一种合成On-DNA叠氮化合物的方法与流程

本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种由on-dna氨基化合物在铜试剂和叠氮试剂存在下，得到on-dna叠氮化合物的方法。

背景技术：

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的dna编码化合物库技术(wo2005058479、wo2018166532、cn103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个dna标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(accountsofchemicalresearch,2014,47,1247-1255)。

dna编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建dna编码化合物库的挑战之一就是需要在dna上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于dna需要在一定的条件下(溶剂、ph、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于dna编码化合物库构建的on-dna反应还需要有较高的产率。因此dna上进行的化学反应(简称on-dna反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到dna编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与dna兼容的化学反应也成为目前dna编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了dna编码化合物库的应用及商业价值。

on-dna叠氮化合物是一类重要的中间体，目前合成on-dna叠氮化合物的途径主要有两种：一是dna化合物与含有叠氮基的双官能团试剂通过缩合、还原胺化等化学反应制得on-dna叠氮化合物，但是这种双官能团试剂较少；二是从dna芳基卤代化合物出发，与叠氮试剂反应生成on-dna芳基叠氮化合物，但该反应底物范围仅限于芳基；两种反应很大程度上限制了能够得到的on-dna叠氮化合物的种类。

因此需要开发一种新的将on-dna氨基化合物原位转化为on-dna叠氮化合物的方法，并适用于构建dna编码化合物库的大批量多孔板操作。

技术实现要素：

本发明公开了一种合成on-dna叠氮化合物的方法，所述方法是以on-dna氨基化合物为原料，在铜试剂和叠氮试剂的存在下，在反应溶剂中经一步反应得到on-dna叠氮化合物；所述on-dna氨基化合物结构式为dna-r1-nh2，所述on-dna叠氮化合物的结构式为dna-r1-n3；

其中，结构式中dna包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连，所述dna的长度为10～200bp。

r1选自分子量1000以下与dna和氨基氮原子直接相连的基团或者不存在。

其中，结构式中的dna与r1通过一个化学键或多个化学键连接，一个化学键时，是指结构式中的dna与r1直接相连；多个化学键时，指结构式中的dna与r1之间间隔多个化学键相连，比如，dna与r1之间通过一个亚甲基(-ch2-)相连，即通过两个化学键连接；或dna与r1之间通过一个羰基(-co-)连接dna的氨基，也是通过两个化学键连接；或dna与r1通过一个亚甲基羰基(-ch2co-)连接dna的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。

所述的r1选自烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基、5～10元杂环基；其中：

所述烷基为c1～c20烷基或c3～c8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、氨基、胍基、(甲胺酰基)氨基、烷氧基、卤代苯基、苯基、氰基取代的苯基、烷基苯基、羟基取代的苯基、5～10元杂环基、5～10元芳杂环基、烯基、烷磺酰基中的一种或多种；

取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基、苯基中的一种或多种；

取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个；取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基中的一种或多种。

作为优选：on-dna氨基化合物具体选自：dna-nh2、

一种合成on-dna叠氮化合物的方法，所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.1-5mm的on-dna氨基化合物溶液中，加入1-100倍摩尔当量的铜试剂和1-100倍摩尔当量的叠氮试剂，在20℃～100℃下反应0.5-24小时。

进一步地，所述铜试剂为铜粉、氧化铜、氧化亚铜、硫化铜、硫化亚铜、硫酸铜、醋酸铜、氯化铜、溴化铜、氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜中的一种或几种的混合物；优选地，所述铜试剂为是硫酸铜。

进一步地，所述叠氮试剂是咪唑磺酰叠氮或其盐、三氟甲磺酰基叠氮或其盐。

进一步地，所述on-dna氨基化合物的摩尔当量为1，叠氮试剂的摩尔当量为1～100、铜试剂的摩尔当量为1～100；优选地，所述叠氮试剂摩尔当量为5当量、10当量、20当量、24当量、30当量、40当量或50当量；优选地，所述铜试剂摩尔当量为1当量、2当量、3当量、4当量、5当量、6当量、10当量、20当量或40当量。

进一步地，所述反应溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有碳酸氢钠缓冲液或硼酸纳缓冲液。

进一步地，所述反应的反应温度为20℃～100℃；优选地，反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、80℃或100℃。

进一步地，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，反应时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时或20小时。

进一步地，所述反应的加料顺序为先加入on-dna氨基化合物，再依次加入铜试剂、叠氮试剂。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的dna编码化合物库的合成。

