降解N,N-二甲基甲酰胺的副球菌及在废水处理中的应用的制作方法

本发明属于有机污染物生物法处理技术领域，涉及一株降解N,N-二甲基甲酰胺的副球菌，具体涉及一株以难降解有机污染物N,N-二甲基甲酰胺为电子供体进行反硝化的副球菌及在废水处理中的应用。

背景技术：

N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)，是一种人工合成的有机极性溶剂，由于其良好的水混溶性且能溶解不同种类的有机物等特点，被广泛应用于化工、制药和纺织等行业中。据报道，每年有超过5000吨的DMF被排放或转移到环境中。DMF结构稳定，不易水解或光解，也不易被环境微生物所降解，极易在自然环境中累积和转移，具有生物毒性、胚胎毒性、肝毒性、致畸和致癌等特性。因此，发展高效经济的废水处理技术处理含DMF的工业废水，已成为目前环境治理领域的重要课题之一。

目前，含DMF废水的处理方法包括高级氧化法、光催化降解法、膜分离法和物理吸附法等。其中，高级氧化和膜分离等物理化学方法处理含DMF废水成本较高，二次污染严重。生物法处理技术具有经济、高效、二次污染小等诸多优点，可实现无害化治理，是处理含有DMF废水比较合适的废水处理技术。但是，由于DMF的毒性和难降解特性，DMF污染生物处理的前提是获得能够耐受DMF生物毒性、具有降解功能的菌株。目前已报道的DMF降解菌株有副球菌(Zhou,X.,Jin,W.,Sun,C.,Gao,S.,Chen,C.,Wang,Q.,Han,S.,Tu,R.,Latif,M.A.,Wang,Q.Microbial degradation of N,N-dimethylformamide by Paracoccus sp.Strain DMF-3 from activated sludge.Chem.Eng.J.2018,343,324-330.)、红球菌(Chen,X.,Yang,C.,Wang,W.,Ge,B.,Zhang,J.,Liu,Y.,Nan,Y.Biodegradation of N,N-dimethylacetamide by Rhodococcussp strain B83 isolated from the rhizosphere of pagoda tree.J.Environ.Sci.2017,53,88-98.)、苍白杆菌(Veeranagouda,Y.,Paul,P.V.E.,Gorlap,P.,Siddavattam,D.,Karegoudar,T.B.Complete mineralization of dimethylformamide by Ochrobactrumsp DGVK1 isolated from the soil samples collected from the coalmine leftovers.Appl.Environ.Microbiol.2006,71,369-375.)和产碱杆菌(Hasegawa,Y.,Matsuo,M.,Sigemoto,Y.,Sakai,T.,Tokuyama,T.Purification and characterization of N,N-dimethylformamidase from Alcaligenes sp.KUFA-1.J.Ferment.Bioeng.1997,84,543-547.)等。但是，现有的可降解DMF的菌株均需在耗氧条件下培养，在实际应用中大大增加了耗电曝气等工艺运行成本，并且传统的厌氧处理技术去除效率低，且稳定性较差。

技术实现要素：

1.要解决的问题

针对目前用生物法处理含污染物DMF的废水工艺均需要在耗氧条件下进行，运行成本高的问题，本发明提供了一株高效降解DMF的副球菌(Paracoccus)菌株，该菌株可利用DMF作为电子供体、硝态氮为电子受体进行反硝化脱氮反应，在缺氧反硝化脱氮的同时实现DMF的降解。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明以长期用于处理DMF废水的活性污泥为菌源，以DMF为碳源的培养基作为筛选培养基，分离、纯化，得到一株利用DMF作为电子供体进行反硝化的副球菌，命名为Paracoccus sp.NJUST48，于2020年11月06日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020683。

