一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法与流程

本发明涉及一种农杆菌介导转化体系，特别是一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法。

背景技术：

赣香B是本研究室利用03B、IR58025B、金23B、新露B、江农早2号B等5个来源不同水稻保持系经过复合杂交，育成的一个三系保持系。其茎秆粗壮，个体优势较强，主茎叶片数12-13,；成熟期功能叶生长旺盛，不易早衰，落色好；株型紧散适中，叶下禾，分蘖能力较强，根系发达，剑叶直立，大穗大粒，着粒较密，穗长约22 cm，平均每穗粒数150粒，千粒重28-29g,不易落粒，长宽比3.3，有香味；柱头外露率较高，直链淀粉含量较高。

初步检测到Pib、Pikm、Pi33、Pi5抗稻瘟基因，分别分布在第2、8、9、11号染色体上。检测到有磷高效基因Pup1的功能标记。具早熟显性，适宜配籼粳交组合，制种产量高。已有15个组合19次分别在在福建、海南、云南、四川、重庆、贵州、浙江和江西等多个省市通过省级审定：赣优明占（琼审稻2010012、闽审稻2011004、滇审稻2012017 、渝审稻2014004 ）、赣优607（渝审稻2012007）、赣香优702（川审稻2013017）、赣优5359（黔审稻2013003）、赣优810（闽审稻2014008、绿超稻201914 ）、赣香优510 （川审稻2014018）、赣优671（闽审稻2015003）、赣优673（闽审稻2015010）、赣优9141（浙审稻2015008）、赣优676（闽审稻2016003 ）、赣优157（琼审稻2016006）、赣香优858（赣审稻20170027 ）、赣香优993（赣审稻20170024）、赣优7076（滇审稻2017009）、赣优9812（琼审稻2017003，粤审稻20180025）。

我们先后通过构建赣香B近等基因导入系；构建成以保持系赣香B为轮回亲本，东乡野生稻为供体亲本的渗入系群体BC2F8共180个株系，通过大田低温筛选获得两个耐冷株系，后续通过对赣香B和耐冷株系在常温和低温下进行表达谱差异测序，分析比较他们之间的差异，找到相关的冷胁迫基因，了解其耐冷的分子调控机理。

为了验证筛选到的冷胁迫基因的生物学功能，我们构建了这些基因的超量表达载体，然后转入籼稻赣香B 胚性愈伤组织中。众所周知，大部分籼稻的转化效率极低，为了能够更好的研究赣香B中相关基因的生物学功能，对于高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的研究很有必要。因品种不同利用农杆菌进行不同植物遗传转化时，其具体的实施条件和方法也不尽相同。目前尚未有高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系。

技术实现要素：

本发明的目的是要提供一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法，通过诱导培养赣香B的愈伤组织，以根癌农杆菌为介导，通过优化农杆菌转化时的菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养条件等影响因素，建立了赣香B农杆菌介导转化体系，从而获得赣香B转基因植株。为以后研究赣香B中的功能基因提供有力技术支持。

本发明的目的是这样实现的：

一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法，包括受体材料的准备、转化载体的构建、农杆菌供体菌株培养、农杆菌侵染、抗性愈伤组织的筛选、分化培养基及抗性植株的检测等步骤，其特征在于：

（1）受体材料采用赣香B的种子作为外植体诱导愈伤组织，并经过诱导和继代培养获得胚性愈伤；

（2）通过PCR扩增和酶切方法，将目的基因连接到表达载体pCUbi1390，转入大肠杆菌DH5a体内，提取质粒，然后通过电激转化农杆菌EHA105；

（3）活化农杆菌菌液浓度至OD600=1.0，侵染愈伤组织时，等体积MS重悬农杆菌菌液浓度至OD600=0.3，MS重悬液中含有乙酰丁香酮浓度为150uM；

（4）将重悬后的农杆菌细胞浸入水稻愈伤组织，在调至50 rpm的摇床上缓和培养20-25 min，用灭菌滤纸吸干愈伤组织上的多余菌液。之后将这些愈伤组织转入共培养基上，在27±1℃黑暗条件下共培养48 h。一旦愈伤组织出现了少量农杆菌，用加入了250 mg/l头孢噻肟无菌水清洗8-10次，过滤后再次用无菌水滤纸充分吸干；

