一种人源化降糖多肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源化降糖多肽及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.随着全球肥胖、身体久坐与高热量饮食潮流的盛行，糖尿病已成为继心血管疾病/肿瘤之后威胁人类健康的全球性卫生问题，其患病率显著升高，截止到2018年，全世界大约有4.15亿的糖尿病患者，预测2040年会超过6.25亿，对患者及家属早成了深刻的身心痛苦，并对卫生保健系统造成巨大负担。90％以上的糖尿病患者为ii型糖尿病(t2d)，其主要是由于肥胖引发的靶器官胰岛素抵抗或胰腺β细胞功能障碍导致的相对胰岛素缺陷，最终导致血糖过高引起的。目前临床上治疗糖尿病的药物主要有以下几类：胰岛素，降糖效果明显，然而会造成低血糖以及体重增加；二甲双胍类，主要用于减少糖异生和肝脏葡萄糖生成，然而长期使用会造成胃肠道和乳酸中毒；磺酰脲类药物(和胰岛素促分泌剂)，可以增加胰岛细胞分泌胰岛素，长期使用会造成低血糖，增加心血管疾病风险；钠-葡萄糖协同转运蛋白(sglt2)抑制剂，阻断肾近端小管对葡萄糖的重吸收，长期使用会造成酮酸中毒、生殖器霉菌病以及骨折；肠促胰岛素类似物，促进胰岛素分泌，延迟胃排空，抑制食欲，长期使用会造成恶心、呕吐以及胰腺炎；过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)拮抗剂(噻唑烷二酮类)，增强脂肪组织对脂质的贮积能力，减少肝脏和肌肉组织对脂质的异常贮积，改善肝脏和肌肉对胰岛素的敏感性，长期使用会造成体重增加、膀胱癌以及骨折，增加心血管疾病风险；α-葡糖苷酶抑制剂，干扰肠道葡萄糖吸收，减少葡萄糖生成，增加葡萄糖的利用率，长期使用会造成腹泻、腹痛、恶心、呕吐。总之，这些药物由于功效低、耐受性差、副作用明显的特点，并不能全面地改善ii型糖尿病的内分泌代谢异常问题，因此，这就需要对ii型糖尿病的发病机理有深入的研究，开发出针对病症根源的安全有效的药物。
4.分泌蛋白、激素和细胞因子是由胰岛β细胞和胰岛素响应组织如肌肉、肝脏、脂肪组织分泌出来的一类因子，在机体的食物摄取、胰岛素敏感性以及能量代谢上发挥着重要的作用，血清中这些分泌因子的水平变化对维持机体葡萄糖代谢和能量稳态至关重要。胰岛素是由胰岛β细胞分泌出来的激素，能促进骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取以及减少肝脏中葡萄糖的产生，胰岛素分泌减少造成高血糖症。瘦素是由脂肪组织分泌出来的，它能通过抑制糖原合成，抑制糖原反应和抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴起到抗糖尿病的作用。肠促胰岛素葡萄糖依赖的胰岛素释放多肽(gip)和糖原类似多肽-1(glp-1)在摄取食物和吸收葡萄糖时被释放出来，极大的促进了胰岛素的分泌。除此以外，glp-1在抑制糖原分泌和促进胰岛素合成上也有重要的作用。血清里高浓度的视黄醇结合蛋白-4(rbp4)通过减少骨骼肌里glut4的水平引起胰岛素的拮抗。激素irisen能作用于白色脂肪组织细胞来促进ucp1的表达和棕色脂肪化的转变，在肥胖病人血清中增多。脂肪因子apelin作为g蛋白偶联
受体，在维持心血管功能、体液稳态、血管生成、食物摄入以及细胞增殖上发挥重要作用，在ii型糖尿病病人中分泌增加。fgf21作为内分泌激素调节肝酮生成、糖异生和脂肪分解，能有效抵抗饮食造成的肥胖和增强葡萄糖耐受，血清中fgf21水平与肥胖和胰岛素抵抗成正相关，注射fgf21可以有效改善糖尿病小鼠的代谢紊乱。因此，研究分泌蛋白与血糖血脂的关系对糖尿病治疗有极其重要的作用。分泌蛋白是自身组织器官分泌的，几乎不存在毒副作用，对机体极为安全，因此研究分泌蛋白将为糖尿病多肽治疗治疗提供理论依据。
