1.本发明涉及用于在酵母中高表达蛋白质的重组载体。具体而言，本发明涉及用于工业和治疗用途的用于同源和异源蛋白质的组成型表达的具有启动子序列和终止子序列的载体。2.
背景技术：
：：和相关技术的描述3.马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)是酵母目(saccharomycetales)酵母的成员。马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)具有工业用途所需的各种理想特性，例如在任何真核生物中最快的生长速度(倍增时间约为70分钟)，耐热性(能够生长至52℃)，高分泌能力和同化糖类(诸如葡萄糖、木糖、乳糖和菊粉)的能力。这些显著的特性使该菌株成为各种常见工业生物技术应用的最佳选择之一，例如酶的生产和酒精发酵(nonklang等人,2008),(fonseca等人,2008)。马克斯克鲁维酵母在高温下生长的能力对发酵工业具有特别高的价值，因为它降低了冷却成本以及潜在的污染风险。4.已经尝试从各种酵母菌株中表达异源蛋白质并分离小分子，例如乳酸和木糖醇(bae等人，2017；kim等人，2015；zhang等人，2015；zhang等人，2014)。5.为了在马克斯克鲁维酵母中表达异源蛋白，许多研究采用了源自酿酒酵母(s.cerevisiae)的启动子，例如半乳糖激酶(gal1)(almeida等人,2003)、甘油醛-3-脱氢酶(tdh3)(nonklang等人,2009)和3-磷酸甘油酸酯激酶(pgk1)(ball等人，1999；pecota等人，2007)。在这些启动子中，gal1启动子是半乳糖可调节的，其他如tdh3和pgk是组成型表达的。tdh3和pgk是已尝试用于蛋白质表达的马克斯克鲁维酵母起源的强启动子。(yang等人，2015年)。6.启动子强度(adh1、tdh3和pgk)的比较研究表明，马克斯克鲁维酵母的天然启动子比酿酒酵母的相应启动子更强(yang等人,2015)，这为进一步探索马克斯克鲁维酵母的天然启动子奠定了基础。7.菊粉酶启动子(inu1)和gal1是马克斯克鲁维酵母起源的强启动子，但启动子强度取决于碳源，并且在高葡萄糖浓度下会下调(bergkamp等人，1993，gao等人，2015，liu等人，2013,akada等人，2014美国专利8,846,343)。总体而言，只有有限数量的启动子可用于将马克斯克鲁维酵母用作蛋白质表达的宿主菌株，因此迫切需要鉴定比目前已知的强度更高的新启动子。8.对于异源蛋白的高表达，终止子在增加mrna半衰期和改善基因表达方面发挥重要作用(curran等人，2013)，但在马克斯克鲁维酵母中，表达载体中使用的大多数终止子是来自酿酒酵母的cyc。因此，还需要鉴定比目前已知的新的强终止子。9.在本发明中，使用具有和不具有天然终止子的各种启动子，详细研究在酵母中具有高蛋白质表达的载体。本发明提供了新的启动子和终止子，其在迄今为止未知的用于马克斯克鲁维酵母的任何其他表达载体中强度最高。本发明可用于有效且经济地生产同源和异源蛋白质。10.本发明的目的11.综上所述，本发明的首要目的是提供一种在酵母中高表达蛋白质的重组载体，其启动子和终止子均从马克斯克鲁维酵母中鉴定，用于高表达同源和异源蛋白质。12.本发明的另一个目的是开发具有来自马克斯克鲁维酵母的启动子和终止子的组合的载体，用于使用具有不同碳源例如葡萄糖(dextrose)和木糖的生长培养基来高表达同源和异源蛋白质。13.然而，本发明的另一个目的是开发组成型高表达启动子，而不需要额外的分子来诱导蛋白质表达。技术实现要素：14.本文提供了用于高蛋白表达的重组载体。在本发明的一个方面，本发明提供了一种具有启动子序列和终止子序列的重组载体，用于同源和异源蛋白质的组成型表达，其中启动子序列选自由seqidno:1和seqidno:2组成的组以及终止子序列具有选自由seqidno:3和seqidno:4组成的组的序列。15.在本发明的一方面，本发明提供的启动子序列包含与seqidno:1或seqidno:2具有至少70％同源性的序列。16.在本发明的又一方面，本发明提供了用于在马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母中表达蛋白质的载体。17.在本发明的另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其编码在其5'端连接到编码egfp或荧光素酶的dna。在本发明的另一个方面，本发明提供了一种编码终止子的表达载体，该终止子与编码egfp或荧光素酶的dna在其5'端连接。18.在本发明的又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含用于在20℃至45℃的温度下在马克斯克鲁维酵母和其他酵母细胞中表达同源和异源基因的表达载体。19.附图的简要说明20.图1是用于克隆的质粒构建体和限制性位点的示意图。用于启动子的限制性位点是saci和xbai。用于终止子的限制性位点是xhoi和kpni。使用限制性位点bamhi和xhoi克隆编码所需蛋白质的基因。21.图2表示新载体pkmdsh1(mtcc25226)，编码imtcp1启动子和imtt1终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点sac1和xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点xhoi和kpn1之间。