一株解淀粉芽胞杆菌植物亚种及其在马尾藻生物降解中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及了一种解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274及其在马尾藻生物降解中的应用。

背景技术：

马尾藻是一类常见的大型褐藻，属于褐藻门(Phaephyta)、马尾藻科(Sargassaceae)、马尾藻属(Sargassum)，大多数为暖水性种类，广泛分布于暖水和温水海域。马尾藻具有很高的经济价值，在农业、工业等方面都极具开发潜力，是重要的肥料、饲料和工业原料。马尾藻细胞壁主要由纤维素和褐藻胶构成，结构稳定，较难被破坏。降解马尾藻细胞壁中的纤维素和褐藻胶是高效降解并利用马尾藻的关键。工业上常采用机械粉碎和化学降解法对马尾藻进行降解，但存在着耗能高和废弃物污染环境等缺点。生物降解法是利用微生物所产生的纤维素酶和褐藻胶裂解酶来降解藻体中的纤维素和褐藻胶，从而达到降解藻体的目的，因其高效环保而备受关注。

芽胞杆菌是一类需氧或兼性厌氧细菌，能产生抗逆性内生孢子，是常用微生态制剂之一。芽胞杆菌能产生多种胞外酶，如褐藻胶裂解酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，可分解褐藻胶、纤维素、蛋白质和淀粉等多种有机物，从而得到广泛应用。本发明采用的解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274，分离自海南省东寨港红树林底泥，具有高效降解褐藻胶、淀粉和纤维素活性，能有效降解马尾藻藻体，在马尾藻加工利用方面具有良好的应用开发前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有降解褐藻胶、纤维素和淀粉的解淀粉芽胞杆菌植物亚种，该菌株能够有效降解褐藻胶、纤维素和淀粉，可以作为一种新的用于马尾藻生物降解的微生物资源。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所提供的具有降解褐藻胶、淀粉和纤维素活性的解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274，已于2016年5月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.12455。保存地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。所述芽胞杆菌HB12274属于 细菌域、厚壁菌门、芽胞杆菌纲、芽胞杆菌目、芽胞杆菌科、芽胞杆菌属。

本发明的解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274获得过程为：从海南省东寨港红树林采集底泥样品，样品经梯度稀释后采用80℃水浴处理20min以杀死非芽胞细菌，其后途布于细菌分离培养基平板。再对分离获得的芽胞杆菌进行产褐藻胶裂解酶、淀粉酶与纤维素酶活力测定，最终筛选出同时具备三种酶活性的芽胞杆菌植物亚种HB12274。

所述的芽胞杆菌HB12274具有以下生物学特性：菌株在麦芽汁营养琼脂培养基上划线培养3d后，菌落呈圆形、边缘不规则、表面无光泽、不平整、乳白色、不透明；菌体长杆状，产芽胞。革兰氏染色、VP测定、接触酶实验阳性，MR实验阴性，可还原硝酸盐，可水解淀粉、褐藻胶与纤维素，能使明胶液化。

芽胞杆菌HB12274的16S rDNA序列在GenBank的登录号为KU529689。经多相分类鉴定为Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum(解淀粉芽胞杆菌植物亚种)。该菌株易于生长，具有降解褐藻胶、淀粉与纤维素的能力，能有效降解马尾藻藻体，可开发成一种新型应用于马尾藻生物降解的微生物菌剂。

芽胞杆菌HB12274在马尾藻生物降解中的应用，包括如下步骤：

(1)菌株活化：将所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种HB12274接种于营养琼脂培养基，于37℃培养24～48h。培养基：蛋白胨8～10g/L，牛肉浸粉2～3g/L，琼脂粉18～20g/L，氯化钠5～35g/L，pH6.5～7.5。

(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于30～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠5～35g/L，pH6.5～7.5。

(3)发酵培养：将种子液按体积比2～10％接种于液体发酵培养基，30～37℃、150～200r/min振荡培养48～96h，即制得解淀粉芽孢杆菌植物亚种HB12274的液体菌剂。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠5～35g/L，pH6.5～7.5。

(4)将液体菌剂以5％～10％的接种量接种于装有马尾藻粉发酵培养基的锥形瓶中，于30～37℃、150～200r/min条件下摇床培养10～15d。培养基：马尾藻粉25～50g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠5～35g/L，pH6.5～7.5。

实验表明，添加芽胞杆菌HB12274 CGMCC No.12455能有效降解马尾藻藻体，培养10d后，固形物失重率为50.02％，液体中还原糖增量为65.6μg/mL。由此可见，本发明的芽胞杆菌HB12274 CGMCC No.12455可应用于马尾藻藻体生物降解。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明所述菌株HB12274的形态特征照片，×1000。

图2为本发明所述菌株HB12274的基于16S rDNA的系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：芽胞杆菌HB12274 CGMCC No.12455的分离

采用5点取样法，从海南省东寨港红树林采集底泥样品。取10g样品溶于90ml无菌水中，置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡30min，静置5min后，配制成10^-2～10^-4的系列土壤悬液。采用80℃水浴处理20min的方法以杀死非芽胞细菌，吸取系列悬液0.1ml，涂布于细菌分离培养基，置于37℃培养箱倒置培养。待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取单菌落划线纯化2～3次，直至获得纯培养。经初步排重后，编号，保存。

