一种蜂毒多肽提取物及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及蜂毒提取技术领域，涉及一种蜂毒提取物及其制备方法和应用，具体涉及一种蜂毒多肽提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
蜂毒是工蜂毒腺分泌的一种具有芳香气味的透明液体，主要由多肽类、活性酶类、非肽类物质组成，蛋白质多肽类物质是蜂毒中的主要成分，约占蜂毒的70％-80％。蜂毒肽是由26个氨基酸残基组成的多肽，分子量为2840da，约占蜂毒干重的50％。蜂毒肽具有抗炎、抑菌、抗癌、抗辐射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治疗肩周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等多种疾病，在医药领域具有一定的应用。
[0003]
蜂毒肽是从蜂毒中分离纯化得来的，具有生物活性高、不污染环境等特点，可以研制开发出机体免疫调节剂等产品，具有很大的市场开发前景，因而引起了学术界广泛的关注。
[0004]
用溶媒萃取、三柱层析、溶媒萃取与三柱层析相结合等方法制备蜂毒肽，其产品制备过程繁琐，生产周期较长，有机溶剂使用量大。
[0005]
刘岭等(刘岭，李昌全，黄雪强.蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究[j].中国生化药物杂质.2003，24(4)：16-17)和杨文超等(杨文超，蜂毒肽的分离纯化及其抗辐射作用机理研究[d]，福建农林大学，2007.)报道了三柱层析法制备蜂毒肽，蜂毒肽得率约为48.67％(质量分数)，纯度为97.32％(质量分数)，纯度较高，解决了有机溶剂用量大的问题，但是提取过程复杂，提取时间较长。
[0006]
cn107056913a公开了一种蜂毒肽的分离纯化方法，属于生物技术领域。所述蜂毒肽为从蜂毒中提取得来的多肽，采用葡聚糖凝胶色谱、冷冻干燥，结合离心、乙醇沉淀的分离方法，获得蜂毒肽。该发明的蜂毒肽，得率较高，生产用时短，工艺简单，纯度为电泳纯。但是，该发明的制备方法制得的蜂毒肽的抗氧化性和抗炎活性有待进一步提高。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蜂毒多肽提取物及其制备方法和应用，本发明的制备方法工艺简单，蜂毒多肽提取物的得率高，纯度大，制得的蜂毒多肽提取物具有良好的抗氧化性和抗炎活性。
[0008]
本发明的目的之一在于提供一种蜂毒多肽提取物，为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]
本发明的一种蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
1)收集蜜蜂毒液，加纯水混合均匀，减压抽滤除去蜜蜂螫针；
[0011]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0012]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过色谱凝胶柱进行纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物。
[0013]
本发明的制备方法，采用减压抽滤、冷冻干燥得到蜂毒多肽粗提物，再利用色谱凝胶柱进行低温纯化除杂制备蜂毒多肽提取物，制得的蜂毒多肽提取物具有良好的抗氧化性和抗炎活性，工艺简单、耗时短、成本低、易于工厂化大规模生产。
[0014]
步骤1)中，所述蜜蜂毒液的质量与所述纯水的体积比为(1-25)g:100ml，例如所述蜜蜂毒液的质量与所述纯水的体积比为1g:100ml、2g:100ml、3g:100ml、4g:100ml、5g:100ml、6g:100ml、7g:100ml、8g:100ml、9g:100ml、10g:100ml、11g:100ml、12g:100ml、13g:100ml、14g:100ml、15g:100ml、16g:100ml、17g:100ml、18g:100ml、19g:100ml或20g:100ml等。
[0015]
优选地，所述纯水的温度为0-15℃，例如纯水的温度为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃等。若纯水的温度太高会影响多肽活性，若纯水的温度低会结冰，影响操作。
[0016]
步骤1)中，所述减压抽滤的滤纸的孔径为10-25μm，例如减压抽滤的滤纸的孔径为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm等。
[0017]
步骤2)中，所述冷冻干燥的温度为-85～-95℃，例如冷冻干燥的温度为-85℃、-86℃、-87℃、-88℃、-89℃、-90℃、-91℃、-92℃、-93℃、-94℃或-95℃等。
[0018]
步骤3)中，所述蜂毒多肽粗提物的质量与所述甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为(1-25)g:100ml，例如所述蜜蜂毒液的质量与所述甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为1g:100ml、2g:100ml、3g:100ml、4g:100ml、5g:100ml、6g:100ml、7g:100ml、8g:100ml、9g:100ml、10g:100ml、11g:100ml、12g:100ml、13g:100ml、14g:100ml、15g:100ml、16g:100ml、17g:100ml、18g:100ml、19g:100ml或20g:100ml等。
[0019]
优选地，所述甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/l，即甲酸-甲酸铵缓冲液中甲酸-甲酸铵两者之和的浓度为0.01-0.05mol/l，例如甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l或0.05mol/l等；ph为5-8，例如ph为5、6、7或8等。
[0020]
步骤3)中，所述色谱凝胶柱的型号为g-20～75，例如可以为g-20、g-50、g-75等，选择此类型的色谱凝胶柱使多肽的回收率高，多肽不易失活。
[0021]
优选地，所述纯化的温度为0-15℃，例如纯化的温度为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃等。
[0022]
所述步骤3)之后还包括精提的步骤4)，具体过程为：
[0023]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物。
[0024]
步骤4)中，所述超滤浓缩系统采用超滤膜超滤浓缩，所述超滤膜的分子量为1-30kd，例如超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为1kd、2kd、3kd、4kd、5kd、6kd、7kd、8kd、9kd、10kd、11kd、12kd、13kd、14kd、15kd、16kd、17kd、18kd、19kd、20kd、21kd、22kd、23kd、24kd、25kd、26kd、27kd、28kd、29kd或30kd等。
[0025]
优选地，所述超滤浓缩过程控制超滤蠕动泵的流速为100-250ml/min，例如超滤蠕动泵的流速为100ml/min、110ml/min、120ml/min、130ml/min、140ml/min、150ml/min、160ml/min、170ml/min、180ml/min、190ml/min、200ml/min、210ml/min、220ml/min、230ml/