5.syndecan结合蛋白(sdcbp)，也叫做syntenin或者黑色素瘤分化相关基因9(mda-9)，最开始被认为是一个连接syndecan介导的信号通路和细胞骨架的连接蛋白。它通过pdz功能域与多个蛋白相互作用，调节跨膜受体的穿梭、肿瘤细胞恶化以及神经元-突触传递的功能。有研究发现，sdcbp通过结合转录起始因子5a(eif5a)，抑制p53蛋白水平，从而抑制细胞凋亡。sdcbp参与肿瘤恶化，与细胞迁移、侵袭、伪足形成有关。sdcbp通过参与fak激酶、p38有丝分裂原激活蛋白激酶、c-jun nh2末端激酶和核因子kb信号通路，参与细胞骨架系统的调控。据文献报道，pkcα激活引起sdcbp表达，进一步促进fn介导的integrin-β1信号通路复合体的组装，导致fak激活以及下游信号通路的激活。sdcbp也可以直接结合c-src，有利于形成激活fak/c-src信号复合体，对迁移复合体的调控非常重要。sdcbp虽然在细胞骨架的调控上有重要作用，但具体机制并不清楚，是否参与细胞骨架介导的葡萄糖摄取仍是空白。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人源化降糖多肽及其应用。
7.为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
8.第一方面，一种人源化降糖多肽sdcbp2-108-267aa，所述人源化降糖多肽的氨基酸序列为seq id no.1所示的氨基酸序列组成的多肽。
9.该降糖多肽具有促进细胞对葡萄糖的吸收作用。
10.第二方面，提供编码所述降糖多肽的核苷酸，其包含下组中的任一种：
11.(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；
12.(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。
13.第三方面，提供上述降糖多肽在制备治疗和/或预防糖尿病药物中的应用。
14.进一步，所述降糖多肽为上述氨基酸序列的基本骨架或甲基化、酰基化衍生物。
15.第四方面，一种治疗和/或预防糖尿病药物，所述药物其活性成分包含上述人源化降糖多肽。
16.根据本发明，上述药物还包括至少一种药物非活性成分。
17.所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
18.所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
19.本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、
葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
20.本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
21.本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
22.第五方面，一种体外促进细胞对葡萄糖吸收的方法，所述方法包括给予体外纯化的sdcbp2-108-267aa蛋白。
23.进一步，降糖多肽的氨基酸序列为seq id no.1。
24.进一步，sdcbp2-108-267aa蛋白的浓度为0.02-0.2mg/ml；优选为0.05mg/ml。
25.进一步，所述细胞包括hela细胞。
26.本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：
27.本发明揭示了sdcbp2氨基酸片段是降糖的有效多肽，本发明研究表明sdcbp2是分泌蛋白，分泌出来的sdcbp2依赖于108-267氨基酸序列能结合到细胞膜上，促进葡萄糖吸收。主要包括三个方面的内容：细胞内的sdcbp2是分泌蛋白，sdcbp2促进glut4上膜，sdcbp2-108-267氨基酸促进glut4上膜，sdcbp2-108-267氨基酸促进细胞内葡萄糖吸收。
附图说明
28.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
29.图1为实施例2的pcr反应条件图；
30.图2为实施例1的瞬时过表达sdcbp2的293t细胞在葡萄糖或血清饥饿下的分泌情况。
31.图3为实施例2的体外纯化的sdcbp2-108-267aa蛋白促进glut4的上膜。图a为sdcbp2以及缺失突变体的蛋白质纯化情况；图b为sdcbp2全长蛋白促进glut4的上膜；图c为sdcbp2-108-267aa促进glut4的上膜情况。
32.图4为实施例3的体外纯化的sdcbp2-108-267蛋白促进细胞内葡萄糖吸收。
具体实施方式
33.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
35.实施例1
36.sdcbp2蛋白是分泌蛋白。
37.1、实验材料
38.1.1细胞及培养耗材
