茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因及其在防治茄二十八星瓢虫中的应用的制作方法

本发明属于虫害防控技术领域，更具体地，涉及茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因及其在防治茄二十八星瓢虫中的应用。

背景技术：

茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata属于鞘翅目、瓢虫科，是亚洲地区最为严重的经济害虫之一，寄主植物十分广泛，主要为害茄子、马铃薯和番茄等茄科蔬菜和葫芦科蔬菜如黄瓜、冬瓜和丝瓜等。其幼虫和成虫为害植物的叶片、花萼和果实等，喜群集于叶片背面，取食叶肉，受害叶片通常形成不规则透明斑，严重时只剩网状的叶脉。茄二十八星瓢虫适应能力强，繁殖力强，在我国的分布范围广泛，尤其是长江以南发生密度较大。近年来，随着茄科等蔬菜种植面积不断扩大，茄二十八星瓢虫的发生和为害愈加严重。因此，对该虫的防治刻不容缓。

目前，茄二十八星瓢虫的防治主要依赖于化学杀虫剂。然而长期使用化学杀虫剂会引起农药残留、抗药性和害虫再猖獗等众多问题，因此，亟需找到一种精准防治，且环境友好的新方法来防治茄二十八星瓢虫并降低对化学杀虫剂的依赖。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种在进化过程中高度保守，依赖于产生的短片段RNAs(siRNAs)，从而促进同源mRNA高效特异性降解的现象。本发明人团队前期研究发现，利用直接饲喂合适的外源dsRNA的方式即可实现对瓢虫的毒性，因此根据RNAi技术的原理，开发可直接饲喂的外源dsRNA产品，可高效安全的对虫害进行防治，使用方便、成本低，可实现茄二十八星瓢虫的精准防控。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因及其在防治茄二十八星瓢虫中的应用。本发明利用直接饲喂FTZ-F1基因dsRNA(dsFTZ-F1)的方法，使茄二十八星瓢虫幼虫蜕皮或化蛹失败而死亡，从而达到高效精准防治茄二十八星瓢虫的目的。该方法具有见效快、操作方便、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种茄二十八星瓢虫的FTZ-F1基因。

本发明的第二个目的是提供一种茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因的dsRNA。

本发明的第三个目的是提供所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在预防茄二十八星瓢虫害、或制备防治茄二十八星瓢虫害的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在抑制茄二十八星瓢虫生长和/或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在促进茄二十八星瓢虫死亡和/或制备促进茄二十八星瓢虫死亡的产品中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种防治茄二十八星瓢虫的方法。

本发明的第七个目的是提供一种防治茄二十八星瓢虫的产品。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明发现了茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因，并开发了饲喂FTZ-F1基因的dsRNA(dsFTZ-F1)防治茄二十八星瓢虫的技术。本发明把茄子叶片分别浸泡在dsFTZ-F1和dsGFP的溶液中，取出晾干后饲喂茄二十八星瓢虫的刚孵化的1龄幼虫2天，而后以未用dsRNA处理的茄子叶片饲喂，观察记录茄二十八星瓢虫的死亡率和发育状态；另外，为了测定dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫化蛹的影响，用含有100ng dsFTZ-F1的溶液饲喂新蜕皮的4龄幼虫，观察其化蛹状况，进而全面的评价外源dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫的杀虫活性。最后，利用荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测分析了FTZ-F1基因在取食了dsFTZ-F1和dsGFP茄二十八星瓢虫中的表达量变化。结果显示，饲喂dsFTZ-F1的1龄幼虫大部分蜕皮失败而死亡，4龄幼虫全部化蛹失败而死亡，经dsFTZ-F1处理后的幼虫FTZ-F1的基因表达量显著下降。这说明直接饲喂外源dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫具有很显著的高致死作用。

因此，以下本发明要求保护以下内容：

一种茄二十八星瓢虫的FTZ-F1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因的dsRNA，所述dsRNA的其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在预防二十八星瓢虫害和/或制备防治茄二十八星瓢虫害的产品中的应用。

所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在抑制茄二十八星瓢虫生长和/或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。

