一种肠道内菌群鉴定分析方法与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种肠道内菌群鉴定分析方法。


背景技术：

2.近年来，肠道疾病发病率不断攀升，且肠道疾病早期症状不明显，缺乏有效的筛查方法，最终有可能发展成为癌症。现有技术对肠道疾病的检查和筛选主要通过粪便隐血实验初步筛查高危人群，再进行肠镜检查。然而粪便隐血实验缺乏特异性，初筛顺应性及高危人群的肠镜受检率仅30
‑
40％，疾病检出率19％左右，有待进一步提高。利用无创的标志物对人群进行筛查，可缩小肠镜检查人数，进一步提高肠镜的特异性及灵敏度，对早期筛查肠道疾病有重要的临床意义。
3.人的肠道内存在大量菌群，有益菌和条件致病菌共存，健康人的体内有益菌占优势，菌群数量维持平衡的稳态；但患有肠道疾病的人体内，体内环境发生变化，导致菌群失衡，条件致病菌数量显著增加，因此，通过鉴定肠道内菌群微生态可以对肠道疾病作出预警。


技术实现要素：

4.本发明的提供一种肠道内菌群鉴定分析方法。
5.本发明的方案是：
6.一种肠道内菌群鉴定分析方法，包括下列步骤：
7.1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；
8.2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液ga，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul proteinase k，混匀，加入缓冲液gb，振荡15s,70℃金属浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液gd，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液te，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得dna样本；
9.3)样品质控，将步骤2)中所提取的dna样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试od260/od280值为1.9
±
0.2，获得质检合格的dna样本；
10.4)qpcr扩增，将质检合格的dna样本稀释，然后分别构建qpcr反应体系，然后进行扩增；
11.5)数据分析，通过软件，获得分析结果。
12.作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0013][0014]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0015][0016]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0017][0018]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0019][0020][0021]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0022]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0023]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0024]
作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0025][0026][0027]
作为优选的技术方案，所述扩增反应条件：
[0028]
循环参数，95℃,30s；95℃,5s至60℃,34s，循环32次；60℃检测荧光；溶解曲线，95℃，15s；60℃，1min至95℃，0.3℃/sec检测荧光；
[0029]
荧光通道检测选择，检测为sybr通道，根据结果判断标准判读结果。
[0030]
由于采用了上述技术方案一种肠道内菌群鉴定分析方法，1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液ga，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul proteinase k，混匀，加入缓冲液gb，振荡15s,70℃金属浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液gd，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液te，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得dna样本；3)样品质控，将步骤2)中所提取的dna样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试od260/od280值为1.9
±
0.2，获得质检合格的dna样本；4)qpcr扩增，将质检合格的dna样本稀释，然后分别构建qpcr反应体系，然后进行扩增；5)数据分析，灭菌水稀释dna原液，进行上机通过软件，获得分析结果。
[0031]
本发明的优点：本发明便于操作使用，提高了检测的准确性；
[0032]
