一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程与酶工程
技术领域：
，具体领域为一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建及其应用。
背景技术：
：替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的具有选择性的小分子抗凝血药，它是属于环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂，作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集，该药于2011年7月被美国FDA批准上市，2012年11月获准在中国上市。其中，(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。目前文献报道的(1R，2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺的主要合成方法如下：WO2008018822A公开了以邻二氟苯和氯乙酰氯为原料经傅克反应、不对称还原、环化、环丙烷化，氨解和霍夫曼降解得到(1R，2S)-2-(3,4_二氟苯基)环丙胺，其合成路线如下：在上述合成路线中，化合物VII制备化合物VI采用化学方法进行不对称还原，存在手性选择性差、光学纯度差、操作繁琐、生产成本高且污染严重等问题。CN107686447A和CN106906249A均提及了一种替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的酶催化制备方法，但酶活较低，有机溶剂使用量大。且CN107686447的酶催化反应需要葡糖的添加，增加了废水处理量，且真菌发酵产酶的生产成本要高于常规的E.coli菌株。因此，目前仍亟需一种经济有效的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物制备方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用，通过基因工程技术筛选高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原的还原酶基因并实现异源功能性表达，获得高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成重要的药物中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化剂。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，以pET-30a质粒为载体，表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamHI和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法：全合成2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因TGCDNA序列，保存于pUC57质粒中，设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1(GCGGGATCCATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGA)、P2(CCGCTCGAGTTACGGCAGGGTGTAACCA)，如SEQIDNO：3-4所示；以pUC57为模板，PCR扩增含有BamHI和XhoI酶切位点的TGC基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和XhoI酶切胶回收产物及pET-30a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-30a2μL，Buffer2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coliBL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。采用本发明所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。本发明所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及其生产得到的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶在催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过基因工程技术，制备了一种全新的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶并构建了2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，并实现了异源表达，手性选择ee值可达100％，可以替代现有的化学法进行(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。并且，同现有的羰基还原酶催化方法相比，本发明方法切实有效，酶催化活性高，对环境友好。附图说明图1为pET30a-TGC-K01质粒结构图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例12-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57-TGC为模板，通过PCR的方式扩增含有BamHI和XhoI酶切位点的TGC基因。PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。BamHI和XhoI酶酶切胶回收产物及pET-30a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因TGC与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a2μL，Buffer2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。如图1所示。将构建好的载体通过化转技术导入E.coliBL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。其中，2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列为SEQIDNO：1，2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列是SEQIDNO：2。LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0。表1引物引物名称序列编号P1GCGGGATCCATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGASEQIDNO：3P2CCGCTCGAGTTACGGCAGGGTGTAACCASEQIDNO：4实施例2重组菌发酵产酶制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(1)制备2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液将实施例1构建的重组菌接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的IPTG，18℃诱导16h，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(0.1M)洗后重悬，进行超声波破碎，功率260W运行3s，间隔5s，总时长3min，获得粗酶液。(2)酶催化制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇分别称取0.219g的NaH2PO4·2H2O和0.786g的Na2HPO4·12H2O于250mL三角瓶中，加入18mL水溶解，再加入0.26g的吐温80，混匀。再分别加入10mL的步骤(1)制备的粗酶液和10mL的异丙醇脱氢酶，以及10mg的NADP+，混匀。另称取1g的化合物于5mL离心管中，加入4mL的异丙醇溶解后再缓慢加入三角瓶中，30℃，220rpm，摇床催化反应。反应3h，底物完全转化。催化率约为2.5。加入等体积乙酸乙酯萃取2次，取上层乙酸乙酯相。30℃减压浓缩后称重1.15g，手性纯度100％，化学纯度：92.08％，转化率：96％。表2物料表尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表<110>江苏阿尔法药业有限公司<120>一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用<160>4<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>283<212>PRT<213>2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(ArtificialSequence)<400>1MetAlaLysAsnPheSerAsnValGluTyrProAlaProProProAla151015HisThrLysAsnGluSerLeuGlnValLeuAspLeuPheLysLeuAsn202530GlyLysValAlaSerIleThrGlySerSerSerGlyTyrGlyTyrAla354045LeuAlaGluAlaPheAlaGlnValGlyAlaAspValAlaIleTrpTyr505560AsnSerHisAspAlaThrGlyLysAlaGluAlaLeuAlaLysLysTyr65707580GlyValLysValLysAlaTyrLysAlaAsnValSerSerSerAspAla859095ValLysGlnThrIleGluGlnGlnIleLysAspPheGlyHisLeuAsp100105110IleValValAlaAsnAlaGlyIleProTrpThrLysGlyAlaTyrIle115120125AspGlnAspAspAspLysHisPheAspGlnValValAspValAspLeu130135140LysGlyValGlyTyrValAlaLysHisAlaGlyArgHisPheArgGlu145150155160ArgPheGluLysGluGlyLysLysGlyAlaLeuValPheMetAlaThr165170175MetSerGlyHisIleValAsnValProGlnPheGlnAlaThrTyrAsn180185190AlaAlaLysAlaGlyValArgHisPheAlaLysSerLeuAlaValGlu195200205PheAlaProPheAlaArgValAsnSerValSerMetGlyTyrIleAsn210215220ThrGluIleSerAspPheValProGlnGluThrGlnAsnLysTrpTrp225230235240SerLeuValProLeuGlyArgGlyGlyGluThrAlaGluLeuValGly245250255AlaTyrLeuPheLeuAlaSerAspAlaGlySerTyrAlaThrGlyThr260265270AspIleIleValAspGlyGlyTyrThrLeuPro275280<210>2<211>852<212>DNA<213>2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(ArtificialSequence)<400>2atggctaaaaacttctctaacgttgaatacccggctccgccgccggctcacaccaaaaac60gaatctctgcaggttctggacctgttcaaactgaacggtaaagttgcttctatcaccggt120tcttcttctggttacggttacgctctggctgaagcgttcgctcaggttggtgctgacgtt180gctatctggtacaactctcacgacgctaccggtaaagctgaagctctggctaaaaaatac240ggtgttaaagttaaagcgtacaaagctaacgtttcttcttctgacgctgttaaacagacc300atcgaacagcagatcaaagacttcggtcacctggacatcgttgttgctaacgctggtatc360ccgtggaccaaaggtgcttacatcgaccaggacgacgacaaacacttcgaccaggttgtt420gacgttgacctgaaaggtgttggttacgttgctaaacacgctggtcgtcacttccgtgag480aggttcgaaaaagaaggcaaaaaaggtgctctggttttcatggctaccatgtctggtcac540atcgttaacgttccgcagttccaggctacctacaacgctgctaaagctggtgttcgtcac600ttcgctaaatctctggctgttgaatttgctccgttcgctcgtgttaactctgtttctatg660ggctacatcaacaccgaaatctctgacttcgttccgcaggaaacccagaacaaatggtgg720tctctggttccgctgggtcgtggtggtgaaaccgctgaactggttggtgcttacctgttc780ctggcttctgacgctggttcttacgctaccggtaccgacatcatcgttgacggtggttac840accctgccgtaa852<210>3<211>35<212>DNA<213>P1(ArtificialSequence)<400>3gcgggatccatggctaaaaacttctctaacgttga35<210>4<211>28<212>DNA<213>P2(ArtificialSequence)<400>4ccgctcgagttacggcagggtgtaacca28当前第1页1 2 3