专利名称：基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于中医药技术领域的检测方法，具体涉及一种基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法。
背景技术：
动物的肠道不仅是一个重要的生理器官，也是一个包含许多微生物的复杂的生态环境系统。肠道内相对稳定的微生物群落有助于动物增强抵抗外来有害细菌感染的能力，各种慢性与退行性疾病，如肠易激综合症、肠炎、风湿和类风湿病，以及强直性脊椎症等均与肠道菌群的改变相关。一些药物，尤其是一些中药的作用常与肠道菌有密切的关系。目前已经建立了一些研究肠道菌群变化的研究方法。一种常用的方法是用平板培养肠道菌并用生理生化的检测方法来了解肠道菌群的变化，也是目前临床上常用的检测方法。
经对现有技术的文献检索发现，一种技术是采用平板培养肠道菌并用生理生化指标的检测来了解肠道菌的组成及变化，虽然简单，但平板培养只适合于那些可被培养的微生物，大大少于肠道中实际存在的微生物的种类；而且生理生化反应繁琐且复杂、耗时长。另一种技术是基于16S rDNA的各种检测手段的应用。由于16S rDNA包含了相应细菌种类的系统分类地位的信息，因此以16S rDNA为分析对象可以比较微生物群落的结构组成。例如有人用通用引物对粪便肠道菌群总DNA进行了扩增、克隆、测序，得到一系列rDNA序列信息来研究肠道菌的组成。又发现Suau A，Bonnet R，Sutren M，et al.Direct Analysis of GenesEncoding 16S rRNA from Complex Communities Reveals Many Novel MolecularSpecies within the Human Gut.Applied and Environmental Microbiology.1999，65(11)4799-4807(对人体肠道复杂微生物菌群的16S rRNA基因的直接分析发现了许多新的分子生物学种群。应用与环境微生物学。1999年，第65卷11期，4799-4807页)。这种方法结果准确，但对实验条件要求较高，而且在一定程度上依赖于已建立的16S rDNA的文库，对于要反映整个肠道菌群结构变化来说并不是十分方便，不能做到较快地分析比较肠道菌群结构的差异。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述不足和缺陷，提供一种基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法。使其可以不依靠平板培养以及16SrDNA的方法，快速、准确地直接检测肠道菌群整体结构的变化，用肠杆菌基因间重复序列的聚合酶链式反应(ERIC-PCR)技术，通过比较健康实验动物、模型动物和给药治疗后各阶段的肠道菌群结构的变化，即比较肠道菌群总基因组的ERIC-PCR图谱，通过PCR产物电泳图谱中条带的变化来反映肠道菌群的变化，提供对药物进行评价。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的具体方法如下(1)建立与肠道菌群有关疾病的动物脾虚证模型；(2)收集造模前后以及用药治疗后的实验动物的粪便，并用DNA提取方法提取其中微生物的总基因组DNA；(3)用肠道菌基因间重复序列的聚合酶链式反应ERIC-PCR检测；(4)对得到的造模前后、用药治疗后的ERIC指纹图谱进行比较，提供对药物的筛选评价指标。
以下对本发明的进一步限定塑造与肠道菌群有关疾病的实验动物(小鼠、大鼠或其他)模型，收集新鲜的粪便样品，用适合提取动物粪便的总DNA提取方法提取DNA。
所述的提取DNA方法如下①将0.3～0.5g新鲜粪便样品置于10ml离心管中，加入20倍体积(w/v)PBS液，充分均质化后40g离心5min，取上清，沉淀中再加入等体积PBS液，40g离心5min，取上清，合并两次上清以1000g离心5min，去上清。沉淀用5mlPBS洗涤，重悬后转移入2ml离心管。
②将转入上述2ml离心管的沉淀1400g离心8～10min，去上清，加入裂解液I(150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0)300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300～500μl裂解液II(100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0)及100μl SDS，冰浴5min后再加等体积饱和酚，10000g离心8min，取上清，在上清中加入1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，10000g离心8min。