所述副球菌16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示(表1)。

本发明还提供了上述副球菌Paracoccus sp.NJUST48的筛选方法，以长期用于处理DMF废水的活性污泥为菌源，进行菌株的分离、纯化、鉴定。

优选地，筛选包括如下步骤：

(1)取样，从长期用于处理DMF废水的活性污泥中取样，加入到无菌生理盐水中，搅拌均匀，静置。

进一步地，取样10mL，加入到100mL无菌生理盐水中，静置2小时。

(2)富集，取(1)中上清液，加入无机盐液体培养基中，富集培养并重复。

进一步地，取(1)中上清液1mL，加入到50mL无机盐液体培养基中，在恒温震荡培养箱中富集培养三天(28～32℃，180转/分钟)，富集三次。

优选地，无机盐培养基的组成为：NaHPO4·12H2O(1.53g L^-1)，KH2PO4(0.38g L^-1)，MgSO4·7H2O(0.1g L^-1)，CaCl2(0.05g L^-1)，微量元素溶液SL-4(10mL L^-1)。

微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g L^-1)，FeSO4·7H2O(0.2g L^-1)，微量元素SL-6(100mL L^-1)。

微量元素SL-6组成：ZnSO4·7H2O(0.01g L^-1)，MnCl2·4H2O(0.03g L^-1)，H3BO4(0.3g L^-1)，CoCl2·6H2O(0.2g L^-1)，CuCl2·2H2O(0.01g L^-1)，NiCl2·6H2O(0.02g L^-1)，Na2MoO4·2H2O(0.03g L^-1)。

(3)稀释，取(2)中的培养液用无菌生理盐水梯度稀释。

进一步地，稀释至10^-4-10^-10倍，也可根据实际情况调整稀释倍数。

(4)固体培养基涂布培养并纯化培养，制备无机盐琼脂固体培养基平板，将稀释后的培养液分别涂布于无机盐琼脂固体培养基平板上，置于生化培养箱中培养；挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，进行纯化培养。

进一步地，取20μL涂布，培养条件为：28℃～32℃，3天。

进一步地，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，按需要重复多次。进一步地，连续纯化五次，得到单一菌株。

(5)液体培养并保存，将步骤(4)中纯化培养后的单菌落在无氧的含有DMF及硝态氮的无机盐液体培养基中培养，监测培养过程中DMF及硝态氮的浓度变化，选取能最有效去除DMF及硝态氮的菌株进行保存。

优选地，选用上述无机盐液体培养基，加入DMF及硝态氮，纯氦气进行曝气以去除溶解氧。

优选地，培养在恒温震荡培养箱中进行，培养条件为：180转/分钟和28℃～32℃。

(7)对保存的菌株进行鉴定，选用形态学、生理生化测试或分子生物学鉴定中的一种或多种。

本发明还提供了上述副球菌的培养方法，将Paracoccus sp.NJUST48接种在LB培养基中，培养基pH为6.5～7.5，培养温度为28℃～32℃。

优选地，上述LB培养基还含有DMF和硝酸钠。

优选地，DMF和硝酸钠的摩尔比为(0.8～1.5):1。进一步地，DMF和硝酸钠的摩尔比为0.8:1。

优选地，DMF浓度为11.7～15.3mM，硝酸钠浓度为15.6～19.6mM。

本发明还提供了上述的副球菌在含有DMF废水处理中的应用。

优选地，废水中含有硝态氮，或向废水中添加硝态氮。

优选地，废水处理的温度为28℃～32℃，和/或处理的pH为6.5～7.5。

优选地，将上述的副球菌配制成种子液，加入到废水中。进一步地，所述的副球菌种子液的OD600为1.5～2.0，接种量为5％～10％。

优选地，将上述的副球菌做成菌剂，加入到废水中。

本发明还提供了一种降解DMF的菌剂，菌剂中含有上述筛选的副球菌Paracoccus sp.NJUST48。

3.有益效果

本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

(1)本发明提供的副球菌Paracoccus sp.NJUST48，对生存环境的适应能力和耐受能力更强，可以在缺氧条件下处理废水中DMF，相比于耗氧条件，应用于工业废水的工艺处理中可减少耗氧曝气工段，节约经济成本。

(2)本发明提供的副球菌Paracoccus sp.NJUST48，利用DMF作为电子供体，硝态氮为电子受体进行代谢和生长，同时具有高效的DMF降解能力和反硝化脱氮能力，可成功应用于同时含有硝态氮和DMF废水的生化处理，实现废水中硝态氮和DMF的高效去除。如图2所示，比传统厌氧条件下的处理效率更高。