有效鉴定多种种肠道细菌在肠道中的相对含量，进而鉴定肠道微生态的状况；
[0033]
本发明通过大量筛选研究，确定多种特定细菌作为生物标志物，本发明的引物灵敏度高；
[0034]
本发明可以通过pcr反应获得多种种肠道细菌的相对含量信息，显著降低时间成本，同时减少因操作人员加样过程引入的误差。
附图说明
[0035]
图1为本发明实施例软件的选择程序类型界面图；
[0036]
图2为本发明实施例软件的选择染料和扩增基因名称界面图；
[0037]
图3为本发明实施例软件的设置对照基因界面图；
[0038]
图4为本发明实施例软件的设置扩增程序界面图；
[0039]
图5为本发明实施例软件的批次的结果界面图；
[0040]
图6为本发明实施例的初步溶解曲线界面图；
[0041]
图7为本发明实施例excel文件设置界面图；
[0042]
图8为本发明实施例修改excel文件界面图；
[0043]
图9为本发明实施例的最终熔解曲线；
[0044]
图10为本发明的流程框架图。
具体实施方式
[0045]
为了弥补以上不足，本发明提供了一种肠道内菌群鉴定分析方法以解决上述背景技术中的问题。
[0046]
一种肠道内菌群鉴定分析方法，包括下列步骤：
[0047]
1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；
[0048]
2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液ga，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul proteinase k，混匀，加入缓冲液gb，振荡15s,70℃金属
浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液gd，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液te，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得dna样本；
[0049]
3)样品质控，将步骤2)中所提取的dna样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试od260/od280值为1.9
±
0.2，获得质检合格的dna样本；
[0050]
4)qpcr扩增，将质检合格的dna样本稀释，然后分别构建qpcr反应体系，然后进行扩增；
[0051]
5)数据分析，灭菌水稀释dna原液，进行上机通过软件，获得分析结果。所述反应体系如下：
[0052]
所述反应体系如下：
[0053]
所述反应体系如下：
[0054]
所述反应体系如下：
[0055]
所述反应体系如下：
[0056][0057][0058]
所述反应体系如下：
[0059][0060]
所述反应体系如下：
[0061][0062]
所述反应体系如下：
[0063][0064]
所述扩增反应条件：
[0065]
循环参数，95℃,30s；95℃,5s至60℃,34s，循环32次；60℃检测荧光；溶解曲线，95℃，15s；60℃，1min至95℃，0.3℃/sec检测荧光；
[0066]
荧光通道检测选择，检测为sybr通道，根据结果判断标准判读结果。
[0067]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0068]
实施例：
[0069]
第一步：
[0070]
进行干粪便隐血检测：
[0071]
试剂盒：大便隐血检测试剂盒(胶体金法)
[0072]
记录：
[0073]
结果记录：获得便血样本结果记录表与检测图记录。
[0074]
第二步提取反应sop：
[0075]
试剂盒组成以及样本要求
[0076]
试剂盒组成tb
‑
green为takara生产，使用天根提取试剂盒提取(货号dp302
‑
02)，抽提的核酸浓度大于30ng/ul，od260/od280为1.9
±
0.2。
[0077]
1、提取具体操作步骤如下：
[0078]
1.1取粪便样本1～2g，向样本中加入200μl缓冲液ga，振荡或者吹吸至样本彻底悬浮；
[0079]
1.2向管中加入20μl proteinase k溶液，混匀；(若取用的粪便较多，可以增加至30ul)
[0080]
1.3加入220μl缓冲液gb，振荡15sec，70℃金属浴放置30min，同时震荡1000/min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
[0081]
1.4加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠并沉淀絮状物；
[0082]
1.5将上一步所得溶液(700ul，若溶液颜色较浅，可多次转移)加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；若无法全部离心下去，将cb3柱中的液体全部移出去，并加入220μl无水乙醇吹吸2～3次后，至于离心机中离心，再将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，重新过柱吸附；
[0083]
1.6向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，
12,000rpm
