本发明属于青贮饲料加工技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其应用。
背景技术：
随着人口的增加和工业的发展，我国畜牧业得到了迅速发展，人畜争粮问题日益尖锐，直接影响畜牧业的发展。因此，科学合理地开发饲用植物资源是发展畜牧业的物质基础，是解决牧草资源不足的一个重要途径。我国科研人员培育出最新抗逆性品系-饲料桑，因其营养丰富、适口性好、易消化，具有较高的蛋白质和钙含量，具有潜在的生态价值和饲料价值，开发前景十分广阔。青贮饲料颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好，在畜牧业生产中广泛应用，尤其在反刍动物饲养中，已成为不可缺少的基础饲料。但饲用植物因各种原因导致青贮品质不好，影响家畜的适口性。根据饲料桑的特点，经过试验验证，最终认为生长快、产酸高的乳酸菌数量低下是饲料桑青贮品质低的原因。
目前，应用较广泛的商品菌剂多是针对玉米青贮、苜蓿青贮或其他饲料作物的，将其应用在饲料桑青贮中效果不佳。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中青贮饲料制备过程中乳酸菌生长慢、产酸低而导致饲料桑青贮品质低的问题，提出一种可以快速降低ph值，加速发酵过程，有效提高饲料桑青贮品质的植物乳杆菌。
为此，本发明的具体技术方案如下：
一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，菌株为zs1，保藏号为cgmccno.13460。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1，来源于饲料桑原料。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1的16srdna序列如seqidno.1所示。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1的生物学特性为：革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖同型发酵，耐酸性强(在ph3.0可以正常生长)，生长速率高(mrs培养基培养24小时，od620nm>2.00)，产酸速度快(mrs培养基培养24小时，ph可降到4.0以下)，生育温域宽(5-50℃可正常生长)，在纯培养和青贮条件下高产乳酸。
一种青贮饲料添加剂的活性成分为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1。
所述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1在mrs培养基上培养，得到青贮饲料添加剂。
所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1在青贮饲料制备中的应用。
上述应用中，所述青贮饲料为饲料桑青贮饲料。
一种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
1)将待发酵饲料切断，混合均匀；
2)向步骤1)中加入权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1；
3)将步骤2)中饲料真空密封，贮藏，发酵产物即为青贮饲料。
步骤1)中待发酵饲料为饲料桑。
步骤1)中待发酵饲料切断长度为1～2cm。
步骤2)中每千克待发酵饲料加入植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs11.0×105～1.0×106个。
步骤3)中贮藏条件为：温度15～45℃，时间30～60d。
本发明的有益效果为：
1、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1可用于制备青贮饲料，尤其是制备饲料桑青贮饲料。
2、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1可以快速降低青贮饲料的ph值，加速发酵过程，提高青贮速率；有效提高饲料桑青贮品质，降低饲料桑青贮饲料杂菌数量，能较好的保存饲料桑营养，克服了饲料桑发酵品质差的问题，可广泛使用。
3、用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1制备的添加剂青贮效果比市售乳酸菌添加剂更佳，且成本低、安全、易于利用。
生物材料保藏证明
分类命名：lactobacillusplantarum；菌株编号：zs1
保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏机构简称：cgmcc
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年12月15日
保藏中心登记入册编号：cgmccno.13460
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限于本发明。下述实施例中如无特殊说明，均为常规方法。
gfg(商业菌剂)，购自四川高福记生物科技有限公司，培养基均从北京奥博星生物科技有限公司(北京)购买。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1的分离与菌株鉴定
1、菌株的分离
采用稀释平板法分离植物乳杆菌：无菌条件下称取饲料桑原10g，置于装有90ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，摇匀，即为稀释10倍的样品悬液，后按10倍稀释法直接连续稀释即可。选取合适稀释度，取0.1ml涂布在mrs培养基平板上，于30℃恒温箱中培养48h，进行平板计数。依据菌落大小、形态和颜色等特征，挑取典型菌落，进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株即可初步确定为乳杆菌，将其在mrs培养基上划线纯化两次，接种到mrs固体斜面培养基，4℃冰箱中保存备用。
mrs培养基：蛋白胨(proteosepeptoneno.3)10.0g，牛肉粉(beefextract)5.0g，酵母粉(yeastextract)4.0g，葡萄糖(dextrose)20.0g，吐温(polysorbate80)1ml，柠檬酸三铵(ammoniumcitratetribasic)2.0g，乙酸钠(naac)5.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.2g，硫酸锰(mnso4·4h2o)0.05g，磷酸氢二钾(k2hpo4)2.0g，蒸馏水(h2o)1000ml，固体培养基再加15g/l琼脂(agar)，121℃，灭菌20min。
2、筛选高产乳酸、耐酸及生长速度快的乳杆菌
从饲料桑原料上分离的乳杆菌，进行革兰氏染色、葡萄糖产气、过氧化氢酶试验、生育温度(5、10、45、50℃)和生育ph(3.0、3.5、4.0、4.5、9.0)、碳源发酵、发酵24h内的ph值及od620nm等生理生化实验。
生理生化试验方法如下：
(1)革兰氏染色参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。
(2)植物乳杆菌生长ph调节使用2mol/lnaoh和2mol/lhcl。
