本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用。
背景技术：
根结线虫是一种杂食性植物病原线虫，主要侵染作物根系,使根部肿大、畸形、呈鸡爪状,根组织变黑腐烂,也有的根上产生球状根结,侵染后植株表现为缺水症状，中午萎蔫，早晚初期尚能恢复，到后期植株不能正常生长，甚至死亡。根结线虫是我国粮食、蔬菜、经济作物的重大病原物之一，目前根结线虫成为了北方保护地蔬菜毁灭性病害，也是南方露地栽培果蔬的主要病害。根结线虫通常没有明显的专性寄主，能够侵染的植物超过2000种。全国各种根结线虫发生面积超过2000万亩，受害最严重的有烟草、香蕉及蔬菜类的茄科(如番茄、茄子、辣椒)、葫芦科(如各种瓜类)等作物。给作物生产带来巨大经济损失。特别是烟草，我国是烟草种植和消费大国，也是最重要的经济植物之一，烟草根结线虫在四川、重庆、河南、云南、广西、湖南、湖北及山东等地发生严重，且有继续加重的趋势。
长期以来，烟草等作物的根结线虫防治一般以阿维菌素、噻唑磷等农药为主，但使用阿维菌素、噻唑磷等一般都会对烟草的根系造成一定的损伤，且效果不理想；微生物农药防治根结线虫，可有效减轻线虫的发生，且可抑制线虫携带的病菌，改善根部微生态环境，刺激作物生长；在微生物防治逐渐成为植物病害防治研究热点的今天，研究开发和利用微生物农药来防治烟草等作物的根结线虫病害无疑是最佳出路。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种坚强芽孢杆菌菌剂，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种坚强芽孢杆菌菌剂，每克所述菌剂含有1×1010～12芽孢杆菌活孢子；
所述坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.1.2010。
坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)的形态学和生理性质特征为：菌体细胞杆状，革兰氏染色阳性，两端钝圆，无荚膜，周生鞭毛，芽孢卵圆形，近中生，孢囊无明显膨大。NA培养基35℃培养24h，菌落直径1～2mm，挑起有粘丝，菌落为微黄白色，圆形或近圆形，中间环状，不透明，表面褶皱，稍有光泽；培养48h后，菌落呈中间心环状凸起，呈火山口状。常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7％的NaCl中生长，pH5.7生长。
坚强芽孢杆菌能产生芽孢，具有极强的抗逆性,可以用于防治烟草、香蕉和番茄等作物的根结线虫病，且对人畜安全、环境相容性好、有害生物不易产生抗药性、无污染、微毒无残留。
可选的，所述菌剂的剂型为可湿性粉剂。
如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将预先制备好的坚强芽孢杆菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵，将得到的发酵液经浓缩、干燥并制剂得到所述坚强芽孢杆菌菌剂。
可选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述发酵培养基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化钙3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡剂1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。
可选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述坚强芽孢杆菌种子液的制备方法包括：
A)、在固体营养琼脂培养基上划线接种坚强芽孢杆菌，30℃～37℃培养72h～120h得到菌种Ⅰ；
B)、取菌种Ⅰ的单菌落接入固体的营养培养基中，30℃～37℃培养72h～120h得到菌种Ⅱ；
C)、用无水冲洗菌种Ⅱ，按照0.05％～0.5％的体积比向液体的营养培养基中接入菌种Ⅱ孢子悬浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培养18h～30h，得到坚强芽孢杆菌种子液；
可选的，所述营养培养基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化钠5±1g/L，pH＝7.1～7.5。
可选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述坚强芽孢杆菌种子液接种量占所述发酵培养基体积的0.05％～1％；
发酵条件为发酵温度30℃～35℃，通气比为(05.～1)：1，转速150～200r/min，发酵40～48小时。
如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂在防治根结线虫中的应用。
可选的，如上所述的应用，所述坚强芽孢杆菌菌剂与其他药剂混合使用；
所述药剂包括微生物菌剂和/或杀线药剂。
可选的，所述其他微生物菌剂的主要成分包括厚孢轮枝菌、淡紫拟青霉、枯草孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌。