（5）灭菌滤纸吸干后转移到筛选培养基中，27±1℃黑暗培养12天。经过第一轮筛选培养后，挑选正常的愈伤组织转移到新的筛选培养基上进行第二轮培养。经过10天的第二轮筛选培养，挑选新长出来的微小愈伤转移到新的筛选培养基上进行第三轮筛选，在27±1℃黑暗培养5天；

（6）将第三轮筛选培养基中长出颗粒状的微小愈伤转移到分化培养基上，在27±1℃黑暗条件下培养7天；之后将愈伤转移至新的分化培养基上，在27±1℃光照条件下培养4天，最后转移分化出来的幼苗到生根培养基上，待幼苗生长茁壮根系较发达时进行移栽炼苗；

（7）提取每个植株的总DNA，采用PCR方法扩增检测植株内的潮霉素磷酸转移酶基因；如果电泳能够检测出目的条带，表明外源基因整合到受体细胞的染色体中。

进一步的,赣香B胚性愈伤通过以下方法诱导获得：取赣香B成熟种子，先用70%乙醇浸泡1 min,随后用50% 次氯酸钠处理30 min，在调至180 rpm的摇床上摇晃，用无菌水冲洗8-10次，最后将冲洗好的种子放到灭菌滤纸上晾干5 min。在诱导培养基的培养皿中放入种子，放入27±1℃环境黑暗培；经过14天的黑暗诱导，挑选胚性愈伤组织放入新的诱导培养基中27±1℃环境黑暗继代培养4天。

进一步的，所述诱导培养基为MS培养基，其中加入了6-BA2 .0mg/L、NAA 0 .3mg/L、蔗糖30g/L、植物凝胶0 .4g/L。

本发明通过构建赣香B的农杆菌介导转化体系成功获得了赣香B转基因植株，而且转化效率高达16.4%，比一般籼稻品种的转化效率提高近1倍。最重要的是为以后研究赣香B中相关功能基因提供了有力的技术支持。

附图说明

图1是本发明的赣香B诱导愈伤组织结构图；

图2是本发明的赣香B转化后抗性愈伤组织图；

图3是本发明的赣香B分化培养基上再生的抗性苗图；

图4是本发明的赣香B转基因苗田间种植图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

本发明包括一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法，主要通过采用赣香B的成熟种子作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有潮霉素抗性的pCUbi1390质粒导入赣香B愈伤组织，经抗性愈伤组织筛选及分化培养获得赣香B的无菌苗，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，获得赣香B转基因植株。

一种高效获得籼稻赣香B转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法，包括受体材料的准备、转化载体的构建、农杆菌供体菌株培养、农杆菌侵染、抗性愈伤组织的筛选、分化培养基及抗性植株的检测，包括以下步骤：

（1）受体材料采用赣香B的种子作为外植体诱导愈伤组织，并经过诱导和继代培养获得胚性愈伤；

（2）通过PCR扩增和酶切方法，将目的基因连接到表达载体pCUbi1390，转入大肠杆菌DH5a体内，提取质粒，然后通过电激转化农杆菌EHA105；

（3）活化农杆菌菌液浓度至OD600=1.0，侵染愈伤组织时，等体积MS重悬农杆菌菌液浓度至OD600=0.3，MS重悬液中含有乙酰丁香酮浓度为150uM；

（4）将重悬后的农杆菌细胞浸入水稻愈伤组织，在调至50 rpm的摇床上缓和培养20-25 min，用灭菌滤纸吸干愈伤组织上的多余菌液。之后将这些愈伤组织转入共培养基上，在27±1℃黑暗条件下共培养48 h。一旦愈伤组织出现了少量农杆菌，用加入了250 mg/l头孢噻肟无菌水清洗8-10次，过滤后再次用无菌水滤纸充分吸干；

（5）灭菌滤纸吸干后转移到筛选培养基中，27±1℃黑暗培养12天。经过第一轮筛选培养后，挑选正常的愈伤组织转移到新的筛选培养基上进行第二轮培养。经过10天的第二轮筛选培养，挑选新长出来的微小愈伤转移到新的筛选培养基上进行第三轮筛选，在27±1℃黑暗培养5天；