(3)葡萄糖产气试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱培养48h，挑取单菌落接种于含有5mlmrs液体培养基(ph6.5)的试管中(杜氏小管倒扣在试管内)，放置于普通恒温培养箱37℃培养48h，观察并记录结果，产生气泡的记为阳性，不产生气泡的则为阴性。
(4)过氧化氢酶测定试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱培养48h，挑取单菌落涂布在滴加了3％(w/w)过氧化氢溶液的培养皿上，观察是否有气泡产生，产生气泡的为过氧化氢酶阳性，不产生气泡的则为阴性。
(5)糖发酵使用北京路桥技术股份有限公司生产的乳酸杆菌生化鉴定套装分析。对于革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性的实验菌株，采用含有8种碳源的生化鉴定套装，对照为一支麦氏浊度比浊管，试验方法依据说明书进行，37℃恒温培养48h，记录试验结果。
用生理生化方法，从103株菌株中筛选出高产乳酸、耐酸及生长速度快的植物乳杆菌zs1。结果表明，植物乳杆菌zs1为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在5-50℃和ph3.0-9.0条件下皆可生长，具有较强耐酸性(表1)，可发酵大多数糖类(表2)，发酵24h后ph降到4.0以下且od620nm>2.00(表3)。
表1植物乳杆菌zs1的菌落形态及生理生化特性
注：-，不生长；+，正常生长。
表2植物乳杆菌zs1的糖源发酵实验结果
注：-，不生长；+，正常生长。
表3植物乳杆菌zs1的产酸速率及生长速率
3、菌株的鉴定
将筛选的高产乳酸、耐酸及生长速度快的乳杆菌接种在0.5mlmrs液体培养基中，30℃，180rmp培养过夜，利用菌液pcr进行菌种鉴定。
引物选用细菌的16srdna基因扩增的通用引物：
27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’
pcr反应体系(40μl)：
反应条件：
扩增产物送美吉生物科技有限公司测序，16srdna序列如seqidno.1所示，在ncbi上进行序列比对，结合菌株的生理生化数据，最终确定分离的菌株属于植物乳杆菌lactobacillusplantarum，命名为zs1。
实施例2：饲料桑青贮饲料的制备
饲料桑青贮饲料的制备包括如下步骤：
(1)将轻度晾晒的饲料桑切断至2cm左右，混合均匀；
(2)向步骤(1)饲料桑中加入植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1，每千克饲料桑加入植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1约1.0×106个，并以无添加(ck)、gfg(商业菌剂)为对照，每个处理3个重复；
(3)将步骤(2)饲料桑装入30cm×20cm的聚乙烯青贮袋，每袋装入100g，用真空密封机抽气、密封，置于室温贮藏60d。
1、青贮饲料营养品质测定
饲料桑青贮饲料的常规营养成分测定方法如下：
干物质(dm)的测定：利用鼓风干燥箱，饲料桑青贮饲料在65℃恒温条件下，干燥48h，冷却称重；粗蛋白(cp)利用foss8400全自动凯氏定氮仪进行测定；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维利用ankom220型纤维分析系统进行测定，可溶性糖(wsc)含量采用蒽酮-硫酸法测定。用72％的硫酸消化酸性洗涤纤维，将残渣灰化，在灰化中逸失的部分即酸性洗涤木质素。
饲料桑青贮后营养物质如表4所示，虽各营养物质之间差异不显著，但添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1的青贮饲料，其干物质、粗蛋白及可溶性糖含量高于ck和gfg，而中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量略低于未添加。因此，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1的饲料桑青贮饲料的营养品质略高。
表4饲料桑青贮后营养物质(gkg-1dm)
注：每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异
2、青贮饲料发酵品质测定
饲料桑青贮饲料的发酵品质分析方法如下：
氨态氮含量利用苯酚-次氯酸钠比色法测定；有机酸测定采用岛津gc-14型高效液相色谱仪(色谱柱：kc-811column，shimadzu，日本)，检测器：spd-m10avp，流动相：3mmoll-1高氯酸，流速1mlmin-1，柱温50℃，检测波长210nm，进样量5μl。
饲料桑青贮后发酵品质如表5所示，与ck和gfg相比，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1可显著降低饲料桑青贮ph、氨态氮及乙酸含量(p＜0.05)，并显著提高乳酸含量(p＜0.05)，即显著提高了饲料桑青贮品质。
表5饲料桑青贮后发酵品质(gkg-1dm)
注：每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异
3、青贮饲料微生物分析
饲料桑青贮饲料打开后立即在无菌条件下取10g(取样过程中更换手套，防止污染)，加入90ml灭菌的生理盐水，150rpm振荡2h，梯度稀释涂布。微生物数量测定采用平板计数法，乳酸菌用mrs固体培养基，酵母菌用孟加拉红固体培养基(rosebengalmediumagar)计数，大肠杆菌及霉菌用伊红美蓝固体培养基(eosin-methylenebluemediumagar)计数。乳酸菌用厌氧箱30℃培养2d，大肠杆菌、霉菌用生化培养箱37℃培养2d，酵母菌用生化培养箱28℃培养2d。
孟加拉红固体培养基(g/l)：蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、葡萄糖10g、氯霉素0.1g、孟加拉红0.033g、琼脂18.5g。
伊红美蓝固体培养基(g/l)：蛋白胨5g、牛肉浸粉3g、乳糖10g、氯化钠5g、曙红钠0.4g、亚甲蓝0.065g、琼脂14g。
饲料桑青贮后微生物指标如表6所示，结果表明添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zs1可显著降低饲料桑青贮饲料杂菌数量。
表6饲料桑青贮后微生物指标(logcfug-1fm)
注：每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异。
sequencelisting
<110>中国农业大学
<120>一种植物乳杆菌及其应用
<130>2017
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<170>patentinversion3.3
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<213>植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）
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