本发明属于微生物资源与微生物技术领域，具体涉及一种水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1及其应用。
背景技术：
白酒是我国传统的蒸馏酒，其中浓香型白酒(泸型酒)生产及销售比例占整个白酒行业70％，其产量和品质显著影响着中国白酒行业的发展。据分析，浓香型白酒风味物质多达近674种，定量检测成分有近342种，关键风味物质为己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、己酸、丁酸和己酸，其中己酸乙酯为主体香味成分，其含量的多少及其在关键风味物质中的比例，决定着浓香型白酒风格的典型性及品质。
作为己酸乙酯合成的前体物质—己酸，主要由窖泥中己酸菌合成。己酸菌作为浓香型窖泥中关键功能菌，其在窖泥中含的量多少决定了窖泥的质量。目前窖泥中已筛出的产己酸菌主要包括梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、瘤胃菌科(Ruminnococcaceae)等。其中克氏梭菌(C.kluyveri)为窖泥里面筛选到的典型产己酸梭菌，赵晨婕等人通过对老窖泥多轮富集培养，从中筛选到Clostridium kluyveri A-3，其己酸产量达到9.77g/L，然而该菌产己酸对碳源要求苛刻，无法利用葡萄糖等糖类物质产己酸。而且目前所分离到的单菌普遍存在己酸产量较低，需要严格的厌氧环境，产酸周期较长等问题。目前，混菌发酵也受到了广泛的关注，研究发现甲烷菌、放线菌、酵母菌与己酸菌的混菌发酵有利于提高己酸的产生，改善严格的厌氧环境，但仍然需要筛选更佳的组合菌株来克服低产量，低稳定性方面的问题。通过代谢工程改造菌株提高菌株己酸产量的方法目前也仍然存在不稳定，产量低等问题。因此选育优良的产己酸菌株，不仅能利用多种碳源，而且在较短的周期达到较高较稳定的己酸产量仍然是整个浓香型白酒产业研究的重点。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1及其应用，本发明获得了一株能够高产己酸的菌株--水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)3B-1，能在多种碳源下厌氧发酵高产己酸，该菌能与丁酸梭菌复配，强化后能在厌氧环境下短期发酵就可产生大量己酸。可有效解决现有的产己酸菌种普遍存在产量低，产酸条件苛刻，产酸性能不佳，产酸周期长等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1(Rummeliibacillus suwonensis 3B-1)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年9月24日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020538。
进一步地，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
进一步地，该菌适宜生长温度为33℃～37℃，最适生长温度为35℃，pH耐受范围为1～10，最适pH为7。
一种微生物制剂，包括上述的水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1。
上述水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1，或微生物制剂在制备产己酸制剂中的应用。
一种酿酒用微生物制剂，包括上述水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1。
进一步地，水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1能在好氧或厌氧状态下产生己酸。
一种能提高己酸产量的复合菌剂，该复合菌剂包括上述水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1以及丁酸梭菌；水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1与丁酸梭菌以1～2:0.5～1的体积比混合。
进一步地，水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1与丁酸梭菌以1:1的体积比复配混合。
进一步地，丁酸梭菌为丁酸梭菌GD1-1。
进一步地，复合菌剂能在厌氧状态下产生己酸。
上述复合菌剂在酿酒中的应用。
上述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1种子液的制备
挑选实施例1步骤(2)生长得到的单菌落，使用接种环在无菌操作条件下挑取适量菌体接种于试管发酵液体培养基上，然后于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到试管种子液。
(2)丁酸梭菌GD1-1种子液的制备
