专利名称：：肠道病毒71型核酸检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，公开了一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：手足口病(Hand,footandmouthdisease，HFMD)是由肠道病毒(Enterovirus,EV)引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Coxsackieviruses16，CA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)最为常见。肠道病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定、血清学检测和分子生物学技术。病毒的分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊断技术，特别是PCR技术，由于其检测材料用量少、快速、灵敏度高且具有很高的特异性，在病毒感染的诊断中发挥越来越多的重要作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术已成为肠道病毒感染快速诊断的重要手段。传统的RT-PCR技术需要两步反应，整个过程需要6-8小时，时间消耗大，不能满足爆发时期的检测需求；另外，该技术还存在交叉污染的风险，检测实验室在一段时间之后不可避免的出现假阳性结果。实时荧光定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
发明内容本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种利用实时荧光定量PCR技术并具有特异、灵敏、快速、操作简便的肠道病毒71型核酸检测试剂盒及检测方法。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是提供一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒，该试剂盒含有(l).PCR反应酶，其中包括热启动Taq酶、MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂；(2).PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、10XPCRBuffer、肠道病毒71型正向引物、肠道病毒71型反向引物、肠道病毒71型探针；肠道病毒71型正向弓l物序列如序列表中SEQIDNO.1所示5'-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC--3'，肠道病毒71型反向引物序列如序列表中SEQIDNO.2所示5'"GAGCMTTGTGGGACRAYTTC-3'，肠道病毒71型探针序列如序列表中SEQIDNO.3所示5'-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3';(3).阴性质控品，为DEPC处理水；(4).阳性质控品，为采用T7RNA聚合酶制备的体外转录RNA。3所述探针5'端标记FAM(荧光报告基团)，3'端标记ECLIPSE(荧光淬灭基团)。所述PCR反应酶中各组分含量的配比为浓度为5U/L的热启动Taq酶用量0.25iiL;浓度为200U/iiL的MLV逆转录酶用量0.5yL;40U/yL的RNA酶抑制剂的用量0.25iiL;所述PCR反应液中各组分含量的配比为DEPC处理水用量16iiL;2.5mMdNTPs用量2iiL;10XPCRBuffer用量2.5iiL;10iiM引物混合溶液用量liiL;10iiM探针用量0.5iiL。本发明还提供一种利用上述试剂盒检测肠道病毒71型核酸的检测方法，包括下列步骤(l)RNA提取采用商业化病毒RNA提取试剂盒如QIAampViralRNAMiniKit提取；(2)PCRMix配制及分装按22iiL:1yL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，充分混匀，12，000rpm离心10s，配制成PCRMix，取出PCR反应管，给每个反应管中加入23ii上述PCRMix;每次检测需要设一个阳性质控PCR反应管和一个阴性质控PCR反应管，其余为被测样品的PCR反应管；(3)加样向上述的反应管中分别加入提取的样本RNA，阳性质控品及阴性质控品2iiL，12，OOOrpm离心10s;(4)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；42°C45min;95°C2min;95°C10s，60°C30s;40个循环；在反应程序的第三步的终了读取荧光值；(5)分析判断Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35_37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。本发明的有益效果是本发明采用实时荧光定量PCR技术检测肠道病毒71型核酸序列的方法，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。图1是实施例1实验结果图；图2是实施例2实验结果图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。本发明提供了一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒，该试剂盒含有PCR反应酶，其中包括热启动Taq酶、MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂；PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、10XPCRBuffer、肠道病毒71型正向引物、肠道病毒71型反向引物、肠道病毒71型探针；阴性质控品，为DEPC处理水；阳性质控品，为采用T7RNA聚合酶制备的体外转录RNA。试剂盒的制造41.试齐[J本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)，其余购自普洛麦格公司、北京全式金生物技术有限公司、北京化工厂。2.PCR反应液制备(1)引物及探针设计与合成从Genbank上下载国内不同年份和地区的EV71全基因组序列，通过生物学软件AlignX进行多序列比对，在VPl基因区选择一段保守序列，依据引物和探针设计原则，采用PrimerExpress软件设计EV71特异性引物及探针。设计结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>表中F:forward，正向；EV71-F表示肠道病毒71型正向引物。R:reverse，反向；EV71-R表示肠道病毒71型反向引物。P:probe，探针；EV71-P表示肠道病毒71型探针。FAM:荧光报告基团。ECLIPSE:荧光淬灭基团。按照上表的设计结果，分别委托Invitrogen公司和Takara公司合成引物和探针。(2)引物及探针的溶解取冻存的肠道病毒71型引物(EV71-F和EV71-R)、探针(EV71-P)干粉管，12，000rpm离心2min，按照引物探针溶解说明书加入TEBuffer将干粉溶解，使探针浓度为10yM，两种引物浓度各为20iiM，等量取两种引物溶液到1.5mLEP管中混合，配制成10i!M引物混合溶液，振荡混匀离心，备用；(3)PCR反应液配制按下述比例DEPC处理水16iiL、2.5mMdNTPs2iiL、10XPCRBuffer2.5iiL、10iiM引物混合溶液1yL和10iiM探针0.5iiL，配制成PCR反应液。3.PCR反应酶制备浓度为5U/iiL的热启动Taq酶0.25iiL、浓度为200U/iiL的MLV逆转录酶0.5iiL和40U/iiL的RNA酶抑制剂的0.25iiL混合制备成PCR反应酶。4.阴性质控品制备阴性质控品的作用是用来防止因污染而产生的假阳性。本发明采用DEPC处理水作为阴性质控品，对整个实验过程进行监控。5.阳性质控品制备阳性质控品的作用是监控试剂是否失效及性能是否下降。本发明采用肠道病毒71型体外转录的RNA作为阳性质控品。按照本