实施例2 芽胞杆菌HB12274 CGMCC No.12455的种属鉴定

(1)形态与培养特性

将菌株在麦芽汁营养琼脂培养基上划线培养，菌株生长迅速，菌落直径3～5mm，圆形，边缘不规则，表面无光泽，不平整，乳白色，不透明；菌体长杆状，革兰氏染色结果为阳性，产芽胞，一端膨大(图1)。

(2)生理生化特征

菌株HB12274可利用葡萄糖、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖、甘露醇、果糖、乳糖和阿拉伯糖。革兰氏染色、VP测定、接触酶实验阳性，MR实验阴性，可还原硝酸盐，能使明胶液化。

(3)16S rDNA序列测定与系统发育分析

通过PCR扩增、测序获得HB12274的16S rDNA序列1450bp，核苷酸序列在Genbank的登录号为KU529689。将该序列与EzBioCloud数据库中的序列进行比对，发现菌株HB12274与与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum序列相似性最高，达到99.5％，与Bacillus siamensis和Bacillus methylotrophicus序列相似性分别为99.4％和99.3％。选择同源性高的相关菌株在MEGA5.0中利用Neighbor-joining法构建系统发育树(图2)，可看出，HB12274与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42^T处于同一分支上，二者亲缘关系较近。比较二者形态特征、生理生化特征，发现形态特征相似，生理生化特征一致。

综合以上结果，本发明涉及的菌株HB12274(CGMCC No.12455)，被鉴定为Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum(解淀粉芽胞杆菌植物亚种)，已于2016年5月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.12455。保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

实施例3：菌株HB12274 CGMCC No.12455液体菌剂的制备

(1)菌株活化：将所述的解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274接种于营养琼脂固体培养基，于37℃培养24h。培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，琼脂粉18.0g，氯化钠16.0g，1000mL，pH7.5，121℃灭菌20min。

(2)液体培养：将活化的菌株接入营养琼脂液体培养基中，于37℃、200r/min振荡培养24h，制成种子液。

(3)发酵培养：将种子液按体积比3％接种于营养琼脂液体培养基，37℃、200r/min振荡培养72h，即制得解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274的液体菌剂。

按以上步骤即制得解淀粉芽胞杆菌植物亚种HB12274的液体菌剂。

实施例4：菌株HB12274 CGMCC No.12455降解褐藻胶、纤维素、淀粉活性测定

采用透明圈法测定菌株HB12274对褐藻胶、纤维素、淀粉的降解活性，结果见表1。

产褐藻胶裂解酶测定：取单菌落，点接到褐藻酸钠培养基(培养基组成：褐藻酸钠5.0g，(NH₄)₂SO₄5.0g，K₂HPO₄2.0g，NaCl 16.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.5)，于37℃倒置培养3d后，加适量95％酒精，静置，若菌株产生褐藻胶裂解酶，则菌落周围会有水解圈，水解圈直径/菌落直径的比值(Hc值)反应了褐藻胶裂解酶的相对大小。结果显示，菌株HB12274具有较强的降解褐藻酸钠活性，Hc值为6.25。

产淀粉酶测定：取单菌落，点接到淀粉水解培养基(培养基组成：蛋白陈10.0g，可溶性淀粉2.0g，牛肉膏5.0g，氯化钠16.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH7.0)，37℃倒置培养3d后，向平板中加卢戈氏碘液。由于淀粉遇碘变蓝，若菌株产淀粉酶，则菌落周围会显示无色透明圈，透明圈直径/菌落直径的比值(Hc值)反应了淀粉酶活性的相对大小。结果显示，菌株HB12274具有较强的降解淀粉活性，Hc值为3.20。

产纤维素酶测定：取单菌落，点接到羧甲基纤维素钠培养基(羧甲基纤维素钠10.0g，NH₄NO₃1.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 16.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，自然pH)，37℃倒置培养3d，用1％刚果红染色30min，用1mol/L氯化钠脱色20min(2次)， 若菌株产纤维素酶，则菌落周围会有无色透明圈，水解圈直径/菌落直径的比值(Hc值)反应了纤维素酶活性的相对大小。结果显示，菌株HB12274具有较强的降解纤维素活性，Hc值为4.80。

表1菌株HB12274的产酶活性及相对酶活力

实施例5：菌株HB12274 CGMCC No.12455降解马尾藻藻体效果

芽胞杆菌HB12274 CGMCC No.12455按实施例3的方法制备。将液体菌剂以5％的接种量接种于装有100ml马尾藻粉发酵培养基(培养基组成：马尾藻粉50g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠16g/L，pH 7.5左右)的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min条件下摇床培养10d。

实验表明，添加芽胞杆菌HB12274CGMCC No.12455能有效降解马尾藻藻体，培养10天后，固形物失重率为50.02％，液体中还原糖增量为65.6μg/mL。

序列表

序列表(1450bp)。