采取斜面活化GD1-1，活化好的GD1-1斜面菌种接2环到试管葡萄糖发酵液体培养基中然后于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到种子液。其中，葡萄糖发酵液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸出粉10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 7.0。
(3)水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1与丁酸梭菌GD1-1复配利用不同碳源短期发酵制备复合己酸菌液
把步骤(1)的水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1种子液、步骤(2)的丁酸梭菌GD1-1种子液按1:1的比例(5％接种量)分别接种到以乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖和琥珀酸钠为碳源，其余成分配比与发酵液体培养基一致的各培养基中，在35℃条件下密封培养5天后得到复合己酸菌液，无菌操作取适量发酵液过0.2微米滤膜后进行气相色谱检测其己酸产量。
一种筛选上述水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1的方法，包括以下步骤：
(1)将窖泥富集液稀释涂布于己酸钠富集分离固体培养基上，获得菌株单菌落，纯化三次后接种于发酵液体培养基中获得菌株种子培养液；
(2)种子培养液按5～10％的比例接种于液体发酵培养基中，30～35℃发酵培养10～12天，通过硫酸铜显色法进行初筛，选取显色反应明显的菌株，再通过检测其发酵液中己酸含量，筛选得到该水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1。
进一步地，乙酸钠富集分离固体培养基的制备过程为：
称取乙酸钠15g/L，七水硫酸镁0.2g/L，硫酸铵0.5g/L，三水磷酸氢二钾0.04g/L，酵母膏10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,加入适量去离子水后用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。加入20g/L的琼脂加热溶解后定容到合适体积，用量筒准确分装，121℃灭菌20min。待灭菌后温度降至60℃加入适当比例的无水乙醇20mL/L(已过滤除菌)和碳酸钙10g/L(单独灭菌，灭菌后加)充分摇匀使用。
进一步地，发酵液体培养基的制备过程为：
称取乙酸钠15g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸出粉10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,加入适量去离子水后用氢氧化钠溶液调节pH至7.0 pH 7.0。用量筒准确分装，121℃灭菌20min，灭菌后待温度降至低温时加入适当比例的已过滤除菌的无水乙醇20mL/L。
本发明的有益效果为：
1、本发明筛选得到的水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)3B-1菌种产己酸水平为406.4mg/100mL，产丁酸水平最高为455.9mg/100mL，并且随着发酵时间的延长，仍然保持较高的产己酸水平，说明3B-1菌株具有较高较稳定的高产己酸能力。是目前所报道的产己酸能力较高的菌株，具有重要的应用前景。
2、本发明所筛选得到的3B-1菌株可利用不同碳源生产己酸，且均能保持较高的己酸产量。尤其在碳源为葡萄糖的条件下，己酸产量最高，为406.4mg/100mL，为产己酸的最佳碳源。其具有能够利用广泛底物高产己酸的能力，应用范围广。
3、本发明所筛选得到的3B-1菌株无氧发酵时，己酸产量远远大于摇瓶有氧培养，为406.4mg/100mL几乎是有氧条件下己酸产量三倍多，在厌氧环境中菌株能产生更多的己酸；此外，该菌株在好氧的条件下也拥有产己酸的能力，仍然相对较高的产己酸水平，说明3B-1菌株具有在厌氧或好氧状态下较高较稳定的高产己酸能力。相对于严格厌氧产己酸的微生物，3B-1菌株应用不需要时刻严格厌氧，操作更为便利。
4、本发明所筛选得到的3B-1菌株在与丁酸梭菌复配后可以在利用不同碳源厌氧条件下短期发酵过程中显著提高复合发酵液中的己酸产量，制备高己酸含量的复合己酸菌液。
附图说明
图1为实施例1中气相色谱条件下标样出峰图；
图2为高产己酸菌株3B-1在发酵固体培养基(未加碳酸钙)上厌氧培养的菌落图；
图3为高产己酸菌株3B-1的显微形态图；
图4为高产己酸菌株3B-1在16S rDNA PCR产物电泳图；其中，条带1为DNA Marker，条带2为16S rDNA PCR产物；
图5为菌株3B-1的16SrDNA系统发育树图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1的获得
本发明的高产己酸水原拉梅尔芽孢杆菌分离于川内某浓香型白酒窖池优质老窖泥。所用的乙酸钠富集分离培养基成分为：乙酸钠15g/L，无水乙醇20mL/L(已过滤除菌)，七水硫酸镁0.2g/L，碳酸钙10g/L(单独灭菌，灭菌后加)，硫酸铵0.5g/L，三水磷酸氢二钾0.04g/L，酵母膏10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,pH 7.0。加入20g/L的琼脂为固体培养基。