min、240ml/min或250ml/min等。
[0026]
优选地，所述超滤浓缩系统的压力为0-30psi，例如超滤浓缩系统的压力为0、1psi、2psi、3psi、4psi、5psi、6psi、7psi、8psi、9psi、10psi、11psi、12psi、13psi、14psi、15psi、16psi、17psi、18psi、19psi、20psi、21psi、22psi、23psi、24psi、25psi、26psi、27psi、28psi、29psi或30psi等。所述超滤浓缩系统的温度为-2～-5℃，例如为-2℃、-3℃、-4℃或-5℃等。
[0027]
作为本发明的优选方案，所述蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0028]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加0-15℃纯水混合均匀，所述蜜蜂毒液的质量与所述纯水的体积比为(1-25)g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，所述减压抽滤的滤纸的孔径为10-25μm；
[0029]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0030]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-20～75的色谱凝胶柱进行0-15℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，所述蜂毒多肽粗提物的质量与所述甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为(1-25)g:100ml，所述甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/l，ph为5-8；
[0031]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，所述超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为1-30kd，所述超滤浓缩系统的压力为0-30psi，温度为-2～-5℃。
[0032]
本发明的目的之二在于提供一种如目的之一所述的制备方法得到的蜂毒多肽提取物。
[0033]
本发明的目的之三在于提供一种抗衰老修复化妆品，采用如目的之二所述的蜂毒多肽提取物制备而成。将本发明制得的蜂毒多肽提取物应用于抗衰老修复化妆品中，能够防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现，保持皮肤光鲜有弹性。
[0034]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0035]
本发明的制备方法，采用减压抽滤、冷冻干燥得到蜂毒多肽粗提物，再利用色谱凝胶柱进行低温纯化除杂制备蜂毒多肽提取物，制得的蜂毒多肽提取物具有良好的抗氧化性和抗炎活性，以30mg/ml的蜂毒多肽提取物为例，dpph清除率为90.12％，羟自由基清除率为73.42％，超氧阴离子自由基清除率为66.57％，对5-lox的抑制率达到74.69％。
[0036]
本发明的制备方法工艺简单、耗时短、成本低、易于工厂化大规模生产；进一步地，采用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，进一步提高了蜂毒多肽粗提物的纯度。
[0037]
本发明制得的蜂毒多肽提取物应用于抗衰老修复化妆品中，能够防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现，保持皮肤光鲜有弹性。
附图说明
[0038]
图1为本发明的蜂毒多肽提取物标准曲线。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图1，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
[0040]
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。
[0041]
实施例1
[0042]
本实施例的蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0043]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加4℃纯水混合均匀，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为5g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，减压抽滤的滤纸的孔径为15μm；
[0044]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液-90℃冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0045]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-50的色谱凝胶柱进行4℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为5g:100ml，甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.02mol/l，ph为6；
[0046]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为10kd，超滤浓缩系统的压力为20psi，温度为-4℃。
[0047]
实施例2
[0048]
本实施例的蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0049]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加10℃纯水混合均匀，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为20g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，减压抽滤的滤纸的孔径为10μm；
[0050]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0051]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-30的色谱凝胶柱进行10℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为20g:100ml，甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为8；
[0052]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为5kd，超滤浓缩系统的压力为10psi，温度为-4℃。
[0053]
实施例3
[0054]
本实施例的蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0055]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加15℃纯水混合均匀，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为15g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，减压抽滤的滤纸的孔径为10-25μm；
