一种检测冠状病毒的反义RNA探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法与流程

文档序号:23729556发布日期:2021-01-26 19:49阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种检测冠状病毒的反义rna探针,其特征在于,所述反义rna探针的序列如seq id no.4所示。2.如权利要求1所述的rna探针的制备方法,其特征在于,所述制备方法的具体步骤如下:(1)设计引物:covid-19-f1序列为5'-gatcaaaacaacgtcggccc-3';covid-19-r1序列为5'-gcgtaatacgactcactatagggttctgtctctgcggtaaggc-3';(2)构建重组载体:将冠状病毒sars-cov-2待测区域碱基序列如seq id no.1所示插入到质粒pcdna3.1-myc-hisa中bamhi和xbai之间,得到重组载体pcdna3.1-myc-hisa-covid-19;(3)pcr扩增冠状病毒sars-cov-2待测区dna序列:以步骤(2)得到的重组载体为模板,以步骤(1)的引物,利用pcr技术扩增序列,得到冠状病毒sars-cov-2待测区dna序列;(4)体外转录得到反义rna探针:以步骤(3)得到的冠状病毒sars-cov-2待测区dna片段为模板进行体外转录,得到反义rna探针。3.一种检测冠状病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括地高辛修饰的权利要求1所述的反义rna探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:预杂交液、阻断溶液、ap底物染色缓冲液、mabt溶液、50%甲酰胺/2
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ssct缓冲液、2
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ssct缓冲液、0.2
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ssct缓冲液、检测缓冲液、冠状病毒sars-cov-2阴性对照和冠状病毒sars-cov-2阳性对照。5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述地高辛修饰的反义rna探针的浓度为2ng/μl。6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述预杂交液包括体积比50%甲酰胺、5
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ssct、50μg/ml肝素、5mm edta、0.05mg/ml核糖体rna、1m柠檬酸和0.1%tween;所述阻断溶液包括1%羊血清、2%阻断剂、100mm顺丁烯二酸和150mmnacl;所述ap底物染色缓冲液包括氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和左旋咪唑;所述mabt溶液包括顺丁烯二酸和nacl;所述检测缓冲液包括100mmnacl、50mm mgcl2、100mm三羟甲基氨基甲烷、体积分数为0.1%的tween-20和1mm左旋咪唑。7.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述冠状病毒sars-cov-2阳性对照是1
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105个带有冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞;所述冠状病毒sars-cov-2阴性对照是1
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105个不携带冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞。8.一种检测冠状病毒的方法,其特征在于,所述方法是利用权利要求3-7任意一项所述的试剂盒检测冠状病毒,具体步骤如下:1)杂交预处理:在待检测的样本中加入蛋白酶k进行孵育,然后用pbst溶液漂洗,然后用多聚甲醛固定,然后用pbst溶液漂洗;2)预杂交反应:将预杂交液加入到步骤1)预处理后的待检测的样本中,进行孵育;3)杂交反应:除去步骤2)中的预杂交液,向待检测的样本中加入含有地高辛修饰的权利要求1所述的反义rna探针的预杂交液,进行孵育;4)杂交后处理:除去步骤3)中的预杂交液,依次用50%甲酰胺/2
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ssct缓冲液、2
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ssct缓冲液和0.2
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ssct缓冲液漂洗待测样本后和阻断溶液混合,室温培养,然后加入用阻断溶液1000-4000倍稀释的抗地高辛抗体,孵育培养,得到杂交样本;
5)显色反应:将步骤4)得到的杂交样本加入到含有终体积分数为1%的羔羊血清的mabt溶液中,清洗后再以mabt溶液清洗,然后用检测缓冲液清洗,加入ap底物染色缓冲液进行室温避光孵育,当杂交样本着色后,用pbs溶液清洗杂交样本,然后用显微镜观察和照相得到检测冠状病毒sars-cov-2的结果。9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤2)中的孵育是68℃条件下反应45分钟-240分钟;步骤3)中的孵育是在68℃条件下反应10小时;步骤4)中的孵育是在4℃条件下反应10小时,所述室温培养的时间是45分钟-240分钟。10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述室温避光孵育的时间为30分钟-120分钟,每隔15分钟检测一次信号,直到有目标信号出现。
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