一种单细胞捕获通道及单细胞捕获芯片的制作方法

本实用新型属于微通道流体控制领域，涉及一种单细胞捕获通道及单细胞捕获芯片。

背景技术：

细胞是构成生命体的基本单位，开展细胞的研究工作对疾病机理探究、药物研发以及疾病治疗具有重要意义。由于细胞间形态学与遗传学的异质性，基于细胞种群的研究会在一定程度上掩盖单个或少数细胞的某些重要生物学信息。单个细胞之间的显著差异存在于细胞的形态尺寸、基因组、转录组以及蛋白组等方面，而这些差别往往是肿瘤研究、干细胞生物学、免疫学及神经学中很多长期困惑人们的关键所在。单细胞分析可以精确的获取细胞个体之间的差异，有助于深入了解细胞异质性，获得有价值的生物学信息。在单细胞研究中，单个细胞内检测物浓度较低，为了得到具有统计学意义的数据，就需要获得数量足够多的单细胞并用于后续的单细胞分析。因此，如何快速高效获得高通量的单个细胞是进行单细胞分析的关键。

微流控技术基于其结构的微型化、样品的微量化、流体的可控性以及分析的高通量性成为单细胞分析的一个重要平台，基于各种操作步骤的集成，该技术平台可同时完成单细胞的捕获及分析。目前单细胞捕获微流控芯片的几何结构尚且比较复杂，单细胞的捕获通量和捕获效率仍然存在着一定的不足之处。因此，本实用新型提出一种基于流体力学中最小流阻原理的单细胞捕获通道用于单细胞的捕获和原位精准分析。

技术实现要素：

有鉴于此，本实用新型的目的在于提供一种单细胞捕获通道、单细胞捕获芯片及其应用方法，通过设置在单细胞捕获通道内的细胞捕获位点实现单细胞捕获。

为达到上述目的，本实用新型提供如下技术方案：

一种单细胞捕获通道，包括至少一个捕获单元，所述捕获单元包括主通道及捕获通道，所述主通道包括主流道以及分设在主流道两端的入口和出口，所述捕获通道包括细胞腔与宽度窄小的连通腔，所述细胞腔与所述连通腔的结合处内径由宽变窄，形成半圆形或半椭圆形的收缩区域，此收缩区域为细胞捕获位点。

可选的，所述主流道包括第一弯折流道、第二弯折流道以及用于连通第一弯折流道与第二弯折流道的盘曲流道。

可选的，所述第一弯折流道与第二弯折流道对称布置在盘曲流道的两侧，所述盘曲流道设置在第一弯折流道与第二弯折流道之间，整体捕获单元外部形状呈矩形。

可选的，所述盘曲流道呈蛇形，带有至少一个拐点。

可选的，所述捕获通道包括相互连通的细胞腔及连通腔，所述细胞腔与连通腔的连接平面为第一平面；所述连通腔在第一平面内的投影面积小于所述细胞腔在第一平面内的投影面积。

可选的，所述细胞腔在水平面的投影为矩形或圆形结构，并通过圆弧与连通腔相连通。

可选的，所述的捕获单元中捕获通道的细胞腔与主流道的第一弯折流道连通，捕获通道的连通腔与主流道的第二弯折流道连通。

可选的，所述捕获单元为n个，呈线性布置，构成一级捕获流道；第n-1个捕获单元的第一弯折流道连通至所述一级捕获流道的入口，第n个捕获单元的第二弯折流道连通至所述一级捕获流道的出口，其中，n≥2且n为正整数。

可选的，流道上可布置多个并联的所述一级捕获流道，所有一级捕获流道的第一个捕获单元的入口相连通汇聚成总入口，所有一级捕获流道的最后一个捕获单元的出口相连通汇聚成总出口。