[0056]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0057]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-20的色谱凝胶柱进行15℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为15g:100ml，甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.01mol/l，ph为5；
[0058]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为15kd，超滤浓缩系统的压力为30psi，温度为-4℃。
[0059]
实施例4
[0060]
本实施例的蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0061]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加10℃纯水混合均匀，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为25g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，减压抽滤的滤纸的孔径为25μm；
[0062]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0063]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-75的色谱凝胶柱进行10℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为25g:100ml，甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为7；
[0064]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为15kd，超滤浓缩系统的压力为5psi，温度为-4℃。
[0065]
实施例5
[0066]
本实施例的蜂毒多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0067]
1)利用取毒器收集蜜蜂毒液，加12℃纯水混合均匀，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为5g:100ml，减压抽滤除去蜜蜂螫针，减压抽滤的滤纸的孔径为12μm；
[0068]
2)将步骤1)减压抽滤后的滤液冷冻干燥，得到蜂毒多肽粗提物；
[0069]
3)将步骤2)得到的蜂毒多肽粗提物用甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过型号为g-20的色谱凝胶柱进行12℃纯化除杂，得到蜂毒多肽提取物，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为5g:100ml，甲酸-甲酸铵缓冲液的浓度为0.03mol/l，ph为5；
[0070]
4)将步骤3)得到的蜂毒多肽提取物用超滤浓缩系统进行脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物，其中，超滤浓缩系统的超滤膜的分子量为8kd，超滤浓缩系统的压力为16psi，温度为-4℃。
[0071]
实施例6
[0072]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤1)中，纯水的温度为25℃，其他的与实施例1的均相同。
[0073]
实施例7
[0074]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤1)中，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为0.5g:100ml，其他的与实施例1的均相同。
[0075]
实施例8
[0076]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤1)中，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比为40g:100ml，其他的与实施例1的均相同。
[0077]
实施例9
[0078]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤3)中，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为0.1g:100ml，其他的与实施例1的均相同。
[0079]
实施例10
[0080]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤3)中，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为35g:100ml，其他的与实施例1的均相同。
[0081]
实施例11
[0082]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤3)中，色谱凝胶柱的型号为色谱凝胶g-20，其他的与实施例1的均相同。
[0083]
实施例12
[0084]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤3)中，纯化的温度为25℃，其他的与实施例1的均相同。
[0085]
实施例13
[0086]
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤4)中，超滤浓缩系统的压力为50psi，其他的与实施例1的均相同。
[0087]
实施例14
[0088]
本实施例与实施例1的区别之处在于，未经过步骤4)，其他的与实施例1的均相同。
[0089]
对比例1
[0090]
本对比例与实施例1的区别之处在于，步骤3)中，缓冲液替换为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，其他的与实施例1的均相同。
[0091]
将实施例1-14与对比例1制得的蜂毒多肽提取物的含量及抗氧化性和抗炎活性的性能进行测试。
[0092]
1、利用高效液相色谱测量实施例1制备的蜂毒多肽的含量
[0093]
(1)样品前处理
[0094]
取毒器收集蜜蜂毒液20g，加4℃纯水20g均匀，减压抽滤除去蜜蜂螫针，滤液冷冻干燥，得蜂毒多肽粗提物，称取10g，用200ml、0.02mol/l甲酸-甲酸铵缓冲液溶解后，过色谱凝胶柱进行纯化、除杂，得到蜂毒多肽提取物，再用超滤浓缩系统5kd膜胞进行脱盐、浓缩、浓缩液进行冷冻干燥，得到蜂毒多肽精提物样品，稀释后进行测定。
[0095]
(2)色谱条件
[0096]
色谱柱：agilent xdb c18柱(250mm
×
2.5mm)；
[0097]
流动相：乙腈-ph为6的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱：
[0098]
洗脱液用量配比及洗脱时间如表1所示。
[0099]
表1
[0100]
时间(分钟)乙腈ph为6的磷酸盐缓冲液01994199559510158512208012.119916199
[0101]
流速：1.0ml/min；
[0102]
进样量：20μl；
[0103]
柱温：25℃；
[0104]
测定波长：254nm。
[0105]
(3)标准曲线绘制
[0106]