本发明方法可以实现一步反应将on-dna氨基化合物原位转化为on-dna叠氮化合物。该方法加入的试剂种类少，收率高，产物单一，后处理简单，能够大规模的引入叠氮作为合成模块，并且适用于on-dna脂肪氨基化合物和芳香氨基化合物，且适合大规模多孔板操作。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(ca～cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，c1～c20烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。

烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-ch3、乙基-ch2ch3、亚甲基-ch2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为c1～c6烷氧基，c1～c6烷基氨基。

环烷基：是指具有多个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。

所述卤素为氟、氯、溴或碘。

烷氧基是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-och3。

卤代苯基是指苯基上的h被卤素取代而形成的基团。

烷基苯基是指苯基上的h被烷基取代而形成的基团。

芳基是指不含杂原子，由c原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。

芳杂环基是指c、o、s、n等原子构成具有芳香性的单一环状或多个环状基团。

杂环基是带有至少一个选自o、s、n的饱和或不饱和的非芳香性的单环或多环烃基。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明：

图1为实施例1中化合物1的lc-ms谱图和ms谱图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明中dna-nh2是单链或双链dna与接头基团形成的带有-nh2接头的dna结构，例如wo2005058479中“compound1”的dna-nh2结构。也例如下述的dna结构：

其中，a为腺嘌呤，t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，g为鸟嘌呤。

实施例1、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解至碳酸氢钠缓冲液的甲醇缓冲液中(碳酸氢钠，50mm)，配置成0.25mm浓度溶液(40μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm甲醇：去离子水体积比1:1溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例2、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例3、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于20℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物3，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量：5210.0，观察到分子量：52109.6。

实施例4、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于40℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例5、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于80℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例6、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于100℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例7、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例8、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应2小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例9、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应4小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例10、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应20小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例11、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入碘化亚铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为90％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例12、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(50nmol，5当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例13、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(100nmol，10当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例14、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(400nmol，40当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例15、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5210.0，实际分子量为5209.6。

实施例16、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为75％。理论分子量为5399.0，实际分子量为5397.1。

实施例17、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为84％。理论分子量为5375.0，实际分子量为5374.0。

实施例18、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为71％。理论分子量为5416.0，实际分子量为5415.0。

实施例19、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为67％。理论分子量为5452.0，实际分子量为5450.0。

实施例20、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为74％。理论分子量为5437.0，实际分子量为5435.5。

实施例21、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为99％。理论分子量为5335.0，实际分子量为5334.5。

实施例22、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为81％。理论分子量为5402.0，实际分子量为5401.3。

实施例23、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为73％。理论分子量为5397.0，实际分子量为5397.0。

实施例24、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为68％。理论分子量为5412.0，实际分子量为5411.2。

实施例25、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为51％。理论分子量为5460.0，实际分子量为5458.6。

实施例26、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为33％。理论分子量为5421.0，实际分子量为5420.1。

实施例27、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为94％。理论分子量为5421.0，实际分子量为5421.4。

实施例28、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为84％。理论分子量为5362.0，实际分子量为5361.4。

实施例29、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为94％。理论分子量为5428.0，实际分子量为5427.1。

实施例30、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)。向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为75％。理论分子量为5428.0，实际分子量为5427.1。

实施例31、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为69％。理论分子量为5492.0，实际分子量为5491.7。

实施例32、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为80％。理论分子量为5488.0，实际分子量为5488.1。

实施例33、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为76％。理论分子量为5428.0，实际分子量为5426。

实施例34、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为86％。理论分子量为5453.0，实际分子量为5452.1。

实施例35、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为75％。理论分子量为5503.0，实际分子量为5502.0。

实施例36、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为80％。理论分子量为5503.0，实际分子量为5502.0。

实施例37、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)。向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为84％。理论分子量为5453.0，实际分子量为5452.1。

实施例38、on-dna叠氮化合物的合成

将dna胺基化合物溶解到硼酸纳缓冲液中(硼酸钠250mm，ph＝9.4)，配制成1mm浓度溶液(10μl，10nmol)，向溶液中依次加入硫酸铜(40nmol,4当量，100mm去离子水溶液)，咪唑磺酰叠氮盐酸盐(240nmol，24当量，120mm去离子水溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60℃反应0.5小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到dna-n3溶液，lcms确认反应转化率为78％。理论分子量为5466.0，实际分子量为5465.5。

综上所述，本发明方法通过控制反应的试剂溶剂、温度、时间等条件，由on-dna氨基化合物在铜试剂和叠氮试剂的存在下，高收率得到on-dna叠氮化合物。本方法加入的试剂种类少，产物单一，后处理简单，适合使用多孔板操作。