两种靶向cd19的car-t细胞产品上市，国内也有多家公司针对cd19的靶点开展了临床试验。但是，car-t细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是缺乏合适的靶抗原，car-t细胞在体内持续时间短，存在免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等问题。

现有技术cn107109421a、cn109153989a将编码il-7和ccl19的核酸序列由编码自切割肽的序列连接，构建的car-t细胞持续分泌il-7和ccl19，不仅提高了car-t细胞的体外扩增能力，而且招募到更多的外周血循环t细胞和树突状细胞，增强了car-t细胞的抗肿瘤效果。

但是，当car-t细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，ccl19会将外周血循环t细胞和树突状细胞招募到特定部位，降低了t细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率，不能实现将外周血免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部的效果。此外，il-7蛋白分泌到胞外受到t细胞的严格控制，存在外源il-7蛋白无法分泌到t细胞外的问题。

因此，有必要对现有技术进行改进，使得car-t细胞不仅能将il-7分泌到t细胞外，而且使ccl19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了共表达分泌型il-7和选择性ccl19的表达载体及其应用，含有所述表达载体的car-t细胞不仅能将il-7分泌到t细胞外，而且使ccl19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，进一步提高了car-t的肿瘤杀伤能力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种共表达分泌型il-7和选择性ccl19的表达载体，所述表达载体包括il-6信号肽编码基因、il-7编码基因、nfat调控型启动子和ccl19编码基因。

本发明中，将il-7信号肽替换为t细胞分泌蛋白il-6的信号肽，在il-7编码基因的上游添加il-6信号肽的编码基因，实现了t细胞对il-7的分泌性表达；采用nfat调控型启动子作为ccl19编码基因的启动子，实现了t细胞对ccl19的选择性表达。

优选地，所述il-6信号肽编码基因包括seqidno:1所示的核酸序列；

seqidno:1：

atgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctggggctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgcccca。

优选地，所述il-7编码基因包括seqidno:2所示的核酸序列；

seqidno:2：

gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac。

优选地，所述nfat调控型启动子包括seqidno:3所示的核酸序列；

seqidno:3：

ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。

优选地，所述ccl19编码基因包括seqidno:4所示的核酸序列；

seqidno:4：

atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第一方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293t细胞或293f细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体t细胞，所述嵌合抗原受体t细胞表达特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体、分泌型il-7和选择性ccl19。

优选地，所述嵌合抗原受体t细胞包括第一方面所述的表达载体和/或第二方面所述的重组慢病毒。

本发明中，采用第一方面所述的表达载体和/或第二方面所述的重组慢病毒构建的car-t细胞可以将外源性il-7分泌到t细胞外，充分发挥il-7对t细胞的体外增殖能力的促进作用；同时在car-t细胞识别肿瘤抗原被激活的情况下才表达ccl19，保证car-t细胞在肿瘤内部时才表达分泌ccl19，显著提高了car-t的杀伤效率。

优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。

优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括cd19、cd20、cd22、cd30、cea、egfr、braf、her-2、mesothelin、muc1、psca、gpc3、tert、pten、pd-1、pd-l1或vegf中的任意一种，优选为cd19、muc1、gpc3、mesothelin、psca或her2中的任意一种，进一步优选为mesothelin。

优选地，所述跨膜结构域包括cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，优选为cd8α跨膜结构域。

优选地，所述信号传导结构域包括cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr2、4-1bb、tlr1、cd27、ox40或dap10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1bb和cd3ζ的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体由gm-csf信号肽、mesothelin(msln)抗原结合结构域、cd8α跨膜结构域、4-1bb和cd3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗体受体包括seqidno:5所示的氨基酸序列；

seqidno:5：

mlllvtslllcelphpafllsqvqlqqsgpglvtpsqtlsltcaisgdsvssnsatwnwirqspsrglewlgrtyyrskwyndyavsvksrmsinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycargmmtyyygmdvwgqgttvtvssgilgsggggsggggsggggsqpvltqssslsaspgasasltctlrsginvgpyriywyqqkpgsppqyllnyksdsdkqqgsgvpsrfsgskdasanagvllisglrsedeadyycmiwhssaavfgggtqltvlsgileqqgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

优选地，所述分泌型il-7包括seqidno:6所示的氨基酸序列；

seqidno:6：

mnsfstsafgpvafslglllvlpaafpapdcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh。

优选地，所述选择性ccl19包括seqidno:7所示的氨基酸序列；

seqidno:7：

malllalsllvlwtspaptlsgtndaedcclsvtqkpipgyivrnfhyllikdgcrvpavvfttlrgrqlcappdqpwveriiqrlqrtsakmkrrss。

第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的嵌合抗原受体t细胞的制备方法，所述制备方法包括将第一方面所述的表达载体或第二方面所述的重组慢病毒导入t细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第三方面所述的嵌合抗原受体t细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的表达载体、第二方面所述的重组慢病毒、第三方面所述的嵌合抗原受体t细胞或第五方面所述的药物组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的表达载体，在il-7编码基因的上游添加il-6信号肽的编码基因，并采用nfat调控型启动子作为ccl19编码基因的启动子，含有所述表达载体的car-t细胞实现了t细胞对il-7的分泌性表达和对ccl19的选择性表达；

(2)本发明的car-t细胞分泌型表达il-7、选择性表达ccl19，增殖能力和肿瘤细胞杀伤效率均得到显著提高，治疗过程中炎症副反应低，在实体瘤治疗领域具有重要意义。

附图说明

图1为不同car-t细胞分泌il-7和ccl19的结果；

图2为不同car-t细胞连续10天的增殖结果；

图3为不同car-t细胞对t细胞的招募能力。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1慢病毒载体的制备