可选的，所述单细胞捕获通道由热弹性聚合物、热塑性聚合物以及玻璃材质制成单细胞捕获芯片。

可选的，所述单细胞捕获通道通过微加工方法制成单细胞捕获芯片，微加工方法包括光刻、注塑及3d打印。

一种单细胞捕获芯片，应用上述的单细胞捕获通道。

可选的，基于流体力学最小流阻原理，所述单细胞捕获通道的主通道流阻大于捕获通道流阻。

可选的，适用于核酸恒温和变温扩增。

本实用新型的有益效果在于：

本实用新型中主通道长度可通过盘曲流道的长度和数量进行调整，使主通道的流阻大于捕获通道流阻；

本实用新型中盘曲流道结构避免了主通道长度过长造成通道所需面积的增加，缩小了芯片尺寸；

本实用新型中任意数量的单细胞捕获区域可设置到所述单细胞捕获通道，实现高通道的单细胞捕获。

本实用新型中细胞的动态捕获、定位以及分析等操作单元集成到构建的单细胞捕获芯片上，有利于单细胞分析操作的连续性和一体化。

本实用新型中单细胞捕获芯片基于通道内的表面增强拉曼基底，对单细胞拉曼光谱的进行原位检测。

本实用新型中单细胞捕获芯片基于水凝胶固化或油包水的液滴形成独立的微反应单元，对单细胞进行基因变异检测。

本实用新型的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本实用新型的实践中得到教导。本实用新型的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本实用新型作优选的详细描述，其中：

图1为本实用新型中单细胞捕获芯片的整体结构示意图；

图2为本实用新型中捕获单元的整体结构示意图；

图2a为本实用新型中捕获单元的结构示意图；

图2b为主通道的结构示意图；

图2c为捕获通道的结构示意图；

图3为本实用新型中单细胞捕获通道的整体结构示意图；

图4为本实用新型中单细胞捕获通道内流体速度的仿真分析图；

图5为优化值时每个细胞捕获位点的体积流率比；

图6为本实用新型中多个一级捕获流道并联结构的示意图；

图7为本实用新型中单细胞捕获通道的延伸结构示意图；

图8为本实用新型中单细胞捕获通道的延伸结构示意图；

图9为细胞捕获位点捕获的单细胞；

图10为k562细胞拉曼光谱图；

图11为sw480细胞的kras基因突变检测荧光图；

图12为hcc-827细胞的egfr基因突变检测荧光图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本实用新型的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点与功效。本实用新型还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本实用新型的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本实用新型的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本实用新型的限制；为了更好地说明本实用新型的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

本实用新型实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本实用新型的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本实用新型的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

请参阅图1-图12，附图中的元件标号分别表示：玻璃基底1、pdms层2、入口3、出口4、细胞捕获位点5。

本实用新型中单细胞捕获通道由若干结构相同的捕获单元构成，每一个捕获单元分布着两个细胞捕获位点。如图2所示，每个捕获单元由主通道和捕获通道构成，其中，主通道包括第一弯折流道、第二弯折流道以及连通第一弯折流道与第二弯折流道的盘曲流道，该盘曲流道呈蛇形弯曲结构，捕获通道包括细胞腔与连通腔，细胞腔与主通道的第一弯折流道相连通，连通腔为宽度窄小的矩形通道，与主通道的第二弯折流道相连通，细胞腔与连通腔的结合处内径由宽变窄，形成呈半圆形或半椭圆形的收缩区域，此收缩区域为细胞捕获位点。在所述的单细胞捕获通道中，连通腔的宽度w1，连通腔的长度l1，细胞腔的直形通道长度l2，盘曲流道相邻拐点之间的直形通道的长度l4，整体流道的宽度w2以及整体流道的深度h。所述的单细胞捕获通道可由光刻、注塑及3d打印等微加工制成玻璃、塑料以及聚合物材质的芯片，这里以制备的聚合物pdms芯片为例对单细胞捕获芯片进行详细的说明。如图1所示，该芯片由pdms层和玻璃基底两层构成，上层pdms层含有单细胞捕获通道结构，经氧等离子体处理与下层玻璃基底键合。