发酵液体培养基成分为：乙酸钠15g/L，无水乙醇20mL/L(已过滤除菌)，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸出粉10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,pH 7.0。
气相色谱条件:DB-WAX(60m×250μm×0.25μm)色谱柱；
载气为高纯度H2，初始温度为80℃(1min)，以20℃/min升高至200℃，再以50℃升高至250℃(1min)；
SIM(选择离子扫描模式)，扫描离子为60,87,88,116；
分流比20:1，载气流速1mL/min；
在该条件下，标样的出峰情况如图1所示，丁酸和己酸的出峰时间分别为9.335min和11.783min。
样品准备：使用无菌水将纯化后的单菌落制成相同浓度的种子液，按5％接种量接种至100mL发酵液体培养基中，35℃发酵10d，取上清液适量过0.2μm微孔滤膜。并取1mL装于进样瓶采用外标法进行气相色谱定性定量分析。
一、菌株的分离
1、窖泥的富集
称取10g窖泥加入装有10mL无菌水的厌氧瓶中，80℃恒温水浴处理10min，冷却后以5％的接种量接种到灭菌后的乙酸钠富集分离培养基中，于厌氧箱中35℃富集培养5-7d，得到富集液。
2、菌株的分离纯化
采用稀释涂布法分离富集液中的己酸菌，将富集液分别稀释至10-1～10-6，吸取10-3～10-6菌液0.1mL涂布于乙酸钠富集分离固体培养基(已在厌氧培养箱除氧24h)，于35℃厌氧培养箱培养3～5d。将具有不同形态特征的菌落进行再次划线纯化至少三次，获得单菌落。
3、高产己酸菌的筛选
挑选步骤(2)生长得到的单菌落，使用接种环在无菌操作条件下接种于试管发酵液体培养基上，然后于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到一级种子液，再分别取所筛得的菌的一级种子液5％接种于100mL已灭封灭菌的发酵液体培养基中35℃静置培养十天，通过硫酸铜显色法进行初筛，并选取显色反应明显的菌株，通过气相色谱检测其发酵液中己酸含量。最终筛选出一株高产己酸的菌株，将其命名为3B-1。
二、3B-1的鉴定
1、形态特征
经过对3B-1的形态观察，其菌株的形态如下：菌体粗长杆状，端生芽孢，呈鼓槌状，革兰氏阳性菌，在发酵固体培养基(不含碳酸钙)培养24h后，形成不规则圆形菌落，菌落较大，不透明，边缘为淡黄色，中间明显凸起为乳白色。菌落形态及菌体显微形态如图2所示。
2、生理生化鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对3B-1进行生理生化鉴定，结果见表1。
表1 3B-1进行生理生化鉴定结果
注:+表示阳性反应；－表示阴性反应。
3、16S rDNA序列测定与分析
(1)DNA的提取
将纯化后不同形态的单菌落接种至发酵液体培养基中，35℃培养10d，吸取2mL培养液于无菌离心管中，13 000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀(共2～3次)。菌体沉淀使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并按操作步骤提取基因组DNA。
(2)PCR扩增及系统发育树的构建
将步骤(1)得到的DNA溶液作为扩增模板，采用细菌通用引物27F-1492R进行PCR扩增；
PCR扩增体系为：5×Buffer(含Mg2+)10μL，200μmol/LdNTPs 1μL，正反向引物各1μL，Taq DNA聚合酶1μL，模板DNA 3μL，加无菌水补足至50μL；
扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物在南京派森诺基因技术有限公司测序。测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树。基于16SrDNA的系统发育进化树如图5所示。
PCR扩增结果见图4，PCR产物大小为1428bp，经测序鉴定，菌株3B-1的16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
经过对3B-1菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定3B-1为水原拉梅尔芽孢杆菌。该菌适宜生长温度为33℃-37℃，最适生长温度为35℃，pH耐受范围为1～10，最适pH为7，耐乙醇浓度至5％。耐己酸浓度高达30g/L。
该菌在乙酸钠富集分离固体培养基中35℃培养3天，连续传代数代培养，其培养特征、形态特征、生理生化等生物学特征均无明显变化，表现出良好的生物学性状稳定性。菌株经16S rDNA鉴定为产己酸菌(Rummeliibacillus suwonensis)，并命名为水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)3B-1，已于2020年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020538。