39.人肾胚细胞293t，人宫颈癌细胞hela、细胞培养皿、培养板，细胞培养基：dmem+10％胎牛血清
40.1.2试剂
41.flag-m2-beads(sigma)、protein a/g beads(abmart)
42.配制的试剂
[0043][0044]
调节ph值至7.4，定容至1l，高压蒸汽灭菌40min后备用。
[0045]
ip lysis buffer
[0046][0047][0048]
ripa buffer
[0049]
ripa 100ml
[0050][0051]
加水定容到100ml，抽滤，分装，用前加蛋白酶抑制剂。
[0052]
磷酸钙转染基本试剂配制：
[0053]2×
hebes
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1l
[0054]
nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
16.4g
[0055]
hepes
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11.9g
[0056]
na2hpo40.21g
[0057]
调节ph值至7.05，微调至最合适的ph值，定容至1l，0.22μm的滤膜过滤。
[0058]
2.5m cacl2100ml
[0059]
cacl23.874g
[0060]
h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50ml
[0061]
用0.22μm的滤膜过滤，分装保存。
[0062]
2、实验方法
[0063]
2.1 western blot的具体实验步骤如下所述：
[0064]
(1)配制变性聚丙烯酰胺凝胶：将胶板清洗干净，按正确的顺序安置在制胶架上；检漏；配制分离胶，ddh2o密封；待分离胶凝固，配制浓缩胶，然后插上梳子，待浓缩胶完全凝固后就可以使用了。
[0065]
(2)电泳：将配好的胶与电泳槽安置好；将running buffer加入电泳槽中；上样；将电泳仪的电压调到80v开始电泳，当loading完全进入分离胶时，将电压调高到120v，直至loading到达分离胶的底部，结束电泳。
[0066]
(3)转膜：将pvdf膜在甲醇中浸泡30s后也放入transfer buffer中备用；将transfer buffer加入到转膜槽中，并提前用冰水混合物冷却；按正确的顺序将海绵、滤纸、胶和pvdf膜放置好，然后都放在转膜槽的卡槽中；启动电泳仪，使用80v电压进行转膜，一般所需的时间是90min。
[0067]
(4)封阻：将转好膜的pvdf膜放入pbst配制的5％的脱脂牛奶，室温摇床孵育1-1.5小时。
[0068]
(5)加一抗：用5％脱脂牛奶将特异性的一抗稀释到适当的浓度，室温摇床上孵育2小时或4℃摇床过夜。然后用pbst室温洗涤3-4遍，每次10min。
[0069]
(6)加二抗：用5％脱脂牛奶将对应的二抗(偶联有hrp)稀释到所需要的浓度，室温下孵育2-2.5小时，然后用pbst室温洗涤4-5遍，每次10分钟。
[0070]
(7)显影及定影：在暗房中，吸掉pvdf膜上面的液体，将混合好的发光试剂a、b液滴在膜上；将pvdf膜放在避光盒子中，覆盖上x光片；将x光片依次显影和定影；冲洗干净x光
片，于烘箱中烘干，即可分析结果。
[0071]
2.2磷酸钙颗粒转染
[0072]
(1)配制a液(16ulcaci+目的质粒+无菌水共300ul)，配制b液(300ul 2
×
hepes)，将两种试剂各自混匀之后，用电动移液枪向b液均匀吹泡，同时用移液枪吸取a液往b液里滴加，速度要均匀。
[0073]
(2)吹完后，轻轻混匀a、b液，将600ul混合物轻轻的均匀的滴加进入待转染的6cm皿中，轻摇混匀。
[0074]
(3)将转染后的细胞放进培养箱中继续培养，约1小时左右即可在显微镜下观察形成的钙颗粒的大小。
[0075]
(4)大约4-6小时，将转染的细胞换成新鲜的培养基，具体时间可根据钙颗粒大小的情况决定。
[0076]
(5)12小时后，可以在荧光显微镜下观察gfp荧光蛋白的表达情况，16小时左右根据荧光的表达可以判断转染效率的高低，24小时左右目的蛋白表达。
[0077]
(6)根据实验需求，在目的蛋白表达以后可收细胞做后续实验。
[0078]
3、结果与分析
[0079]
