皮氏罗尔斯通氏菌EZ-50、其代谢产物及其应用的制作方法

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）EZ-50、其代谢产物及其应用。

背景技术：

水稻是世界上重要的主粮作物，每天有超过35亿人需要稻米来提供能量。由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病是全世界最重要的水稻疾病之一，造成毁灭性的作物损失，严重威胁全球粮食安全。目前，农业生产中主要通过杀真菌剂来控制水稻纹枯病的发生和发展。例如，在过去的30年中，井岗霉素在中国广泛用于控制纹枯病。然而，连续大量使用的单一杀真菌剂则会大大增加病原体产生抗药性的风险。而培育抗性品种是应对这种病原体侵袭的最佳选择，但迄今为止，尚无此类品种。据报道有多种替代的水稻纹枯病控制措施，例如施肥，土壤改良和农业管理等；然而不幸的是，这些措施不仅费时费力，而且尚无法达到最佳防控效果。因此，必须寻找新的抵抗水稻纹枯病的活性剂。

在诸多生物控制策略中，挥发性有机化合物（mVOC）是一类小的有机分子（<C20），具有低水溶性和高蒸气压（在20℃时为0.01 kPa），可以很容易地通过固体，液体和气体的异质混合物蒸发和扩散；也有越来越多的证据表明，mVOC可以调节植物面临的各种生物和非生物胁迫，并且极有可能成为有害农药和杀真菌剂的替代品。例如，内生细菌斯氏假单胞菌E25和嗜麦芽窄食单胞菌CR71可以通过释放以二硫化二甲基（DMDS）为主要物质的VOC来抑制灰葡萄孢的生长（Rojas-Solís等，2018）；枯草芽孢杆菌GB03产生的VOC可以直接抑制拟南芥灰霉菌的菌丝生长，并干扰病原真菌在疏水性叶子上的附着（Sharifi et al.，2016）。

然而由于自然界微生物的复杂多变性，以及其分泌mVOC的种类繁多且数量庞大，尚不清楚自然界是否存在着有更有效的微生物菌株及其代谢mVOC能够抑制立枯丝核菌的生长。

因此，当前亟需筛选发现新的能特异性的抑制立枯丝核菌的微生物菌株及其制剂，能够用于水稻纹枯病病害防治，从而能够减少化学农药的使用，以促进水稻产业的可持续发展。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种能够特异性的抑制立枯丝核菌生长的皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）EZ-50，并根据其分泌产物的特性，提出了应用途径，以期实现水稻纹枯病的生物防治，或提取到效果良好的抑菌活性物质。

研究发现，在水稻生长过程中，根系可以释放各种信号分子以组装一个独特的根系微生物群落。这些微生物在水稻的生长发育中起着重要的作用。通过释放各种代谢物，例如植物激素和mVOC，它们不仅可以促进植物生长，还可以帮助植物抵抗各种疾病。迄今为止，仅有少量关于水稻相关细菌抑制立枯丝核菌生长的研究，尚无关于水稻根际细菌是否可以通过释放VOC抑制立枯丝核菌生长的报道。

基于此，本发明人对健康水稻根际土壤进行了系列的根际微生物分离筛选研究，并从中筛选得到一株能够强烈抑制立枯丝核菌生长的皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii），该菌株保藏于于2020年9月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC NO. 20622。

利用上述皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO. 20622、其代谢产物或其液体发酵物能够制备得到水稻纹枯病生防制剂；研究发现该菌株能够分泌多种的抑菌活性物质苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）、二甲基二硫（Dimethyl disulfide）。

利用如下方法制备得到水稻纹枯病生防制剂：

将皮氏罗尔斯通氏菌在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到液体培养基中，30～32℃、150～180r/min、避光培养70～72h，再按常规步骤制得生防制剂。

将皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO. 20622在防治水稻纹枯病中的应用。

利用皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO. 20622能够制备得到抑菌活性物质苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）、二甲基二硫（Dimethyl disulfide）。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1. 本发明皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO. 20622能够强烈的抑制立枯丝核菌，可以用来防治和治疗由立枯丝核菌引起的植物病害，从而达到减少农药施用的目的，确保农业健康可持续性发展，具有广阔的应用前景。

2. 本发明皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO. 20622能够代谢分泌大量的挥发性物质苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）、二甲基二硫（Dimethyl disulfide）；本发明首次研究发现苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）具有优异的抑制立枯丝核菌的作用效果。

附图说明

图1 A为皮氏罗尔斯通氏菌抑制立枯丝核菌的效果对比照片，其中，实验组为皮氏罗尔斯通氏菌对扣熏蒸立枯丝核菌，对照组为不接种培养基对扣熏蒸立枯丝核菌；图1B为皮氏罗尔斯通氏菌抑制镰刀菌的效果对比照片，其中，实验组为皮氏罗尔斯通氏菌对扣熏蒸镰刀菌，对照组为不接种培养基对扣熏蒸镰刀菌；C为皮氏罗尔斯通氏菌抑制小孢根霉的效果对比照片，其中，实验组为皮氏罗尔斯通氏菌对扣小孢根霉，对照组为不接种培养基对扣小孢根霉。

图2为皮氏罗尔斯通氏菌产挥发性有机化合物的色谱图。

图3为纯品苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）、二甲基二硫（Dimethyl disulfide）（50 uL纯品+150 uL灭菌水/培养皿）熏蒸后立枯丝核菌菌落直径，CK为200 uL灭菌水熏蒸后立枯丝核菌菌落直径。

图4 为苯甲酸乙酯和2-乙基-1-己醇抑制立枯丝核菌侵染离体水稻叶片的效果评估照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：生防菌株的筛选和鉴定

（1）筛选

2018年12月在中国农业科学院温室由王恩召于盆栽实验中采集健康水稻根际土壤样品（从水稻去掉根部表面约5 cm的覆土，按S形，随机采集水稻根系结合的松散土体）。

试验组的具体操作方法为：

利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的土壤样品的悬液涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，挑取单菌落到液体牛肉膏蛋白胨培养基中获得菌液，取各菌液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24 h，将接菌的平板对扣在中心接种10 uL立枯丝核菌菌液（立枯丝核菌购买于中国农业微生物菌种保藏管中心，菌种编号：36246）的PDA平板上培养，32℃、黑暗条件下培养，并统计抑菌率，筛选具有抑菌效果的菌株。

所涉及培养基的配比为：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂18 g、去离子水1 L，pH 7.2～7.4；

液体牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、去离子水1 L，pH 7.2～7.4；

PDA培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、自来水1 L，pH自然。

抑菌率=(空白培养基对扣的小孢根霉菌落尺寸-该菌对扣的小孢根霉菌落尺寸)/空白培养基对扣的小孢根霉菌落尺寸×100%；

从众多备选菌株中筛选得到一株皮氏罗尔斯通氏菌，命名为EZ-50；进一步的研究发现，其对立枯丝核菌有强烈的特异性抑制效果，其抑菌率达到100%，如图1A所示；而其对镰刀菌的抑菌率为15%（见图1B），对小孢根霉的抑菌率为28.75%（见图1C）。

（2）鉴定

a. 按革兰氏染色的方法对筛选出的菌株进行染色，显示该菌株为阴性菌。

b. 在LB固体培养基上培养筛选出的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》观察其菌落特征和颜色等生理生化特点，显示：

该菌呈白色，表面光滑湿润，边缘整齐，较粘稠。

c. 采用细菌通用引物GM3F、GE4F进行PCR扩增，扩增出1200 bp的产物，测序，通过BLAST对测序结果进行序列比对，与GenBank中的序列进行同源性比较，结果显示与皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）存在99 %的同源性。

综合染色、生理生化特点和16s rDNA比对结果，该菌株EZ-50为皮氏罗尔斯通氏菌，并于2020年9月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC NO. 20622。