[0084]
(～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
[0085]
1.7向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中；
[0086]
1.8重复操作步骤1.47；
[0087]
1.9将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温。
[0088]
放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0089]
1.10将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液te，65℃放置2～5min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，将溶液收集到离心管中；
[0090]
1.11实验废弃物按《上海市医疗卫生机构医疗废物管理规定》与《实验室医疗废弃物处理操作规程》
[0091]
2.质控标准
[0092]
2.1所提取dna经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl；
[0093]
2.2所提取dna经分光光度计测试od260/od280值为1.9
±
0.2；
[0094]
3.上机流程
[0095]
3.1将质检合格的dna样本稀释至30ng/ul；
[0096]
3.2qpcr反应体系
[0097]
·
fusobacterium nucleatum(具核梭杆菌,f.nu)
[0098]
试剂体积sybr green mix10ul引物f.nu
‑
f0.8ul引物f.nu
‑
r0.8uldna30ngrox0.4ulh2o7ul总体系20ul
[0099]
·
peptostreptococcus anaerobius(厌氧消化链球菌,p.an)
[0100]
试剂体积sybr green mix10ul引物p.an
‑
f0.8ul引物p.an
‑
r0.8uldna30ngrox0.4ulh2o7ul总体系20ul
[0101]
·
porphyromonas asaccharolytica(非解糖卟啉单胞菌,p.as)
[0102]
试剂体积sybr green mix10ul引物p.as
‑
f0.4ul引物p.as
‑
r0.4uldna30ngrox0.4ulh2o7.8ul总体系20ul
[0103]
·
clostridium symbiosum(共生梭菌,c.sy)
[0104]
试剂体积sybr green mix10ul引物c.sy
‑
f0.4ul引物c.sy
‑
r0.4uldna30ngrox0.4ulh2o7.8ul总体系20ul
[0105]
·
streptococcus salivarius(唾液链球菌,s.sa)
[0106]
试剂体积sybr green mix10ul引物s.sa
‑
f0.4ul引物s.sa
‑
r0.4uldna30ngrox0.4ulh2o7.8ul总体系20ul
[0107]
·
bacteroides fragilis(脆弱类杆菌,b.f)
[0108]
试剂体积sybr green mix10ul引物b.f
‑
f0.8ul引物b.f
‑
r0.8uldna30ngrox0.4ulh2o7ul总体系20ul
[0109]
·
p.anprevotella intermedia(普氏中间菌,p.in)
[0110][0111][0112]
·
16s
[0113]
试剂体积sybr green mix10ul引物16s
‑
f0.2ul引物16s
‑
r0.2uldna30ngrox0.4ulh2o8.2ul总体系20ul
[0114]
3.3abi 7500反应程序
[0115]
本方案实验程序为：相对溶解曲线类型quantitation
‑
relative standard curve
[0116]
·
程序选择：
[0117]
第一步：在experiment properties中依次选择
[0118]
quantitation
‑
relative standard curve，sybr
‑
green reagents,standard；
[0119]
图1
[0120]
第二步：在plate setup中设置扩增参数；图2
[0121]
第三步：设置对照基因；图3
[0122]
第四步：设置扩增程序；图4
[0123]
·
反应条件：
[0124]
循环参数：95℃
×
30sec；95℃
×
5sec
→
60℃
×
34sec，循环32次，60℃检测荧光；
[0125]
溶解曲线：95℃
×
15sec，60℃
×
1min
→
95℃，0.3℃/sec检测荧光。
[0126]
荧光通道检测选择：检测选用sybr通道。
[0127]
3.4实验废弃物按《上海市医疗卫生机构医疗废物管理规定》与《实验室医疗废弃物处理操作规程》
[0128]
3.5按照新版的结果判读标准判读结果并出具检测报告；
[0129]
质控标准
[0130]
所提取dna经分光光度计测试其浓度≥30ng/μl；
[0131]
所提取dna经分光光度计测试od260/od280值为1.9
±
0.2；
[0132]
附录：诺菌康引物序列
[0133]