所述FTZ-F1基因和/或其表达抑制剂任一在促进茄二十八星瓢虫死亡和/或制备促进茄二十八星瓢虫死亡的产品中的应用。

优选地，所述表达抑制剂为dsRNA。

更优选地，所述dsRNA为SEQ ID NO.2所示的dsRNA。

一种防治茄二十八星瓢虫的方法，饲喂外源dsRNA，该dsRNA可沉默/抑制所述FTZ-F1基因的表达。

优选地，所述dsRNA为SEQ ID NO.2所示的dsRNA。

一种防治茄二十八星瓢虫的产品，含有所述FTZ-F1基因的表达抑制剂。

优选地，所述表达抑制剂为dsRNA。

更优选地，所述dsRNA为SEQ ID NO.2所示的dsRNA。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明得到一种茄二十八星瓢虫的FTZ-F1基因，该基因对茄二十八星瓢虫的蜕皮和化蛹有重要作用，直接饲喂dsFTZ-F1最终导致茄二十八星瓢虫死亡。该方法特异性高、操作方便、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

附图说明

图1为不同浓度的dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫1龄幼虫死亡率的影响。利用实验开始后10天的幼虫死亡率数据，用Cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。

图2为1龄幼虫饲喂dsRNA开始的第3天，正常发育的dsGFP对照组(B)和死亡的dsFTZ-F1处理组(A)茄二十八星瓢虫表型差异。

图3为1龄幼虫取食dsFTZ-F1和dsGFP后的第2天，茄二十八星瓢虫中FTZ-F1基因表达量的变化。

图4为取食100ng dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫4龄幼虫存活率的影响。

图5为4龄幼虫饲喂dsRNA开始的第7天，正常化蛹的dsGFP对照组(A)和死亡的dsFTZ-F1处理组(B)茄二十八星瓢虫表型差异。

图6为4龄幼虫取食dsFTZ-F1和dsGFP后的第2天和第4天，茄二十八星瓢虫中FTZ-F1基因表达量的变化。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下述实施例中所用茄二十八星瓢虫，2019年6月采自华南农业大学校园内的龙葵上，而后用茄子叶片饲养在培养箱中(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14：10)。

RNA提取利用TRIzol提取法(Invitrogen,USA)，反转录试剂(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)购自TAKARA生物技术有限公司，dsRNA合成试剂盒(MEGAscript^TM T7)购自Thermo Fisher Scientific，PCR反应体系所用试剂盒(2×Easy Taq pcr Super Mix)购自北京全式金生物技术有限公司，DNA纯化回收试剂盒(SteadyPure DNA)购自TAKARA生物技术有限公司。

以下实施例的数据处理方法：使用Excel 2019对茄二十八星瓢虫的存活率进行统计，利用SPSS 19.0软件采用Cox回归分析作图，不同浓度间的差异性分析采用单因素方差分析。对RNA干扰后靶标基因表达量变化的分析，RT-qPCR数据采用法(Ct表示循环数)进行计算。应用SPSS 19.0软件采用单因素方差分析进行数据分析。

实施例1生长发育相关基因FTZ-F1 dsRNA的获得

根据之前的转录组测序得到了FTZ-F1基因，其基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步合成基因FTZ-F1的dsRNA(dsFTZ-F1)，其序列如SEQ ID NO.2所示。

一、实验方法

1、茄二十八星瓢虫总RNA提取及cDNA第一链的合成。

取茄二十八星瓢虫的2龄幼虫10只于2mL离心管中，利用TRIzol法提取总RNA，用NanoDropOne^C测定RNA的浓度，利用反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser,TAKARA)合成cDNA第一链。

2、引物设计

根据得到的FTZ-F1的基因序列(SEQ ID NO.1)，设计FTZ-F1基因的dsRNA引物P1(表1)，绿色荧光蛋白基因(GFP)从实验室保存的含有GFP的质粒上扩增获得，GFP基因的dsRNA引物P2(表1)。设计FTZ-F1基因的RT-qPCR引物P3，内参基因RPS18的RT-qPCR引物P4(表1)。