(3)本发明利用工业废水中通常含有较高浓度的硝酸盐的特点，获得以DMF为电子供体、硝态氮为电子受体的高效菌株，在缺氧反硝化脱氮的同时实现DMF的降解，对含DMF和硝态氮的工业废水的低成本和无害化处理产生重要意义。

附图说明

图1是副球菌Paracoccus sp.NJUST48的扫描电子显微镜图。

图2是副球菌Paracoccus sp.NJUST48在DMF初始浓度为13.7±0.9mM的液体培养基中对DMF的降解效果图。

图3是副球菌Paracoccus sp.NJUST48在硝态氮初始浓度为17.6±1.9mM的液体培养基中对硝态氮的脱氮效果图。

图4是副球菌Paracoccus sp.NJUST48在不同进水pH条件下降解DMF同步反硝化脱氮的效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

实施例1

降解DMF的副球菌的筛选、分离及鉴定。

(1)菌株的筛选及分离

从长期用于处理DMF废水的活性污泥中取样10mL，加入到100mL无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)中，搅拌均匀，静置两个小时。取1mL上清液加入到50mL无机盐液体培养基中，在恒温震荡培养箱中富集培养三天(28℃～32℃，180转/分钟)，连续三次富集后，取培养液用无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)梯度稀释至10^-4-10^-10倍。

制备无机盐琼脂固体培养基平板，将稀释后的培养液20μL分别涂布于无机盐琼脂固体培养基平板上，置于生化培养箱中28℃～32℃培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株。

配制100mL含有DMF及硝态氮的无机盐液体培养基，装入120mL血清瓶中，用纯氦气进行曝气以去除溶解氧，121℃高温灭菌后接种分离纯化得到的纯菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和28℃～32℃的条件进行培养，监测培养过程中DMF及硝态氮的浓度变化。选取能有效去除培养基中DMF和硝态氮的菌株，命名为NJUST48，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。

无机盐培养基的组成为：NaHPO4·12H2O(1.53g L^-1)，KH2PO4(0.38g L^-1)，MgSO4·7H2O(0.1g L^-1)，CaCl2(0.05g L^-1)，微量元素溶液SL-4(10mL L^-1)。

微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g L^-1)，FeSO4·7H2O(0.2g L^-1)，微量元素SL-6(100mL L^-1)。

微量元素SL-6组成：ZnSO4·7H2O(0.01g L^-1)，MnCl2·4H2O(0.03g L^-1)，H3BO4(0.3g L^-1)，CoCl2·6H2O(0.2g L^-1)，CuCl2·2H2O(0.01g L^-1)，NiCl2·6H2O(0.02g L^-1)，Na2MoO4·2H2O(0.03g L^-1)。

DMF和硝酸钠的量根据实验需要投加。

在液体培养基的基础上加入20g L^-1的琼脂，在灭菌锅内121℃高压灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基平板。

(2)菌株的鉴定

对步骤(1)中获得的菌株NJUST48进行形态学、生理生化测试及分子生物学鉴定，测定菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的菌属。

表1副球菌16S rRNA基因序列

①形态学特征：NJUST48菌落呈成微黄色，表面光滑不透明，边缘整齐，有光泽，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株细胞呈短杆状，细胞表面分泌物较多，细胞尺寸为0.37～0.56μm×0.93～1.48μm，图1为细菌NJUST48的扫描电子显微镜图。

②生理生化特征：革兰氏阴性菌，硝酸盐还原酶呈阳性。

③分子生物学鉴定：以NJUST48菌株的核DNA为模板，以细菌扩增的通用引物进行PCR扩增，测定菌株NJUST48的基因序列，基因序列如SEQ ID NO:1所示。将菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库进行同源性比较，结果表明，NJUST48与Paracoccus sp.Y3B-1(HM018693.1)的序列相似度达99％以上。根据NJUST48的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST48鉴定为Paracoccus菌属，命名为Paracoccus sp.NJUST48。