可选的，所述杀线药剂包括阿维菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、灭线磷。
可选的，如上所述的应用，所述根结线虫的宿主包括烟草、香蕉、番茄、苹果、梨、山楂、柑桔、枣、茄子、辣椒、黄瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫芦、大豆、玉米、花生。
可选的，如上所述的应用，当所述宿主为烟草时，施用坚强芽孢杆菌菌剂的方法为穴施；
可选的，所述穴施在烟草移栽时进行。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用。
每克所述菌剂含有1×1010～12芽孢杆菌活孢子；
所述坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.1.2010。
优选的，所述菌剂的剂型为可湿性粉剂。
可湿性粉剂是我国目前农用微生物杀菌剂的主要剂型。优选的，本发明提供的菌剂还可制备成粉剂、水分散粒剂、悬浮剂和颗粒剂等剂型进行使用。
如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将预先制备好的坚强芽孢杆菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵，将得到的发酵液经浓缩、干燥并经气流粉碎得到所述坚强芽孢杆菌菌剂。
优选的，所述浓缩为选用陶瓷膜过滤浓缩；
进一步优选的，所述陶瓷膜孔径为0.01μm～0.1μm，。
优选的，所述干燥为离心式喷雾干燥，进风温度120℃～220℃，出风温度60℃～90℃；
优选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述发酵培养基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化钙3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡剂1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。
优选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述坚强芽孢杆菌种子液的制备方法包括：
A)、在固体的营养培养基上划线接种坚强芽孢杆菌，30℃～37℃培养72h～120h得到菌种Ⅰ；
B)、取菌种Ⅰ的单菌落接入固体的营养培养基中，30℃～37℃培养72h～120h得到菌种Ⅱ；
C)、用无菌水冲洗菌种Ⅱ，按照0.05％～0.5％的体积比向液体的营养培养基中接入菌种Ⅱ孢子悬浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培养18h～30h，得到坚强芽孢杆菌种子液；
其中，所述菌种Ⅱ能在4℃以下保存三个月。
优选的，所述营养培养基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化钠5±1g/L，pH＝7.1～7.5。
进一步优选的，所述固体的营养培养基中还需要加入15±3g/L的琼脂。
优选的，所述坚强芽孢杆菌种子液中孢子数为(0.3～0.9)×109个。
优选的，如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述坚强芽孢杆菌种子液接种量占所述发酵培养基体积的0.05％～1％；
发酵条件为发酵温度30℃～36℃，通气比为(0.5～1)：1，转速150～200r/min，发酵40～48小时。
如上所述的坚强芽孢杆菌菌剂在防治根结线虫中的应用。
本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的菌剂还可以与常见的其他微生物菌剂和/或杀线药剂混合使用。
优选的，所述其他微生物菌剂的主要成分包括厚孢轮枝菌、淡紫拟青霉、枯草孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌。
优选的，所述杀线药剂包括阿维菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、灭线磷。
优选的，如上所述的应用，所述根结线虫的宿主包括烟草、香蕉、番茄、苹果、梨、山楂、柑桔、枣、茄子、辣椒、黄瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫芦、大豆、玉米、花生。
优选的，如上所述的应用，当所述宿主为烟草时，施用坚强芽孢杆菌菌剂的方法为穴施；
除穴施外，还可采用沟施、撒施。
优选的，所述穴施在烟草移栽时进行。
进一步优选的，将1×1010活芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂与干细土按1：100混匀做成备用药粉，每株烟草用药粉40～60克。
实施例1
1.1、坚强芽孢杆菌种子液的获得
1.1.1、坚强芽孢杆菌菌种活化：用接种环挑取三环坚强芽孢杆菌冻干菌种于250ml三角瓶中，采用固体的营养培养基，35℃培养18h。
1.1.2、划线法固体平板培养
在固体的营养培养基平板上35℃培养100h，长出单菌落。
1.1.3、试管斜面培养：固体的营养培养基试管斜面，挑取上述单菌落接于试管斜面，35℃培养100h，直到孢子散落。