全基因合成以下核酸分子：

①由gm-csf信号肽、mslnscfv、cd8α、4-1bb和cd3ζ的核酸序列串联形成的car分子(氨基酸序列如seqidno:5所示)；

②由il-7信号肽(seqidno:8)和il-7(不含il-7信号肽)(seqidno:2)、2a肽(seqidno:9)和ccl19(seqidno:4)的核酸序列串联形成的核酸分子；

③由il-6信号肽(seqidno:1)和il-7(不含il-7信号肽)(seqidno:2)的核酸序列串联形成的分泌型il-7分子；

④由2×nfat-re-minp启动子(seqidno:3)和ccl19(seqidno:4)串联形成的选择性ccl19分子；

seqidno:8：

atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatct；

seqidno:9：

aaaattgtcgctcctgtcaaacaaactcttaactttgatttactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtcca。

将合成的car分子克隆至慢病毒表达载体pwpxld-egfp中；将合成的il-7信号肽、il-7(不含il-7信号肽)、2a肽和ccl19的核酸序列串联形成的核酸分子克隆至pwpxld-tcd19中；将合成的il-6信号肽和il-7(不含il-7信号肽)的核酸序列串联形成的分泌型il-7分子克隆至pwpxld-tcd19中，随后将合成的2×nfat-re-minp启动子和ccl19串联形成的选择性ccl19分子以相反的方向克隆至pwpxld-tcd19的末端。

实施例2重组慢病毒包装

本实施例采用293t细胞制备重组慢病毒，当293t细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为6ml/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pwpxld-表达质粒包括表达car分子的慢病毒载体，表达完整il-7和ccl19的慢病毒载体，或表达分泌型il-7和选择性ccl19的慢病毒载体；

表1

将36μgpei加至另一500μlopti-mem培养基内，混匀，室温静置5min；

将表1所示的质粒混合液与pei混合，吹打混匀，室温静置25～30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293t细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为7ml/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293t细胞补加培养基，加入量为7ml/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达car的重组慢病毒、表达完整il-7和ccl19的重组慢病毒、表达分泌型il-7和选择性ccl19的重组慢病毒，4℃保存待用。

实施例3t细胞激活和慢病毒转染

采用ficoll密度梯度离心试剂盒(ge公司)从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，去除红细胞后，再利用macspan-t磁珠分选出t细胞；

分选出来的t细胞采用培养基(aim-v培养基+5％fbs+青霉素100u/ml+链霉素0.1mg/ml)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/ml待用；

采用cd2/cd3/cd28t细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活t细胞，即包被磁珠与t细胞以1:2比例混合，t细胞最终密度为5×10⁶个/ml/cm²，混合后，置于37℃、5％co2培养箱培养刺激48h；

t细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬t细胞，分别加入表达car的重组慢病毒、表达完整il-7和ccl19的重组慢病毒或表达分泌型il-7和选择性ccl19的重组慢病毒(moi＝10)，并加入8μg/mlpolybrene和300iu/mlil-2，置于37℃、5％co2培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/mlil-2的新鲜培养基重悬t细胞，即得car-t细胞；

将car-t细胞密度维持在1×10⁶个/ml左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，car-t细胞数扩增了100倍。

本实施例构建的car-t细胞分别为mslncar-t(表达car)、msln-7×19car-t(表达car、il-7和ccl19)和msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t(表达car、分泌型il-7和选择性ccl19)。

实施例4car-t细胞对il-7和ccl19的分泌

取实施例3制备的三种car-t细胞各2×10⁶个，用新鲜的t细胞培养基培养24小时，收集细胞上清；同时取2×10⁶个msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t，与等量的胃癌细胞bgc823共培养24h，收集细胞上清；采用elisa试剂盒(r&dsystem)检测每种细胞对il-7和ccl19的分泌情况。

如图1所示，mslncar-t细胞的培养上清中无il-7和ccl19，msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t细胞的培养上清中只有il-7、没有ccl19，与bgc823共培养后，msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t细胞的培养上清中能同时检测到il-7和ccl19，说明msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t细胞可以顺利将il-7分泌到胞外，且只有当car-t细胞被肿瘤抗原激活后才表达分泌ccl19。

实施例5car-t细胞的体外增殖实验

取实施例3制备的三种car-t细胞各2×10⁶个，用新鲜的t细胞培养基培养，每两天进行计数，连续培养10天，分析car-t细胞的增殖情况。

结果图2所示，msln-7×19car-t由于不分泌il-7，对car-t细胞没有促进增殖的作用；msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t表达的il-7可以顺利分泌到胞外，显著促进了car-t细胞的增殖，10天后，msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t的数量约为msln-7×19car-t的10倍。

实施例6car-t细胞的体外迁移实验

取实施例3制备的三种car-t细胞各2×10⁶个，于transwell装置下层培养24h，同时取等量的msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t和bgc823于下层共培养24h，取cfse标记的野生t细胞于上层培养5h，用流式细胞仪检测下层细胞中cfse标记的t细胞的数量。

统计结果如图3所示，与mslncar-t相比，msln-7×19car-t可以招募到更多的t细胞，msln-secil7×nfatpro-ccl19car-t在被肿瘤抗原激活后也招募到了更多的t细胞。

综上所述，本发明构建的表达载体，在il-7编码基因的上游添加il-6信号肽的编码基因，并采用nfat调控型启动子作为ccl19编码基因的启动子，含有所述表达载体的car-t细胞实现了t细胞对il-7的分泌性表达和对ccl19的选择性表达，增殖能力和肿瘤细胞杀伤效率均得到显著提高，治疗过程中炎症副反应低，在实体瘤治疗领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120>共表达分泌型il-7和选择性ccl19的表达载体及其应用

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