③取上清再加入1/10体积3M醋酸钠及两倍体积无水乙醇，沉淀2h以上，10000g离心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去离子无菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去离子无菌水后重复氯仿∶异戊醇抽提步骤一次。加入1/10体积3M醋酸钠及两倍体积乙醇沉淀2h以上，离心并干燥沉淀，加100μl去离子无菌水溶解。
所述的步骤(3)是指选用报道的ERIC序列引物，即ERIC 15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC 25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，并确定ERIC-PCR反应的循环程序，ERIC-PCR的反应体系为25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mMdNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2单位；循环程序为94℃5min预变性后进行94℃50s、48℃1min、72℃4min的35个循环，72℃保持8min，完成后，用1.7％琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色，紫外灯下照相，获得DNA指纹图谱。
所述的步骤(4)是指比较实验动物各状态下图谱中DNA条带的变化，即肠道菌群结构的变化，选出与疾病相关的条带作为标准，作为筛选评价待试药物的依据。
本发明将ERIC-PCR技术应用到药物、尤其是中药的药效筛选与评价方面，建立与肠道菌群有关的疾病的动物模型，不经培养直接提取健康、模型等各阶段小鼠粪便样品总DNA，其中DNA分子的种类及相对比例反映了粪便样品中肠道菌群种类数量及种群之间的相对比例，获得的是肠道菌群的总体信息。不同状态下粪便样品DNA分子组成及相对数量不同，ERIC序列在不同基因组DNA分布及拷贝均不相同，这种差异可以反映在ERIC-PCR获得的指纹图谱中。经扩增后得到的ERIC图谱中的每一种条带可以是来自若干不同微生物的基因组DNA片段组成，条带的数目反映微生物类群的多少，每一条带的亮度反映该类群微生物种群数量的多少，由此可以得到粪便中肠道菌的结构信息。分析各种状态下样品的ERIC指纹图谱可以知道疾病以及治疗药物对实验动物肠道菌的影响。
本发明的突出特点是快速且能比较全面地反映肠道菌的变化从粪便中直接提取肠道菌的总DNA并用ERIC-PCR直接进行扩增，较大程度地检测药物对肠道菌群的影响。所涉及的ERIC-PCR应用到药物筛选，尤其是筛选与肠道菌有关疾病的中药中具有简便、快速、有效、灵敏的特点，可以同时分析多个样品并对各个阶段的肠道菌动态变化，得到各个个体的脾虚信息，在对肠道菌DNA指纹图谱的变化进行分析后，找到与疾病有关的DNA条带来作为筛选评价的依据。为筛选与肠道菌有关疾病的中药提供了新的方法。
图1健康小鼠肠道菌总DNA的ERIC-PCR扩增结果其中，1--12不同组别健康小鼠粪便肠道菌总DNA扩增结果；M100bpmarker；NC阴性对照。
图2利血平造模后小鼠粪便细菌总DNA的ERIC-PCR扩增结果其中，1--12不同组别利血平造模后小鼠粪便肠道菌总DNA扩增结果；M100bp marker；NC阴性对照。
图3利血平造脾虚模型组小鼠治疗愈后粪便肠道菌总DNA的ERIC-PCR扩增结果M100bp marker；NC阴性对照组；1，2四君子低剂量组3，4四君子中剂量组；5，6四君子高剂量组；7，8理中汤低剂量组；9，10理中汤中剂量组；11，12理中汤高剂量组。
具体实施例方式
结合发明内容和附图提供实施例目前已证实脾虚证涉及现代医学包括消化、内分泌、免疫、植物神经等系统功能的紊乱和失调。对脾虚证研究的相关检测指标目前约有70余种，其中包括淋巴细胞内蛋白酪激酶(PTK)活力变化，胃粘膜环磷酸酰苷(cAMP)，G细胞(分泌胃泌素)，D细胞(分泌生长抑素)胃粘膜的锌、铜、线粒体Zn、Cu含量等。总体可以分为脾主运化、脾主肌肉、脾虚与血液流变学改变、脾虚与神经、内分泌、微量元素的改变等五方面，其中与消化系统疾病发生的关系最为密切，即脾虚往往伴随着胃肠功能的紊乱，患者往往有慢性腹泻的症状，同时导致肠道正常菌群平衡受到破坏。