（6）将第三轮筛选培养基中长出颗粒状的微小愈伤转移到分化培养基上，在27±1℃黑暗条件下培养7天；之后将愈伤转移至新的分化培养基上，在27±1℃光照条件下培养4天，最后转移分化出来的幼苗到生根培养基上，待幼苗生长茁壮根系较发达时进行移栽炼苗；

（7）提取每个植株的总DNA，采用PCR方法扩增检测植株内的潮霉素磷酸转移酶基因；如果电泳能够检测出目的条带，表明外源基因整合到受体细胞的染色体中。

实施例：

1.赣香B胚性愈伤组织的诱导；

取赣香B成熟种子，进行人工脱壳及消毒，程序如下：先用70%乙醇浸泡1 min,随后用50% 次氯酸钠处理30 min，在调至180 rpm的摇床上摇晃。用无菌水冲洗8-10次，最后将冲洗好的种子放到灭菌滤纸上晾干5 min。每个倒有诱导培养基（MS+6-BA 2 .0mg/L+NAA 0 .3mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶0 .4g/L）的培养皿中放入12-13粒种子，放入27±1℃环境黑暗培养。经过14天的黑暗诱导，挑选胚性愈伤组织，将其平均分成3等份放入新的诱导培养基中27±1℃环境黑暗继代培养4天。

2. pCUbi1390质粒导入赣香B愈伤组织

以越光材料提取的cDNA为模板，用Os05g15770FKpnI 5’-GGGGTACCATGGCGTCCCGACGCCTTG-3’ 和Os05g15770RSpeI 5’-GACTAGTTCACAGAACCTGATCCAGGAGACC-3’引物及KODFX酶（Takara）PCR扩增获得OsHI-XIPCDS序列。用KpnI和SpeI酶切PCR纯化产物及pCUbi1390表达载体，然后通过DNA连接酶进行连接，转入大肠杆菌DH5a体内，通过筛选克隆、酶切检测以及测序分析获得正确的OsHI-XIP超表达载体，电激转化农杆菌EHA105，最后将带有目的质粒的农杆菌EHA105与愈伤组织共培养。

3.农杆菌介导的转化体系建立

从固体划线平板上挑取农杆菌EHA105单克隆菌株，放入装有5 ml YEB液体培养基的50 ml离心管中。将该离心管放入设置200 rpm的摇床上28℃暗培养20-24 h，之后将离心管中的培养液转入加有100 ml YEB的500 ml三角瓶中，在相同培养条件下培养。当O.D.600到达1.0时，将农杆菌细胞在4℃条件下8000 x g离心15 min富集，最后用悬浮培养基将农杆菌细胞重悬。将重悬后的农杆菌细胞浸入水稻愈伤组织，在调至50 rpm的摇床上缓和培养20-25 min，用灭菌滤纸吸干愈伤组织上的多余菌液。之后将这些愈伤组织转入共培养基上，在27±1℃黑暗条件下共培养48 h。一旦愈伤组织出现了少量农杆菌，用加入了适当浓度的头孢噻肟无菌水清洗8-10次，灭菌滤纸吸干后转移到筛选培养基中，27±1℃黑暗培养12天。经过第一轮筛选培养后，挑选正常的愈伤组织转移到新的筛选培养基上进行第二轮培养。经过10天的第二轮筛选培养，挑选新长出来的微小愈伤转移到新的筛选培养基上进行第三轮筛选，在27±1℃黑暗培养5天。将第三轮筛选培养基中长出颗粒状的微小愈伤转移到分化培养基上，在27±1℃黑暗条件下培养7天；之后将愈伤转移至新的分化培养基上，在27±1℃光照条件下培养4天。最后转移分化出来的幼苗到生根培养基上，待幼苗生长茁壮根系较发达时进行移栽炼苗。

4.转基因植株的检测

剪取植株幼嫩叶片，参考王关林等的CTAB法提取DNA，采用PCR方法扩增检测植株内的潮霉素（HPT）基因。引物：hpt557-F 5’-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3’，hpt557-R 5’-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’。反应体系（10ul体系）：DNA模板30-50 ng，1.1×T3 Super PCR Mix 9.1 μl，10 μM引物各0.2 μL。反应条件：98℃ 2 min，98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，32 Cycles，72℃ 2 min，25℃ 1 min。