实施例2水原拉梅尔3B-1在高产己酸中的应用
一、3B-1的发酵培养及产己酸量检测
将实施1所获得的3B-1菌株用接种环无菌操作接种于装有发酵液体培养基的试管中，于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到种子液；将种子液5％接种量接种于100mL已灭封灭菌的发酵液体培养基中35℃静置培养。用一次性的注射器于发酵10天时吸取适量发酵液过0.2μm微孔滤膜。并取1mL装于进样瓶采用外标法进行气相色谱定性定量分析。测定3B-1利用乙酸钠为碳源时的丁酸和己酸产量。每个样品做三个重复。检测结果如表2所示。
表2 3B-1利用乙酸钠为碳源时不同时间段产酸情况
二、3B-1发酵产己酸的碳源探索
将实施1中所获得的种子液按照5％的接种量接种到100mL以乙酸钠(15g/L)、乳酸钠(20g/L)、葡萄糖(20g/L)、琥珀酸钠(20g/L)为碳源，其余成分配比与发酵液体培养基一致的各培养基中，在35℃条件下密封培养10天后，无菌操作取适量发酵液过0.2μm滤膜后进行气相色谱检测其丁酸和己酸产量。检测结果如表3所示，从表中可以看出，在碳源为葡萄糖的条件下，己酸产量最高，为产己酸的最佳碳源；其次，菌株利用乳酸钠也表现了较高的产己酸能力，且产己酸产量稳定。
表3 3B-1利用不同碳源时发酵十天的产酸情况
三、3B-1发酵产己酸的氧气条件探索
将实施1中所获得的种子液按照5％的接种量接种到100mL以葡萄糖为底物的发酵液体培养基中，在35℃条件下密封培养和三角瓶摇瓶培养(200r/min)，并在10天时无菌操作取适量发酵液过0.2μm滤膜后进行气相色谱检测其丁酸和己酸产量。每个样品做三个重复。
检测结果如表4所示，从表中可以看出，无氧发酵时，己酸产量远远大于摇瓶有氧培养，几乎是有氧条件下己酸产量三倍多，在厌氧环境中菌株能产生更多的己酸；此外，该菌株在好氧的条件下也拥有产己酸的能力，仍然相对较高的产己酸水平，说明3B-1菌株具有在厌氧或好氧状态下较高较稳定的高产己酸能力。
表4 3B-1利用葡萄糖为碳源时在有氧和无氧环境下发酵十天产酸情况
实施例3水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1与丁酸梭菌GD1-1复配制备复合己酸菌液
(1)水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1种子液的制备：
挑选实施例1步骤(2)生长得到的单菌落，使用接种环在无菌操作条件下挑取适量菌体接种于试管发酵液体培养基上，然后于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到试管种子液。
(2)丁酸梭菌GD1-1种子液的制备：采取斜面活化GD1-1，活化好的GD1-1斜面菌种接2环到试管葡萄糖发酵液体培养基中然后于35℃厌氧培养箱培养3～5d，得到种子液。其中，葡萄糖发酵液体培养基配方为：葡萄糖20g/L,七水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸出粉10g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 7.0。
(3)水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1与丁酸梭菌GD1-1复配利用不同碳源短期发酵制备复合己酸菌液
把步骤(1)的水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1种子液、步骤(2)的丁酸梭菌GD1-1种子液按1:1的比例(5％接种量)分别接种到以乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖和琥珀酸钠为碳源，其余成分配比与发酵液体培养基一致的各培养基中，在35℃条件下密封培养5天后得到复合己酸菌液，无菌操作取适量发酵液过0.2微米滤膜后进行气相色谱检测其己酸产量。
单菌和复合己酸菌液产己酸检测结果如表5所示，由两菌制备的复合己酸菌液己酸产量显著高于单菌己酸产量，在短期内发酵时间内即可获得高己酸产量的己酸菌液。
表5利用不同碳源时单菌和混菌厌氧发酵五天产酸情况
序列表
<110> 四川轻化工大学
<120> 一种水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 水原拉梅尔芽孢杆菌3B-1(Rummeliibacillus suwonensis)
<400> 1
ctatactgca gtcgagcgca tgacgaggag cttgctcctc tgattgagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg tgggcaacct gccctgtaga cggggataac ttcgggaaac cggagctaat 120
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