对于脾虚证的治疗，中医已有了很长时间的探索，对各种类型的脾虚证有很多有效的治疗方法，其中四君子汤和理中汤是应用范围最广、效果最好的两种复方中药。四君子合剂处方源于宋代《太平惠民和剂局方》之四君子汤，由人参、白术、茯苓、甘草(炙)等药物组成，为中医临床治疗“气虚证”的代表方。理中汤来源于《伤寒论》，能温中祛寒，健脾补气，由党参、干姜、甘草(炙)、白术等药物组成。可以治脾胃消运无力、腹满痞闷或腹痛泻稀便、苔白腻湿润、脉沉无力等症。
本实施例利用利血平塑造昆明种小鼠的脾虚证动物模型，并用传统的脾虚证治疗药物四君子汤及理中汤分为高中低三个剂量组对脾虚模型小鼠进行治疗，收集各阶段的小鼠新鲜粪便，利用前面所述的方法提取粪便中肠道菌群的总DNA，用ERIC-PCR的方法进行扩增，得到在不同状态下的DNA指纹图谱，比较分析图谱上的DNA条带的变化。具体步骤如下1.建立脾虚证小鼠模型。利用利血平塑造昆明种小鼠脾虚模型每日利血平0.3mg/kg腹腔注射，对照组每日腹腔注射等量生理盐水，连续11天；治疗利用传统的治疗脾虚药物四君子汤及理中汤分为高中低三个剂量组分别对脾虚小鼠进行治疗。
2.收集造模前后及用药治疗前后小鼠的新鲜粪便，提取其中的微生物总DNA。
具体方法如下①将0.3新鲜粪便样品置于10ml离心管中，加入6mlPBS液，充分均质化后40g离心5min，取上清，沉淀中再加入等体积PBS液，40g离心5min，取上清，合并两次上清以1000g离心5min，去上清，沉淀用5mlPBS洗涤，重悬后转移入2ml离心管；②将转入上述2ml离心管的沉淀1400g离心8～10min，去上清，加入裂解液I 300μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300μl裂解液II及100μl SDS，冰浴5min后再加等体积饱和酚，10000g离心8min，取上清，在上清中加入1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿∶异戊醇为24∶1，10000g离心8min；③取上清再加入50ml 3M醋酸钠及两倍体积无水乙醇，沉淀2h，10000g离心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去离子无菌水溶解，加入4μl 10％RNase，消化30min，再加入500μl去离子无菌水后重复氯仿∶异戊醇抽提步骤一次，加入50ml3M醋酸钠及两倍体积乙醇沉淀2h，离心并干燥沉淀，加100μl去离子无菌水溶解。
3.用ERIC-PCR对微生物基因组总DNA进行扩增。反应体系及反应程序如下ERIC-PCR的反应体系为25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+ 2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2单位；循环程序为94℃5min预变性后进行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃ 4min的35个循环，72℃保持8min4.对得到的造模前后、用药治疗后的ERIC指纹图谱进行比较，提供对药物的筛选评价指标。
5.结果用所述方法对不同的健康小鼠个体粪便总DNA进行扩增结果(图1)，2800bp、1500bp、900bp、600bp以及300bp的五条条带分别存在于不同的健康实验动物个体中，表明这五个条带可能来源于某些与健康相关的常态菌；对利血平造模后的脾虚小鼠不同个体粪便总DNA进行扩增结果(图2)显示，上述的五条条带中，2800bp和600bp的条带发生了消失，说明某些菌群已经发生了变化。在用治疗药物对利血平组的脾虚小鼠进行治疗后发现，消失的2800bp与600bp条带基本恢复。以上说明两种治疗药物对利血平造脾虚模型小鼠有明显的治疗作用，并且四君子汤治疗组中剂量组的治疗效果较好，而理中汤高剂量组的效果较好。
上面的实验结果充分说明了运用本文所述的方法可以较好地对于与肠道菌群有关的药物，尤其是脾虚治疗中药进行筛选。
权利要求
1.一种基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征在于，具体如下(1)建立与肠道菌群有关疾病的动物脾虚证模型；(2)收集造模前后以及用药治疗后的实验动物的粪便，并用DNA提取方法提取其中微生物的总基因组DNA；(3)用肠道菌基因间重复序列的聚合酶链式反应ERIC-PCR检测；(4)对得到的造模前后、用药治疗后的ERIC指纹图谱进行比较，提供对药物的筛选评价指标。