本实用新型中细胞从所述单细胞捕获通道的一端a到另一端b有路径1和路径2两种路径，如图3所示，路径1与路径2的流道压降相同，矩形截面微通道中的流阻可近似为：

其中，r为流体通道的流阻，l为通道长度，w为通道宽度，h为通道高度，μ为流体动力粘性系数。

对于路径1，通道的流阻为细胞腔与连通腔的流阻之和，压降主要发生在捕获通道宽度窄小的连通腔，细胞腔部分的通道长度为0.5w2+l2，宽度为w2，连通腔部分的长度为l1，宽度为w1，通道深度均为h，因此，路径1流体通道的流阻可表示为：

相对于路径1，路径2具有较长的流体通道和较大的流阻，其由直形通道a-c、c-d以及蛇形弯曲通道d-b三部分组成，宽度均为w2，高度为h，其中，直形通道a-c的长度为la-c，其与w2有关，c-d的长度为lc-d，其与w2、l2及l1有关，蛇形弯曲通道d-b的长度为ld-b，其与w2与l4有关，因此，路径2流体通道的流阻可表示为：

细胞由a到b的路径1和路径2压降相等，且δp＝qr，其中q为流体通道体积流率，即单位时间内通过单位横截面积的流体体积，q1为路径1捕获通道的体积流率，q2为路径2主通道的体积流率比，联合公式(1)和公式(2)得q1与q2的比值，

本实用新型的单细胞捕获流道需要捕获通道的流阻低于主通道流阻，即r1<r2，由于压降相同，体积流率与流阻成反比，即q1/q2>1，此时细胞优先流向捕获通道，在细胞捕获位点被捕获。由公式(3)可以看出q1/q2比值取决于微通道的几何形状和尺寸，因此，本实用新型对通道几何尺寸进行优化使q1/q2>1，细胞优先进入路径1的捕获区域被捕获在细胞捕获位点，当捕获位点有细胞占据后，捕获通道的流阻会急剧增加，使得q1/q2<1，通道内的其他细胞会绕过该捕获位点流动，这保证了每个捕获位点仅仅捕获一个细胞，获得单细胞的捕获效果。

基于上述的单细胞捕获理论基础，对通道各几何尺寸进行优化，使捕获通道的流阻小于主通道流阻对细胞进行捕获，通过捕获细胞引起捕获通道阻力大小的动态变化实现细胞的依次捕获，形成高通量的单细胞阵列。本实用新型中细胞悬液注入到微通道，在细胞捕获位点将细胞捕获，最后废液由出口流出。与捕获通道相比，主通道具有较长的流体通道，因此主通道具有较大的流阻，细胞悬液易于流向捕获通道，捕获通道的结构尺寸小于细胞直径时，细胞就会卡在捕获通道的捕获位点处；当细胞在捕获位点捕获后，捕获通道因被细胞阻塞流动阻力急剧增加，超过了主通道的流阻，此时细胞悬液就会绕过已经捕获细胞的捕获通道继续向前流动至下一个捕获位点。通过这种循环往复的细胞捕获过程，细胞依次被捕获到各个细胞捕获位点形成单细胞捕获阵列。

本实用新型的单细胞捕获通道对细胞捕获的关键在于微通道几何尺寸，由公式(3)可得所述单细胞捕获通道主要受以下6个关键几何尺寸的影响：连通腔的宽度w1，连通腔的长度l1，细胞腔的直形通道长度l2，盘曲通道相邻拐点之间的直形通道长度l4，通道宽度w2以及整体通道深度h。本实用新型中h和w2应大于细胞直径，保证细胞在通道内的顺利流动，避免通道的堵塞，同时，h和w2比细胞尺寸过大时，多个细胞会同时流向一个捕获位点，造成捕获位点多个细胞的捕获。另外，所述单细胞捕获通道的主通道长度可通过l4的长度和盘曲通道的数量进行任意调整，使主通道的流阻大于捕获通道的流阻。本实用新型中宽度窄小的连通腔对捕获通道的流阻大小有显著影响，一方面只有当连通腔宽度w1小于细胞尺寸，细胞才能卡在缩口处，捕获在单细胞捕获通道的捕获位点；另一方面，随着连通腔宽度w1的减小，捕获通道的流阻会逐渐增加，此时需要更长的主通道才能满足捕获通道的流阻小于主通道的流阻。