实施例2：皮氏罗尔斯通氏菌抑菌代谢产物的鉴定及功能验证

挥发性有机物是以碳为基本元素的固体或液体，能够在20℃和0.01 kPa环境下快速地挥发，进入气相状态。鉴于发明人前期长期积累的研究结果，此类微生物能产生大量种类丰富、功能多样的挥发性有机化合物，这些物质主要作用有：作为群落间和群落内的信号物质；细胞与细胞间的信号物质；可能的碳释放通道；生长促进和生长抑制因子。若作为抑制因子起作用，互相作用中被抑制的是植物病原微生物，那么释放挥发性有机化合物的微生物就具有应用于植物病害生物防治的潜力。

（1）挥发性有机物的收集

取5 mL牛肉膏蛋白胨培养基于20 mL顶空瓶中，加入0.1 g琼脂，用牛皮纸封上瓶口，121℃、30 min灭菌，灭菌完将瓶子倾斜30°角冷却凝固，取100 uL预先准备好的菌液加入瓶中，摇晃瓶体使菌液均匀分布在培养基斜面上，盖上牛皮纸，黑暗条件、30℃恒温培养48h，去掉牛皮纸，用带有聚四氟乙烯隔垫的中空螺旋盖封口，同时设置只加培养基、不接菌的顶空瓶作为空白对照，每个处理四个重复。

培养5 d之后，采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维（购于Supelco 公司）进行萃取，萃取头装配SPME手动萃取手柄上（Supelco，Bellefonte，PA，USA），在使用前先进行老化（按厂家说明书进行），之后在30℃恒温条件下萃取12 h。

（2）挥发性有机物的分析

萃取完成后立即采用7890A-5975C气相色谱-质谱分析仪（Agilent Technologies，USA）进行检测分析。

色谱条件：进样口温度250℃，进样时间2.7 min；不分流模式，载气为99.999%的高纯氦气，柱流速为1 mL/min；

柱箱升温程序：初始温度50℃，保持2 min，以8℃/min的速度升温至180℃，再以10℃/min的速度升温至240℃，保持6 min。

质谱条件：离子化方式为EI，70eV；离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，传输线温度250℃；扫描模式为全扫描，扫描范围35～450 amu。

测得的mVOCs质谱在NIST/EPA/NIH数据库中进行比对鉴定，该菌能产生多种挥发性有机化合物，如图2所示。

（3）抑菌活性物质抑菌效果鉴定

在PDA培养基中加入一个灭过菌的2 ml离心管盖子，盖子里加入50 uL纯品和150 uL灭菌水为试验组（25%浓度），对照组盖子里加入200 uL灭菌水，培养基中央加入10 uL立枯丝核菌菌液，32℃、黑暗条件下培养，观察立枯丝核菌生长状况，结果如图3所示。

（4）抑菌活性物质抑制立枯丝核菌侵染离体水稻叶片的效果评估

将立枯丝核菌接种在PDA培养基上，并预培养48小时。将稻叶切成5厘米长的片段，然后放在PDA培养基上；将200 uL的纯化合物（浓度分别为0、12.5％，25％和50％）添加到培养皿中的200 uL容器中；每个处理重复5次，每24小时观察一次，结果如图4所示。

结果表明，皮氏罗尔斯通氏菌EZ-50能有效抑制立枯丝核菌的生长，并且能产生多种挥发性有机化合物，其中本发明还首次研究发现苯甲酸乙酯（Benzoic acid ethyl ester）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one）、2-乙基-1-己醇（2-ethyl-1-hexanol）对立枯丝核菌致死，显著高于文献中已报道的二甲基二硫（Dimethyl disulfide）对立枯丝核菌的抑制，且苯甲酸乙酯和2-乙基-1-己醇能显著抑制立枯丝核菌对水稻叶片的侵染。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体成分或参数进行变更，或者是进行相关技术手段的等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。