表1：dsRNA合成及qPCR引物

3、试剂盒合成FTZ-F1基因和GFP基因的dsRNAs

利用表1中的引物P1和P2进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为2×Easy Taq PCR Super Mix 25μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA/GFP质粒1μL、dd H2O补齐至50μL。PCR扩增的反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。将扩增产物置于-20℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳法对扩增结果进行检测。

用DNA纯化回收试剂盒(SteadyPure DNA,TAKARA)回收纯化上述得到的两种PCR产物，作为体外转录dsRNA的模版，dsRNA的体外转录体系为10x Reaction Buffer 5μL、(ATP、GTP、CTP、UTP)溶液各5μL、Enzyme mix 5μL、模版20μL，ddH2O补足至50μL。37℃放置4h。反应结束后加入2.5μL的TURBO DNase去除残留的模版DNA，然后纯化dsRNA，最后用50μL ddH2O溶解dsRNA，分别得到纯化的dsFTZ-F1和dsGFP，用琼脂糖凝胶电泳验证dsRNA的条带。

二、实验结果

用P1引物扩增得到大小为399bp的PCR扩增产物，经测序并删去T7启动子序列后，得到大小为359bp的核苷酸序列即为目的基因FTZ-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。以载有GFP的质粒为模版，用P2引物进行扩增，得到大小为507bp的PCR产物dsGFP。dsGFP和dsFTZ-F1的目的条带与测序结果相符。

实施例2 dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫的抑制作用

1、dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫1龄幼虫的致死作用

茄二十八星瓢虫dsFTZ-F1喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。分别用浓度100ng/μL、50ng/μL、5ng/μL的ds FTZ-F1(实施例1制备的)溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，室温风干20min后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsFTZ-F1浸泡的叶盘2天后，用正常茄子叶片饲喂幼虫。

茄二十八星瓢虫dsGFP喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。用试剂盒合成的浓度100ng/μL的dsGFP(实施例1制备的)溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，风干20min后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsGFP浸泡的叶盘2天后，用正常茄子叶片饲喂幼虫。

每组设置5个重复，每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算dsGFP对照组和不同浓度dsFTZ-F1处理下茄二十八星瓢虫的存活率变化。

2、dsFTZ-F1对茄二十八星瓢虫4龄幼虫的致死作用

茄二十八星瓢虫dsFTZ-F1喂养组：在培养皿中放入一只经4小时饥饿处理的4龄幼虫，滴入1μL 100ng/μL dsFTZ-F1(实施例1制备的)溶液，待幼虫完全消耗dsRNA溶液，放入新鲜的茄子叶片和加湿棉球，一共设置10组实验，每组设置3个重复。

茄二十八星瓢虫dsGFP喂养组：在培养皿中放入一只经4小时饥饿处理的4龄幼虫，滴入1μL 100ng/μL dsGFP(实施例1制备的)溶液，待幼虫完全消耗dsRNA溶液，放入新鲜的茄子叶片和加湿棉球，一共设置10组实验，每组设置3个重复。

每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算对照和不同处理组茄二十八星瓢虫存活率的变化。

二、实验结果

根据统计的结果可知，连续饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫dsFTZ-F1两天后，茄二十八星瓢虫1龄幼虫的存活率随着dsFTZ-F1浓度的增加而呈现下降的趋势(图1)，处理组的饲喂浓度分别是5ng/μL、50ng/μL和100ng/μL，对照组的饲喂浓度为100ng/μL。根据图1的结果，发现不同浓度的处理组之间和对照组之间均存在显著性差异(χ2＝78.919,df＝3,p<0.0001)。处理组50ng/μL(p<0.0001,Exp(B)＝0.429)与5ng/μL(p<0.0001,Exp(B)＝0.027)和100ng/μL(p<0.0001,Exp(B)＝0.702)没有显著性的差异；5ng/μL(p<0.0001,Exp(B)＝0.027)和100ng/μL(p<0.0001,Exp(B)＝0.702)之间有显著性的差异。从统计的结果中可以得到以下结论，当处理组的浓度分别为5ng/μL、50ng/μL和100ng/μL时，与对照组相比死亡率分别增加16.25倍、21倍和23倍。