从上述试管斜面中选用较好的菌种，用无菌水将试管斜面种子冲洗，接于装有液体的营养培养基的750mL三角瓶中，于35℃、摇床转速200r/min培养24h，菌体含量达到0.6×109个/mL左右时，即可作为种子液。
上述固体的营养培养基的配方为：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化钠5克，琼脂15克，蒸馏水1000ml，PH值7.3；
液体的营养培养基的配方为：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化钠5克，蒸馏水1000ml，PH值7.3。
1.2、坚强芽孢杆菌发酵液的制备
发酵培养基：按质量百分数计，含有酵母粉2.5％，玉米淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，氯化钙0.3％，豆粕粉1.0％，消泡剂0.14％，其余为水，调节PH 8.1～8.3。
50升全自动控制不锈钢发酵罐进行消毒：用蒸汽121℃消毒1小时。
向发酵罐装料：装料系数为0.6，加入酵母粉750g，玉米淀粉600g，葡萄糖300g，氯化钙90g，豆粕粉300g，消泡剂42g，用水配置，溶解后得到30L发酵培养基，通入蒸汽，于121℃消毒1.0小时，查无杂菌。
发酵最佳参数：发酵温度30℃～36℃，初始PH值为8.1～8.3，通气量为1︰1，搅拌转速200r/min，接种量为1％，发酵44小时，孢子量为2×109/mL时，即到终点，得26.5公斤的发酵液。
1.3、发酵液的浓缩：
将26.5kg的发酵液装入膜分离装置的料液槽，采用孔径为0.1μm的陶瓷膜，膜面积为0.25㎡，开启循环泵进行分离，循环3小时后得到7.0kg浓缩液。
1.4、浓缩液喷雾干燥：
采用脱水量为3kg/h的离心式喷雾干燥塔，进风温度140℃，出风温度70℃，将7.0kg坚强芽孢杆菌浓缩液进行喷雾干燥，经三小时得375g坚强芽孢杆菌母粉，经检测孢子量为1.2×1011活孢子/克的坚强芽孢杆菌母药。
实施例2
坚强芽孢杆菌对烟草根结线虫(Meloidogyne incongnita Chitwood)的室内活性测定
从发病比较严重的烟草根部挑取烟草根结线虫的虫瘿，放置于培养皿内的尼龙网膜上，加适量无菌水，置于(25±1)℃培养箱孵化培养，48h后收集二龄幼虫配制成线虫悬浮液，每1mL悬浮液中含有约200头的二龄幼虫，备用。
选用2.5×109活孢子/克厚孢轮枝菌(verticillium chlamydosporium)母药为对照药。生产厂家：云南陆良酶制剂有限责任公司。
将1×1011活孢子/克坚强芽孢杆菌母药和2.5×109活孢子/克厚孢轮枝菌母药分别用无菌水溶解，制成1.00×104mg/L浓度母液，备用。
根据预备实验的结果，将坚强芽孢杆菌母液稀释成200、100、50、25、12.5mg/L，厚孢轮枝菌母液稀释成200、100、50、25、12.5mg/L不同浓度试验药液待用。
采用直接触杀法进行测定。取24孔生化测试板，各取1mL供试药液置于小孔中，加入等体积的线虫悬浮液，空白对照加入等量的无菌水，置于(25±1℃)培养箱培养。
处理后24h调查试虫死亡情况(判断供试虫死亡标准是以显微镜下观察无自主反应)，每处理调查100头，记录总虫数和死虫数。
试验结果表明，坚强芽孢杆菌对烟草根结线虫的杀线活性明显高于厚孢轮枝菌的杀线活性。
表1坚强芽孢杆菌对烟草根结线虫的室内活性测定原始数据
实施例3
不同药剂防治烟草根结线虫田间药效试验
选用三种常用药剂:2.5×109活孢子/克厚孢轮枝菌微粒剂、3％阿维菌素微囊悬浮剂、10％噻唑磷颗粒剂与1×1010活芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草根结线虫病进行田间药效试验，试验结果表明，坚强芽孢杆菌(800克/亩)防效最高为84.87％，2.5×109活孢子/克厚孢轮枝菌微粒剂和3％阿维菌素微囊悬浮剂分别为75.57％和76.06％，10％噻唑磷颗粒剂最低为68.28％。田间药效试验原始数据见表2。
表2四种不同药剂防治烟草根结线虫田间药效试验结果
实施例4
坚强芽孢杆菌不同时期、不同方式用药对烟草根结线虫的防治效果试验
将1×1010活芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂与干细土按1：100混匀做成备用药粉(穴施、沟施、撒施，每株用药粉约50克)；
将1×1010活芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂按1:200对水混匀做成备用药液(灌根，每株用药液约100毫升)。
试验选在同一田块内，肥水相同，分6组处理：第一组移栽时穴施；第二组移栽时沟施；第三组移栽后撒施；第四组移栽后用药液作为定根水灌根；第五组移栽后20天灌根；第六组是对照组，不施药粉或药液；每组实验重复3次。然后在封顶、打顶后25天、采烤结束时分别观察其病珠情况，并记录。
实验结果如表3，试验表明，用1×1010活芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂防治烟草根结线虫，在烟草移栽时穴施效果最好。
表3各处理防效统计结果
注:表中各数据均为3次重复的平均值。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。