2.根据权利要求1所述的基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征是，所述的DNA提取方法，具体如下①将0.3～0.5g新鲜粪便样品置于10ml离心管中，加入20倍体积(w/v)PBS液，充分均质化后40g离心5min，取上清，沉淀中再加入等体积PBS液，40g离心5min，取上清，合并两次上清以1000g离心5min，去上清，沉淀用5mlPBS洗涤，重悬后转移入2ml离心管；②将转入上述2ml离心管的沉淀1400g离心8～10min，去上清，加入裂解液I 300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300～500μl裂解液II及100μlSDS，冰浴5min后再加等体积饱和酚，10000g离心8min，取上清，在上清中加入1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿∶异戊醇为24∶1，10000g离心8min；③取上清再加入1/10体积3M醋酸钠及两倍体积无水乙醇，沉淀2h以上，10000g离心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去离子无菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去离子无菌水后重复氯仿异戊醇抽提步骤一次，加入1/10体积3M醋酸钠及两倍体积乙醇沉淀2h以上，离心并干燥沉淀，加100μl去离子无菌水溶解。
3.根据权利要求2所述的基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征是，所述的裂解液I，是指150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0。
4.根据权利要求2所述的基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征是，所述的裂解液II，是指100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0。
5.根据权利要求1所述的基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征是，所述的步骤(3)是指选用报道的ERIC序列引物，即ERIC15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，并确定ERIC-PCR反应的循环程序，ERIC-PCR的反应体系为25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2单位；循环程序为94℃5min预变性后进行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃4min的35个循环，72℃保持8min，完成后，用1.7％琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色，紫外灯下照相，获得DNA指纹图谱。
6.根据权利要求1所述的基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，其特征是，所述的步骤(4)是指比较实验动物各状态下图谱中DNA条带的变化，即肠道菌群结构的变化，选出与疾病相关的条带作为标准，作为筛选评价待试药物的依据。
全文摘要
一种基于分子标记的肠道菌群整体结构变化的检测方法，具体如下建立与肠道菌群相关疾病的动物脾虚证模型；收集造模前后以及用药治疗后的实验动物的粪便，并用DNA提取方法提取其中微生物的总基因组DNA；用肠杆菌基因间重复序列的聚合酶链式反应(ERIC－PCR)检测；对得到的造模前后、用药治疗后的ERIC指纹图谱进行比较，提供对药物的筛选评价指标。本发明的突出特点是快速且能比较全面地反映肠道菌的变化，本发明具有简便、快速、有效、灵敏的特点，可以同时分析多个样品并对各个阶段的肠道菌动态变化，在对肠道菌群总DNA指纹图谱的变化进行分析后，找到与疾病有关的DNA条带来作为筛选评价的依据。为筛选与肠道菌有关疾病的药物，尤其是脾虚治疗中药提供了新的方法。
文档编号G01N21/31GK1603796SQ200410067810
公开日2005年4月6日 申请日期2004年11月4日 优先权日2004年11月4日
发明者李晓波, 孔静, 吴春福 申请人:上海交通大学