与饲喂dsGFP相比，饲喂dsFTZ-F1后，茄二十八星瓢虫的表型特征发生了显著的变化。发现1龄幼虫从饲喂dsRNA开始的第3天，dsGFP对照组的茄二十八星瓢虫正常进入2龄阶段，而dsFTZ-F1处理组中的幼虫无法正常蜕皮而死亡，表型特征如图2所示。

另外，4龄幼虫在饲喂dsFTZ-F1后的第7天，dsGFP对照组的茄二十八星瓢虫正常进入蛹期，处理组中的幼虫逐渐发黑、无法正常化蛹而全部死亡(图4，图5)。说明取食dsFTZ-F1能够在茄二十八星瓢虫的体内引发强烈的RNAi效应，导致瓢虫幼虫死亡。

实施例3 dsFTZ-F1抑制茄二十八星瓢虫体内FTZ-F1基因的表达

一、实验方法

分别收集5ng/μL dsFTZ-F1和dsGFP处理第2天的茄二十八星瓢虫1龄幼虫和100ng dsFTZ-F1和dsGFP处理后第2天和第4天的茄二十八星瓢虫4龄幼虫，每个处理收集3个生物学重复。提取茄二十八星瓢虫的RNA，反转录成cDNA，稀释10倍作为RT-qPCR的模版。以P3和P4作为引物进行RT-qPCR分析。RT-qPCR体系为(15μL)包含5.25μL的ddH2O，7.5μL的2×SYBR Green Master Mix(BIO-RAD Inc,Hercules,CA)，4μM引物和1.0μL的cDNA第一链模版。反应条件为95℃5min；95℃10s，60℃30s，39个循环，每个样本3个技术重复。

2、实验结果

以饲喂dsGFP为对照，分别分析饲喂dsFTZ-F1后，茄二十八星瓢虫1龄和4龄幼虫中FTZ-F1基因的相对表达量变化(如图3、6所示)。从图3和图6中可以看出，相比饲喂dsGFP的茄二十八星瓢虫体内FTZ-F1的表达量，饲喂dsFTZ-F1的茄二十八星瓢虫体内FTZ-F1的表达量呈明显下降的趋势。1龄幼虫从饲喂dsFTZ-F1开始的第2天，FTZ-F1基因的表达量与对照组相比下降了2.42倍(F1,4＝70.743,p<0.0001)；4龄幼虫从饲喂dsFTZ-F1开始的第2天和第4天，FTZ-F1基因的表达量与对照组相比分别下降了4.23倍(F1,4＝527.282,p<0.0001)和3.34(F1,4＝294.139,p<0.0001)，进一步说明了通过饲喂dsFTZ-F1能够在茄二十八星瓢虫体内引起强烈的RNAi效应，导致体内FTZ-F1基因的表达量明显降低，1龄幼虫无法蜕皮，4龄幼虫无法成功化蛹，进而导致茄二十八星瓢虫的死亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在未背离本发明的精神实质与原理下，都可以做出变动、修饰、替代、组合等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 茄二十八星瓢虫FTZ-F1基因及其在防治茄二十八星瓢虫中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2142