本实用新型中采用数值仿真的手段对所述的单细胞捕获通道的几何尺寸进行优化，具体的是采用多物理场有限元分析软件comsolmultiphysics对各个几何尺寸的三维几何模型中的流体进行研究。仿真模型中，所述单细胞捕获通道包含5个捕获单元，即10个细胞捕获位点，入口流率为37.5nl/min，出口压力设定为0，其他的边界设定为无滑移边界条件。仿真过程中这里假定流体为不可压缩流体，流体的密度和黏度分别为1000kg/m³、0.001pa·s。通过求解动量方程方程和连续性方程，得到流体在通道中的速度分布，如图4所示，可以看出捕获通道具有较高的流速，根据体积流率可表示为速度与通道横截面的面积的乘积，可得到不同几何尺寸捕获通道与主通道体积流率比。本实用新型中利用有限元分析方法获得了各个几何尺寸对所述单细胞捕获通道中各个捕获区域流率比的影响，即l1、l2及w2的增加和l4的减小都可以使q1/q2的比值增加。通过仿真结果的对比分析，获得一组优化值：w2＝h＝25um，l1＝10um，l2＝30um，l4＝55um，w1＝6um，此尺寸条件下所述单细胞捕获通道中相应的10个细胞捕获位点所对应的流率比如图5所示。

另外，为了进一步获得高通量的单细胞捕获效果，所述的单细胞捕获通道可包括n个所述捕获单元，呈线性布置，构成一级捕获流道；第n-1个捕获单元的第一弯折流道连通至所述一级捕获流道的入口，第n个捕获单元的第二弯折流道连通至所述一级捕获流道的出口，其中，n≥2且n为正整数。同时流道上可布置多个并联的所述一级捕获流道，所有一级捕获流道的第一个捕获单元的入口相连通汇聚成总入口，所有一级捕获流道的最后一个捕获单元的出口相连通汇聚成总出口，如图6所示。

本实用新型所述的单细胞捕获通道可根据实验需要对细胞腔结构进行变化，如图7和图8所示，捕获单元中的细胞腔可呈圆形结构用于单细胞基因突变检测，结合通道流阻和毛细作用，细胞捕获后通入油相在细胞腔形成油包水结构，该圆形的细胞腔结构可减小流体对捕获位点细胞的剪切力，使细胞保留在水相中进行后续的pcr反应，同时该圆形细胞腔结构可以充分满足单细胞扩增所需要的试剂体积，也有效的避免了由于试剂的用量造成整个捕获通道长度的增加。

实施例1

本实施例基于所实用新型的单细胞捕获通道对hela细胞株进行捕获。hela细胞的直径约为20um左右，所述单细胞捕获通道的主通道的宽度和深度定为25um。基于comsol数值仿真的结果，得到所述单细胞捕获通道其余的几何尺寸为l1＝10um，l2＝30um，l4＝55um，w1＝6um。将所述的单细胞捕获通道制作成单细胞捕获芯片，其包括100个单细胞捕获位点。配制一定浓度的hela细胞悬浮液，将细胞悬浮液注入所述单细胞捕获通道内对细胞进行捕获。基于良好的芯片通道几何尺寸设计，实验过程中细胞在细胞位点依次捕获，细胞占据细胞捕获位点后，其余的细胞绕过该捕获位点继续运动，获得了好的单细胞阵列。图9为实验过程中细胞捕获位点捕获的单细胞。

实施例2

本实施例基于表面增强拉曼光谱检测技术，以通道内银纳米溶胶作为表面增强拉曼散射的基底，以肿瘤细胞株k562为靶细胞，利用所述的单细胞捕获通道将细胞捕获在细胞捕获位点形成单细胞阵列，对捕获单细胞的拉曼光谱进行原位检测。