如图2所示，将flag-sdcbp2转染到293t细胞中，24小时以后对细胞进行不同浓度的血糖处理以及血清饥饿处理，12小时以后，分别收集培养基和细胞，细胞用ripa裂解，得到细胞裂解液(lysate)；培养基用flag-m2-beads富集细胞外的flag标签的蛋白，western blot实验检测培养基中富集的情况，发现sdcbp2明显的被富集下来，证明sdcbp2是分泌蛋白。
[0080]
实施例2
[0081]
sdcbp2-108-267aa蛋白促进glut4的上膜。
[0082]
1、实验材料
[0083]
1.1细胞
[0084]
人宫颈癌细胞hela
[0085]
培养基：dmem+10％胎牛血清
[0086]
1.2质粒
[0087]
his-gfp-sdcbp2-108-267aa缺失突变体是以his-gfp-sdcbp2为模板，构建的缺失突变体
[0088]
1.3试剂
[0089]
4％多聚甲醛
[0090]
2、实验方法
[0091]
2.1sdcbp2缺失体的构建,具体操作如下：
[0092]
(1)引物设计
[0093]
通过浏览ncbi网站，下载sdcbp2基因的序列，使用相关软件查找出基因序列中所包含的酶切位点，研究所用载体的图谱，选择合适的限制性内切酶，将sdcbp2分成如图3所示的五段，通过primer-5等软件辅助设计所需的上、下游引物。
[0094]
(2)pcr扩增目的基因
[0095]
pcr体系如下：
[0096][0097]
将配好的pcr反应液，混匀，瞬离，放入pcr仪中反应。反应条件如图1所示。
[0098]
(3)扩增的目的片段的割胶回收、酶切
[0099]
pcr结束后，取适量产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察胶上是否有预计分子量的主要产物带，并将目的条带进行割胶回收。
[0100]
a.根据回收dna片段的大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶(加适量的eb)。
[0101]
b.向pcr产物，加入6
×
dna loading稀释到1
×
，开始点样。
[0102]
c.加样后立即通电进行电泳，电压为120v，20分钟以后停止电泳。
[0103]
d.取出凝胶，在紫外灯下观察条带所在位置，然后用凝胶成像系统拍照保存，切下目的条带，用天根琼脂胶回收试剂盒回收目的基因。
[0104]
e.选用pcdna3.0 flag载体，将载体和pcr产物用同样的酶分别同时进行酶切，以产生相同的酶切位点。酶切条件为37℃下3-4小时。用琼脂糖凝胶电泳分离载体和pcr产物的酶切产物，然后用胶回收试剂盒(试剂盒购自天根生化科技有限公司)回收需要的产物。具体步骤见试剂盒说明书。
[0105]
(4)连接
[0106]
实验原理：在一定的条件下，t4 dna连接酶可以催化两个双链dna片段相邻的5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键，从而将两个片段连接起来。向体系中加入1μl载体，1μl t4连接酶，1μl buffer，7μl目的基因片段，混合均匀后，放到16℃水浴锅中8-12小时。
[0107]
(5)转化
[0108]
利用热激法原理进行转化，将50微升刚融化的感受态加入到连接产物中，冰上放置30分钟，然后放入42℃水浴锅中热激60秒，然后放到冰上5分钟，再加入700微升的无抗性的lb，37度摇床复苏45分钟，低速离心后，涂板到相应抗性的平板上，倒置放到37度培养箱培养12小时。
[0109]
(6)小摇并提取质粒
[0110]
在超净工作台中，挑取转化所得的克隆，接种到相应抗性的lb培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养12-16小时，然后保菌，将剩余的菌液使用天根质粒小提试剂盒提取质
粒，详细步骤可查阅说明书。
[0111]
(7)酶切鉴定、测序分析及验证表达
[0112]
取1ug质粒，选择对应的酶和buffer进行酶切鉴定。37℃酶切处理3h，然后用琼脂糖凝胶电泳检测。将酶切验证正确的质粒挑取一个克隆送去测序公司测序，将反馈的结果进行分析，检测是否构建成功。将构建成功的质粒瞬转到293t细胞中，通过免疫印迹实验验证表达。
[0113]
2.2 his蛋白纯化
[0114]