<212> DNA

<213> Henosepilachna vigintioctopunctata

<400> 1

gacctggttc attggaaagt aggtcactag tcccgactca ctttcacttg ttacatggac 60

tcctaatcat tttccattgt ggtcctgtgc cggctgcacg ggttttcgac tgtaccgctc 120

gctgctggtc agttcagttt gcgatctcag gcaagtcgga ggtgtgactg tcgatttcat 180

ttgttctagt cgagtgcgtg agtgtgcccc acattctgga ttataactct cttttggttt 240

cgttggatta ttgcgccaac tggatgtaac tgtgctgtgg ttgtgttcgc taggatttaa 300

catgacggtc aggtagtgca ggctgactat aaaattttgt tgtgactatc gtgtgaaatg 360

ttactcgaca tggagaatca ttctacgtta ttgtctctca acatgtcttc attcagcgcg 420

aattcgggcg attccccgat ggctaatcag gcctccagcc cccaatacgg ctcgcctcca 480

atttccgtcc cttacagtag ttgccagcaa accatgagca tgcagcacca tcatcagcag 540

tcgatgatga tgtcccagtc catgaataac cttgacacgt cctatttgtt ttccccagga 600

gccaacacgc tgaccggcat cgacatgggg gccagttacc aaattaccgg acctacgact 660

tccctggccg gttccgggga tggttcggat acgaaggatg gcatcgagga attgtgtcct 720

gtttgcgggg ataaagtatc gggataccat tacggacttc tcacctgtga gtcctgcaaa 780

ggatttttca aacgaaccgt tcaaaataaa aaagtataca cgtgtgtggc agaaaggagt 840

tgtcacattg acaagactca aaggaaaagg tgcccgtttt gtaggttcca gaaatgcctg 900

gaagtcggga tgaaactgga agccgttcga gcagatcgga tgagaggcgg tcgaaataaa 960

ttcgggccca tgtacaagag agacagagcg aggaagctgc agataatgcg acaacggcaa 1020

ctggctgtgc aaacccttcg cggagctggc ctcggcggag acatctacag caatcagccg 1080

ggcacgtctc ccttcgccaa catccacatc aaacaggaaa tccaaatccc ccaggtgtcg 1140

tccctcactt cgtccccgga ctcctcgccc agtcctatcg ccgtcgcgct gggtcaagtg 1200

aactcagctc tggtgcaacc ggcgtccaat cagcaaccag ctttgcagat cgtcggcgtc 1260

caaggaggtg gcgggcacac ttccatggtc ctgggacccg acaataaact ctggggtcag 1320

gcgaactcca ccacgacatc acctcattct cttagtccga aagtgttcca attcgaaagt 1380

gtagttcaag gtagcggcgt accttcgaat aaagtatcgc cgatgattcg agacttcgtt 1440

caagccatag acgatcggga atggcagaac tcgttatata cgttgttaca gaatcagacg 1500

tacaatcagt gtgaagtgga cctcttcgaa cttatgtgta aagtgttgga ccaaaatctc 1560

ttttctcaag tggattgggc gaggaattcg atattcttca aagatctcaa ggtggatgac 1620

caaatgaagc ttctccagca ctcatggtcg gacatgttag ttttggacca tatgcaccag 1680

cgaatgcata ataacttacc tgacgaaacc acccttcata atggtcagaa atttgatctg 1740

ctgagtttgg ggttgctagg agttcccagt cttgctgatc atttcaatga catcactact 1800

aagttgctag aattgaaatt cgatgttagc gattacattt gtactaaatt cttgttactt 1860

ctcaatcccg atgtccgggg catcacaaat agaaagcatg tagaagaagg ctatgaacag 1920

gtccaacagg ctctactcga atatgcaata acctgctttc cacaaattcc ggacaaattc 1980

aacaagatgc aacaactcct tccagagatt catagccttg cagcgcgagg cgaagaacac 2040

ctctaccaca agcactgcaa cagtggcgtt tctacgcaaa ccctcctcat ggagatgctg 2100

cacgccaaga ggaaataaca gccgtcctca caatcctcac gt 2142

<210> 2

<211> 359

<212> DNA

<213> Henosepilachna vigintioctopunctata

<400> 2

ggccagaaat ttgacctact tagtctaggt cttttaggag ttccttcatt ggccgatcat 60

tttaacgaca taacgtctaa actgcaagag ttgaaatttg atataagtga ctatatttgc 120

atcaagttca tgctgcttct caatccagtt ttcacaattc cagatattcg aggaatcact 180

aacaggaagc acgtgcagga aggttatgaa caggtgcagc aagctcttct tgaatataca 240

gttacatgct atccccaaat tcaggataaa tttaacaaaa tgcttcaact gttaccagaa 300

atacactcat tggcagcaag gggtgaagaa catctataca ttaagcattg tagtggtgg 359