具体步骤如下：(1)将一定浓度的k562细胞悬液注入通道内，使细胞捕获到各个捕获位点形成单细胞阵列；

(2)通入银纳米溶胶，银纳米溶胶在细胞捕获区域与细胞接触，基于细胞表面的银溶胶形成的表面增强拉曼基底，利用拉曼光谱仪对单细胞的拉曼信号进行原位测定，测得的细胞拉曼光谱如图10所示。

实施例3

本实施例基于固相数字pcr技术平台，以携带有kras基因第12/13位密码子错义突变的肿瘤细胞株sw480为靶细胞，利用所述的单细胞捕获通道将细胞捕获在细胞捕获位点形成单细胞阵列，通过水凝胶固化使各个捕获位点的细胞形成独立的微反应单元，对捕获的单细胞进行基因突变检测。

具体步骤如下：(1)配制gelma水凝胶(含光引发剂lap)、细胞裂解液和pcr预混液(包含pcr聚合酶、dntp、pcr荧光探针、引物等)的混合液，将sw480肿瘤细胞悬浮到配制的20ul混合液中。然后将细胞溶液注入到所述单细胞捕获通道，使细胞捕获到各个捕获位点；(2)用蓝光手电筒照射芯片表面，使通道内的水凝胶固化形成网状结构，由于水凝胶的阻滞效应，固化的水凝胶可以抑制单细胞扩增时dna线性分子的扩散，形成独立的微反应单元；(3)加热，将细胞裂解，然后将所述单细胞捕获芯片放到原位杂交仪进行反应，反应条件为：50℃、2min，95℃、2min，95℃、15s，60℃、60s，50个循环，待反应完成后，将芯片置于芯片扫描仪下观察荧光。图11为sw480肿瘤细胞扩增产物的荧光图，其中绿色荧光代表所捕获的sw480肿瘤细胞含有kras基因突变。

本实施例利用微通道内水凝胶的固化实现了对单细胞的原位dna扩增，该方法集单细胞的捕获与基因突变检测于一体，大大缩短了检测时间，提高了检测特异性，并且恒温扩增也同样适用于该实施例中基因变异检测。

实施例4

本实施例基于微液滴平台的数字pcr技术，以携带有egfr基因第19外显子缺失突变的细胞株hcc-827为靶细胞，利用所述的单细胞捕获通道将细胞捕获在捕获位点形成单细胞阵列，并通过油相形成包裹单细胞和反应液的微液滴反应单元，对捕获的单细胞进行基因突变原位检测。

具体步骤如下：(1)配制包含检测egfr基因第19外显子缺失突变的pcr反应液，pcr反应液包括酶、dntps、引物和标记有羧基荧光素(fam)的探针等，将hcc-827细胞株加入pcr反应液和细胞裂解液混合溶液。将配制的细胞悬液注入所述的单细胞捕获通道，利用最小流阻原理将细胞捕获到各捕获位点；(2)配制油相：0.1％的聚甘油-4异硬脂酸酯、90％的碳酸二乙基己酯和9.9％的石蜡油。将配制的油相溶液注入通道，基于所述单细胞捕获通道的捕获位点所具有的特定几何结构，在通道流阻和毛细作用下，油相可以将各个捕获位点的细胞及其周围的pcr反应溶液包裹，形成多个互相独立的pcr微反应单元；(3)加热，将微液滴中包裹的细胞裂解，然后将芯片放到原位杂交仪进行反应，反应条件为：50℃、2min，95℃、2min，95℃、15s，60℃、60s，50个循环；待反应完成后，置于芯片扫描仪或者荧光显微镜下观察fam荧光，结果如图12所示。从图中可以观察到，几乎每个细胞捕获位点均能观察到fam荧光，这表明所述的单细胞捕获芯片不仅具有较高的单细胞捕获效率，还适用于对单细胞基因变异检测，且恒温扩增也同样适用于该实施例中基因突变检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围当中。