技术领域：
中常用的分子克隆技术，其制备方法如下(1)重组质粒的构建和提取首先在EV71-F、EV-71-R的外侧设计以下引物对肠道病毒71型阳性菌株的基因组DNA序列进行PCR扩增上游引物如序列表中SEQIDNO:5所示ATATAATAGCACTAGCGGCAGC下游引物如序列表中SEQIDNO:6所示TACAAGATTTGCCCAATCAAT然后采用博迈德《多功能DNA纯化回收试剂盒》回收PCR产物作为目的片段；采用全式金公司的pEAZY-T3CloningVector试剂盒，将上述目的片段插入含有T7启动子的载体pEAZY-T3中，构建重组质粒，通过转化及筛选，得到含插入有上述目的片段的重组质粒的阳性克隆菌；该阳性克隆菌经过扩大培养后，用博迈德《高纯度质粒提取试剂盒》提取培养菌液中的质粒并用紫外分光光度计进行定量。(2)体外转录RNA质控品的制备用Takara公司的SACI酶对上述提取的质粒进行酶切使其线性化后，采用Takara公司的T7RNA聚合酶对上述酶切反应液进行体外转录，所得的体外转录反应液用Takara公司的DNaseI进行消化以除去其中的质粒DNA，随后采用全式金公司的TransZol提取该消化液中的RNA，此即体外转录RNA;采用紫外分光光度计对其进行定量后，将其稀释到浓度为105拷贝/iiL作为体外转录RNA质控品。重组质粒中插入的肠道病毒71型特异性目的片段序列如序列表中SEQIDNO.4实施例1用本发明的试剂盒在ABI7300荧光定量PCR仪上检测肠道病毒71型核酸的方法(l)RNA提取采用QIAampViralRNAMiniKit提取，(2)PCRMix配制按22iiL:1PL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，充分混匀，12，000rpm离心lOs，取出PCR反应管，其中一个为阳性质控品反应管，一个为阴性质控品反应管，另一个为被测样品反应管，给每个反应管中加入23L上述配制的PCRMix;PCRMix配制方法如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)加样向3个反应管中分别加入提取的样本RNA2yL，阳性质控品2yL及阴性质控品2iiL，混匀后12，OOOrpm离心10s;(4)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪的反应槽内，按对应顺序设置未知标本、阳性质控品品和阴性质控品，并设置样品名称、标记荧光基团种类，按下表设置反应程序进行PCR扩增。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注报告基团设为FAM，淬灭基团设为none,PassiveReference设为none;在反应程序的第三步的终了读取荧光值。(5)质控标准阴性质控品阴性；阳性质控品阳性且Ct值小于35。以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。(6)分析判断Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35_37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。本发明实施例1的试验结果如图1所示，检测结果为阳性，Ct值为32.28。本发明实施例所用的试剂及材料分别如下(1)试剂QIAampViralRNAMiniKit,购自德国QIAGEN公司;肠道病毒71型核酸检测试剂盒，本发明产品。(2)材料移液器枪头0.2mL、0.5mL、1.5mL，购自AXYGEN公司；PCR反应管0.2mL薄壁管，购自AXYGEN公司。(3)仪器ABI7300荧光定量PCR仪，购自AB公司。实施例2用本发明的试剂盒按照实施例1的方法检测未知样本。未知样本来源XX医院病人待测定的样品，本发明实施例2的试验结果如图2所示，检测结果为阳性，Ct值为23.87。以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。权利要求一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(1).PCR反应酶，其中包括热启动Taq酶、MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂；(2).PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、10×PCRBuffer、肠道病毒71型正向引物、肠道病毒71型反向引物、肠道病毒71型探针；肠道病毒71型正向引物序列为5’-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC-3’，肠道病毒71型反向引物序列为5’-GAGCAATTGTGGGACRAYTTC-3’，肠道病毒71型探针序列为5’-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3’；(3).阴性质控品，为DEPC处理水；(4).阳性质控品，为采用T7RNA聚合酶制备的体外转录RNA。2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型核酸检测试剂盒，其特征在于所述探针5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。3.—种利用权利要求1或2所述的试剂盒检测肠道病毒71型核酸的检测方法，其特征在于，包括下列步骤(1)RNA提取采用商业化病毒RNA提取试剂盒提取；(2)PCRMix配制及分装按22iiL:1PL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，充分混匀，12，OOOrpm离心10s，配制成PCRMix，取出PCR反应管，给每个PCR反应管中加入23iiL上述配制的PCRMix;(3)加样向上述的PCR反应管中分别加入提取的样本RNA，阳性质控品及阴性质控品2iiL，12，000rpm离心10s;(4)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；`42°C45min;95°C2min;`95°C10s，6(TC30s;40个循环；在反应程序的第三步的终了读取荧光值；(5)分析判断Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35-37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。全文摘要本发明公开了一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒含有PCR反应酶，其中包括热启动Taq酶、MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂；PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、10×PCRBuffer、肠道病毒71型正向引物、肠道病毒71型反向引物、肠道病毒71型探针；肠道病毒71型正向引物序列为5′-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC-3′，肠道病毒71型反向引物序列为5′-GAGCAATTGTGGGACRAYTTC-3′，肠道病毒71型探针序列为5′-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3′；阴性质控品，为DEPC处理水；阳性质控品，为制备的体外转录RNA。本发明采用实时荧光定量PCR技术检测肠道病毒71型核酸序列的方法，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。文档编号G01N21/64GK101724716SQ201010105088公开日2010年6月9日申请日期2010年2月2日优先权日2010年2月2日发明者刘自诚,周骋,姚志建,王维,逄键涛申请人:北京爱普益生物科技有限公司