(1)构建蛋白纯化所需要的质粒，测序正确以后将其转化到transetta菌株中，挑取单克隆，做小诱，设置不同的诱导温度和不同的od，探索蛋白诱导的最佳条件。
[0115]
(2)按照对蛋白就行小量诱导时摸索的诱导条件，扩大培养进行大诱。将活化的菌液加入到lb中，在37℃中220rpm摇至小诱时摸索的od值，加入iptg，然后将摇床温度调至摸索的温度，合适时间后收取菌液。
[0116]
(3)将菌液离心后，加入lysis buffer、溶菌酶、pmsf、dtt等，冰上静止一段时间后，用超声仪进行超声。
[0117]
(4)将超声完成的裂解液高速离心，收集上清于新的100ml离心管中，加入偶联镍的beads，放到4度冰箱中，用静音混匀器摇2-4小时。
[0118]
(5)将溶液过柱，然后用wash buffer冲洗3遍。
[0119]
(6)用elution buffer将蛋白质洗脱下来，用pbs在4度冰箱进行透析，测浓度，检测所纯化蛋白的质量。
[0120]
2.3免疫荧光染色：
[0121]
(1)处理板：将盖玻片放入24孔板中，每孔用200ul多聚赖氨酸处理，紫外照射风干约45min；
[0122]
(2)接入细胞：接入适量的待检测细胞，待细胞长到50％时，进行转染，根据实验需求，转染24-48小时后用于实验；
[0123]
(3)细胞固定：洗掉培养基，常温pbs漂洗细胞一遍，用4％多聚甲醛固定细胞，在摇床上缓慢摇动10分钟；
[0124]
(4)细胞打孔：吸去固定液，然后用的pbs清洗两遍，用含0.3％的tritonx-100的pbs孵育10分钟。
[0125]
(5)细胞封阻：吸去tritonx-100的pbs，用pbs洗3次，每次5分钟，之后，用2％bsa室温封阻30分钟；
[0126]
(6)加一抗：用2％bsa按比例稀释一抗，室温孵育2个小时或4℃孵育过夜；
[0127]
(7)加二抗：洗去一抗，pbs洗3次，每次5分钟，用2％bsa按比例稀释荧光二抗，室温孵育2个小时，此步以后要避光；
[0128]
(8)染核：洗掉二抗，pbs清洗3遍，然后dapi作用2分钟；
[0129]
(9)封片：吸去dapi,封片，荧光显微镜下观察并拍片。
[0130]
3、结果与分析
[0131]
如图3所示，其中图a.构建原核表达的质粒his-gfp-sdcbp2及缺失突变体(1-107aa，1-187aa，1-267aa，108-267aa,188-292aa)，并纯化得到蛋白。图b.将flag-glut4转染到hela细胞中，24小时以后，将his-sdcbp2蛋白与hela细胞孵育12小时，收集细胞，用4％
多聚甲醛固定细胞，用flag抗体将flag-glut4染成红色，用dapi将细胞核染成蓝色。图c.将flag-glut4转染到hela细胞中，24小时以后，将his-sdcbp2蛋白与hela细胞孵育12小时，收集细胞，用4％多聚甲醛固定细胞，用flag抗体将flag-glut4染成红色，用his抗体将sdcbp2染成绿色并用来表示sdcbp2蛋白在细胞中的定位。以上结果表明，sdcbp2蛋白促进glut4上膜，并且108-267氨基酸序列是促进glut4上膜的必要片段。
[0132]
实施例3
[0133]
体外纯化的sdcbp2-108-267aa蛋白可促进细胞对葡萄糖的吸收。
[0134]
1、实验材料
[0135]
1.1细胞与培养基
[0136]
人肝癌细胞hepg2，培养基：dmem+10％fbs
[0137]
1.2试剂
[0138]
葡萄糖酶标检测试剂盒(采购自南京建成生物公司)
[0139]
2、实验方法
[0140]
根据试剂盒说明书检测。
[0141]
3、实验结果
[0142]
使用六孔板培养hepg2细胞，分别使用四个孔，第一个孔中只加培养基，不培养细胞，从第二个孔开始培养细胞，且每个孔中细胞的数目相同，第二个孔中只加培养基不加蛋白，第三个孔中加培养基以及纯化的his-sdcbp2-1-107aa蛋白，第四个孔中加入培养基以及纯化的his-sdcbp2-108-267aa蛋白，各个处理组的培养基中所含蛋白浓度为0.05mg/ml，培养24h后开始测量细胞培养基中葡萄糖的含量。实验结果如图4所示，图4中每个横坐标点对应的右侧的柱形图是sdcbp2-108-267aa，左侧的柱形图代表的是sdcbp2-1-107aa，可以得到sdcbp2-108-267aa蛋白促进细胞对葡萄糖的吸收。
[0143]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。