实施例2

菌株Paracoccus sp.NJUST48在含有DMF和硝态氮废水处理中的应用。

将Paracoccus sp.NJUST48接种至含有6.8mM的DMF的LB液体培养基中，调节pH为6.5～7.5，28℃～32℃条件下180转/分钟摇床培养，进行NJUST48的菌株富集，待菌株进入对数生长期后(约48小时)，将所得菌液用超低温离心机离心10分钟(4℃，6000转/分钟)，得到沉积菌体。用灭菌后的无机盐液体培养基重悬，离心，重复洗涤三次，将菌体重悬于无菌液体无机盐培养基中，检测OD600为1.5～2.0时，得到种子液。

向120mL血清瓶中加入100mL含有DMF初始浓度为13.7±0.9mM、硝酸钠初始浓度为17.6±1.9mM的无机盐液体培养基作为模拟废水，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为5％～10％，在28℃～32℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中DMF和硝态氮的浓度变化。设立未添加硝酸钠的实验组作为厌氧对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系。设立未接种NJUST48的实验组作为非生物对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系。

实验结果如图2所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，13.7±0.9mM的DMF在22小时内被完全降解。如图3所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，17.6±1.9mM的硝态氮在22小时内可实现完全脱氮。然而，在未添加电子受体硝酸钠的厌氧对照体系中，相同浓度的DMF的去除率低于30％(图2)。此外，在未接种NJUST48的非生物对照体系中，硝态氮和氮甲基吡咯烷酮的浓度没有明显变化(图2)。本实施例说明分离得到的Paracoccus sp.NJUST48可成功应用于同时含有硝态氮和DMF废水的生化处理，实现废水中硝态氮和DMF的高效去除。

实施例3

菌株Paracoccus sp.NJUST48在不同pH条件下在含有DMF和硝态氮废水处理中的应用。

配制100mL含DMF初始浓度为13.5±1.8mM，硝态氮初始浓度为17.6±2.0mM，初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的无机盐液体培养基作为模拟废水，加入到120mL血清瓶中，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为5％～10％，在28℃～32℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中DMF和硝态氮的浓度变化。

实验结果如图4所示，在初始pH为6.0和7.0的条件下，Paracoccus sp.NJUST48均可实现DMF和硝态氮的去除，且在pH为7.0时DMF和硝态氮被完全去除；在初始pH为5.0和8.0的条件下，Paracoccus sp.NJUST48去除DMF和硝态氮的速率大幅度降低；而在pH为9.0的条件下，DMF和硝态氮的去除率低至8％以下。

本实施例说明，在缺氧反硝化体系中，菌株Paracoccus sp.NJUST48降解DMF和反硝化脱氮合适的pH范围在弱酸性至中性，且在中性环境下去除效率最高，碱性环境会显著降低DMF和硝态氮的去除能力。

序列表

<110> 南京理工大学

生态环境部南京环境科学研究所

<120> 降解N,N-二甲基甲酰胺的副球菌及在废水处理中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1214

<212> DNA

<213> 副球菌(Paracoccus)

<400> 1

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gttccgcgat 60

tactagcgat tccaacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagatggct 120

tttggggatt aacccactgt caccaccatt gtagcacgtg tgtagcccaa cccgtaaggg 180

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gtgcccaacc aaatgatggc aactggaagt gtgggttgcg ctcgttgccg gacttaaccg 300

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtccacagg tctcttacga 360

gaagacccga tctctcgggc tgtcctgcga tgtcaagggt tggtaaggtt ctgcgcgttg 420

cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 480

taatcttgcg accgtactcc ccaggcggaa tgcttaatcc gttaggtgtg tcaccgaaca 540

gcatgctgcc cgacgactgg cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 600

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ccactggtgt tcctccgaat atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactcacc 720

tctctcgaac tccagaccaa tagttttgaa ggcagttccg aggttgagcc ccgggatttc 780

acccccaact ttctggtccg cctacgtgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta 840

gccccctccg tattaccgcg gctgctggca cggagttagc cggggcttct tctgctggta 900

ccgtcattat cttcccagct gaaagagctt tacaacccta aggccttcat cactcacgcg 960

gcatggctag atcagggttg cccccattgt ctaagattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1020

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ctgatcatcc tctcaaacca gctatggatc 1080

gtaggcttgg taggccatta ccccaccaac tacctaatcc aacgcgggcc gatccttctc 1140

cgataaatct ttcccccaag gggcgtatac ggtattactc ccagtttccc agggctattc 1200

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