用纯水配制1mg/ml的蜂毒多肽标品储备液，用纯水准确稀释至50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml的待测液，按照以上色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。以蜂毒多肽浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如附图1所示。
[0107]
(4)样品测试
[0108]
将实施例1制得的蜂毒多肽提取物的测试样品按照同样的色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。通过蜂毒多肽标准曲线可以算出，蜂毒多肽提取物样品中蜂毒多肽的含量为146.35μg/ml。
[0109]
将实施例1制得的蜂毒多肽提取物样品sds-page分析，分离样品和蜂毒肽标准品在同一位置有条带，说明组分为蜂毒多肽，样品分子量在2.5kda左右，纯度为电泳级。
[0110]
2、dpph
·
抗氧化实验
[0111]
dpph
·
又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代dpph
·
，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
[0112]
配制0.2mmol/l的dpph
·
甲醇(或无水乙醇)溶液；配制不同浓度的待测样品溶液；
[0113]
分别吸取2ml样品溶液和2mldpph
·
溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值a1；分别吸取2ml样品溶液和2ml甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值a2；分别吸取2mldpph
·
溶液和2ml甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值a0；每个样品做3个平行样，测试结果如表2所示，其中，dpph清除率的计算公式如式1所示。
[0114][0115]
表2
[0116][0117][0118]
3、羟自由基清抗氧化实验
[0119]
羟基自由基是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基。但在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕获oh
°
，并产生有色产物2，3-二羟基苯甲酸，
[0120]
该有色产物在510nm处有强吸收峰，若在体系中加入具有清除oh
°
功能的待测物，且待测物捕捉oh
°
的作用大于水杨酸时，便能及时清除oh
°
，从而使有色产物的生成量减少导致吸光度减小。本发明蜂毒多肽提取物的羟自由基清除率的测试结果如表3所示。
[0121]
表3
[0122][0123][0124]
4、超氧阴离子自由基清除实验
[0125]
采用邻苯三酚自氧化法进行超氧阴离子自由基(o2·-)清除实验。邻苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能迅速自氧化产生o2·-和中间产物，中间产物又与o2·-反应，得到一种带颜色的中间产物，此产物在紫外条件下有吸收。利用吸光值的大小可以间接判定自氧化速度的大小。
[0126]
取50mmol/l ph＝8.2的tris-hcl缓冲液4.5ml于试管中，置25℃水浴预热20min，加入1ml样品溶液，再加入0.4ml的10mmol/l邻苯三酚溶液，振荡混匀，25℃水浴准确反应4min，然后加入0.1ml的8mol/l的hcl终止反应，测定325nm波长下的吸光值，实验结果如表4
所示。其中，超氧阴离子自由基清除率的计算公式如式2所示。
[0127][0128]
表4
[0129][0130]
5、脂肪氧化酶活性抑制实验(抗炎)
[0131]
炎症是指机体对感染、外来物质或其他原因所致损伤的一种反应。脂肪氧化酶(简称lox)，也称脂氧合酶、脂氧酶等，是一种含非血红素铁的氧化还原酶，专一催化花生四希酸、亚油酸等具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应，生成白三烯
类(lts)和羟基二十四碳四烯酸(x-hete)等具有共轭不饱和脂肪酸清过氧化物。因此，可以通过检测某种物质对脂肪氧化酶的抑制率可在一定程度上反映其抗炎活性。
[0132]
样品组(a1)：取0.1ml样品提取液和0.4ml酶液，混匀于10ml试管中，30℃水浴3min，加入底物1.6ml，混匀于30℃水浴3min，然后加入4ml无水乙醇，终止反应，蒸馏水定容至10ml，混匀，在234nm下，测od值。
[0133]
空白对照(a2)：以0.1ml蒸馏水替代样品
[0134]
阳性对照：取0.1ml浓度为0.5mg/ml人参皂苷样品溶液，替代样品，实验结果如表5所示。
[0135]
其中，对5-lox的抑制率的计算公式如式3所示。
[0136]
抑制率＝(1-a1)/a2×
100％式3
[0137]
表5
[0138]
[0139][0140]
由表2、3、4、5可以看出，本发明的实施例1-5，制得的蜂毒多肽提取物具有良好的抗氧化性和抗炎活性，以30mg/ml的蜂毒多肽提取物为例，dpph清除率为90.12％，羟自由基清除率为73.42％，超氧阴离子自由基清除率为66.57％，对5-lox的抑制率达到74.69％。
[0141]
实施例6的步骤1)中，纯水温度太高，会使多肽失活，提取到的多肽减少，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0142]
实施例7的步骤1)中，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比太小，会使纯化得到的多肽变小，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0143]
实施例8的步骤1)中，蜜蜂毒液的质量与纯水的体积比太大，会使后续多肽提取不充分，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0144]
实施例9的步骤3)中，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比太小，会使提取得到的多肽量少，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0145]
实施例10的步骤3)中，蜂毒多肽粗提物的质量与甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比太大，会使提取多肽不充分，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0146]
实施例11的步骤3)中，色谱凝胶柱的型号替换为色谱凝胶g-20，会使多肽纯化变低，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0147]
实施例12的步骤3)中，纯化的温度太高，会使多肽失活，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0148]
实施例13的步骤4)中，超滤浓缩系统的太高，会使多肽损失大，dpph清除率、羟自
由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0149]
实施例14未经过步骤4)，会使多肽纯度不高，dpph清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和对5-lox的抑制率均减小。
[0150]
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。