菌种引物序列信息bacteroides fragilis
‑
fcagcgtattaagagccgttt
bacteroides fragilis
‑
rtgagtttggtggtagtatcttctgprevotella intermedia
‑
fcgtggaccaaagattcatcggtggaprevotella intermedia
‑
rccgctttactccccaacaaafusobacterium nucleatum
‑
fcaaccattactttaactctaccatgttcafusobacterium nucleatum
‑
rttgactttactgagggagattatgtaaaaatcpeptostreptococcus anaerobius
‑
fagacgaattcaagtcagtaaatacapeptostreptococcus anaerobius
‑
rctcctatccaccaggatatcaaclostridium symbiosum
‑
fgtgagatgatgtgccaggcclostridium symbiosum
‑
rtaccggttgcttcgtcgattstreptococcus salivarius
‑
fttcgcttcccagaatcaagtstreptococcus salivarius
‑
raaacgaccagccagcaattcporphyromonas asaccharolytica
‑
ftcgaccacatagagctaagcacporphyromonas asaccharolytica
‑
rtcctcgactttcataccgtct16s rrna
‑
fggtgaatacgttcccgg16s rrna
‑
rtacggctaccttgttacgactt
[0134]
灭菌水(ro水置入高压灭菌锅内，拧松瓶盖，轻轻盖上不拧)稀释dna原液抽提的dna一个月以上不可用，抽提完需尽快上机。
[0135]
一、数据分析
[0136]
1、打开当批次的7500上机程序文件，全选样本，点击“export”按钮，在对话框中点选“browse”按钮，路径选择“桌面”，点击“startexport”按钮，再点击弹出的对话框右上角的
×
按钮，导出当批次的结果。(图5)
[0137]
2、首先检查16s结果，要求所有样本的16s结果无黄标，如有黄标则有黄标的样本检测不合格。溶解曲线峰高在0.6左右，太低说明抽提有问题。(图6)
[0138]
3、打开导出的当批次结果文件(excel文档)，新建两个sheet表，从最近的已分析样本excel文件中，复制“well”、“sample name”、“target name”和“c
t”四项，张贴到新建excel文件的sheet1中。(图7)
[0139]
4、从路径“筛查
”→“
数据表
”→“
分析数据表”中，选择最近已分析样本的“well”、“sample name”、“target name”和“c
t”四项数据，复制到新建excel文件的sheet1中对应的“well”、“sample name”、“target name”和“c
t”四项下，数据中有“n/a”的删除。(图8)
[0140]
5、从最近已分析样本数据表中复制“孔号”、“ct值”、“ct值”、“δct”，张贴到新建excel文件的sheet2中第一行，“样本号”、“检测日期”、“96孔板编号”复制到“孔号”、“ct值”右侧的第二行。“ct值”、“δct”下均含“16s”、“fnu”“pan”“csy”“pas”“ssa”“pi”“bf”八项。依次输入当批次的“样本号”、“检测日期”、“96孔板编号”。“孔号”、“ct值”内容从当批次的7500上机程序文件中复制张贴到新建excel文件的sheet2中对应的“孔号”、“ct值”下，点击右键，点选“值”，获得数值。
[0141]
6、“孔号”a1
‑
h1右侧的“ct值”对应第一个样本的“16s”、“fnu”“pan”“csy”“pas”“ssa”“pi”“bf”八项。a1
‑
h1右侧的“ct值”的内容张贴到“ct值”下的“16s”下的一列，点击右键，点选“转置”，列转行。第二个、第三个至最后一个样本依次完成。
[0142]
7、δct
x
＝ct
16s
‑
ct
x
，如：δct
pi
＝ct
16s
‑
ct
xpi
。从当批次的7500上机程序文件中复
制δct值至sheet2中对应的“δct”下，将“﹟value！”改成极值
“‑
32”(系统不能识别﹟value！)。
[0143]
8、检查各位点特异性引物对应的熔解曲线的tm是否符合要求。(图9)
[0144] 16sfnupancsypasssapibftm85
‑
9075
‑
8075
‑
8083
‑
8780
‑
8580
‑
8585
‑
9080
‑
85
[0145]“fnu”“pan”“csy”“pas”“ssa”“pi”“bf”有值，但tm不在要求范围内，需将值改为极值
‑
32。
[0146]
9、将δct值复制到svm_crc_meta_7_fit_201912
××
.csv中，点击右键点选“值”。pmid输入样本的实验室编号。
[0147]
注：复检的各位点的“ct值”与第一次“ct值”的差值要在1以内，根据实际情况，在1以上数值离1较近的也可以接受。
[0148]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。