fluc基因被亚克隆在限制性位点bamhi和xhoi之间。22.图3表示新载体pkmdsh2(mtcc25227)，编码imtcp1启动子和imtt2终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点sac1和xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点xhoi和kpn1之间。fluc基因被亚克隆在限制性位点bamhi和xhoi之间。23.图4表示新载体pkmdsh3(mtcc25228)，编码imtcp2启动子和imtt1终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点sac1和xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点xhoi和kpn1之间。fluc基因被亚克隆在限制性位点bamhi和xhoi之间。24.图5表示新载体pkmdsh4(mtcc25229)，编码imtcp2启动子和imtt2终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点sac1和xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点xhoi和kpn1之间。fluc基因被亚克隆在限制性位点bamhi和xhoi之间。25.图6表示在马克斯克鲁维酵母中不同启动子控制下的gfp的表达水平。含有在指定启动子控制下编码egfp的质粒的马克斯克鲁维酵母菌株在以葡萄糖作为碳源的合成培养基中在30℃和45℃下生长，或在以木糖作为碳源的合成培养基中在30℃下生长。将过夜生长的细胞在含有葡萄糖作为碳源的二次合成生长培养基中在30℃和45℃下或木糖作为碳源在30℃下进行继代培养。细胞在指定温度下生长，直到o.d.600nm达到约1。通过以4000g离心10分钟来收获细胞。裂解细胞并使用抗gfp抗体在免疫印迹上探测裂解物。26.图7表示在以葡萄糖为碳源的生长培养基中培养的马克斯克鲁维酵母中，由指定的启动子和终止子组合表达的荧光素酶的活性。在指定的启动子和终止子组合的控制下，用编码萤火虫荧光素酶的质粒转化马克斯克鲁维酵母细胞。在含有葡萄糖(s.d.)的合成培养基中过夜生长的细胞(在30℃下)在新鲜的s.d.中进行继代培养。细胞生长直至细胞o.d600nm达到约1。通过离心收集细胞，用蒸馏水洗涤并重悬于sd培养基中。为了监测荧光素酶活性，将50μl1mg/mld-荧光素(sigma)溶液添加到200μl0.3o.d600nm细胞悬液中，并在多模式酶标仪(tecaninfinitem200pro，瑞士)中监测发光的增加。27.图8表示在以葡萄糖为碳源的生长培养基中培养的酿酒酵母中，由指定的启动子和终止子组合表达的荧光素酶的活性。在指定的启动子和终止子组合的控制下，用编码萤火虫荧光素酶的质粒转化酿酒酵母细胞。将在30℃液体s.d.培养基中过夜生长的细胞继代培养到新鲜的s.d.中。细胞生长直到o.d.600nm达到约1。通过离心收集细胞，用蒸馏水洗涤并重悬于s.d.培养基中。为了监测荧光素酶活性，将50μl1mg/mld-荧光素(sigma)添加到200μl0.3o.d.600nm细胞悬液中，并使用多模式酶标仪(tecaninfinitem200pro，瑞士)监测发光的增加。28.发明的简要描述29.对实施方案进行了足够详细的描述以使本领域的技术人员能够实践这些实施方案，并且应当理解，在不脱离实施方案的范围的情况下可以进行逻辑的、机械的和其他的改变。因此，以下详细描述不应被理解为限制性的。30.本发明提供了用于在酵母中高表达蛋白质的重组载体的开发。本发明提供了使用强启动子和终止子用于在酵母中高表达蛋白质的载体，以鉴定用于高表达同源或异源蛋白质的启动子和终止子。31.为了鉴定强启动子序列，广泛分析了在各种生长条件下生长的马克斯克鲁维酵母细胞的大规模转录组学数据。检查的不同生长条件是(i)使用葡萄糖作为碳源在30℃下在震荡下生长(ii)使用葡萄糖作为碳源在30℃下在静态条件下生长(iii)使用葡萄糖作为碳源在45℃下在震荡条件下生长和(iv)使用木糖作为碳源在30℃下在震荡条件下生长(lertwattanasakul等人，2015年)。从转录组学数据中，选择了一些高表达基因来检查其相应启动子的活性。32.gfp用作报道基因，并在鉴定的启动子的控制下表达。通过用抗gfp抗体进行免疫印迹监测荧光及其表达水平来检查gfp丰度。通过用抗gfp抗体使用免疫印迹来检查在选定启动子的控制下表达的gfp的丰度。从这些实验中，分离出允许gfp最高表达的启动子元件。此外，使用基于监测马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母中发光增加的萤火虫荧光素酶活性测定法以检查分离的启动子及其相应终止子的各种组合支持在马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母中高表达的能力。33.本发明提供了两个启动子，包括imtcp1和imtcp2。imtcp1是基因id：34713725的1000bp上游序列。imtcp2位于基因id:34716166.34716166上游1000bp。与马克斯克鲁维酵母的任何其他已知天然启动子inu1、eno1、tdh3和pgk1相比，这两个启动子都具有强活性(图6)。34.在一个实施方案中，表达在不同终止子序列如imtt1和imtt2的控制下得到改善。imtt1是基因id：34713725的269bp下游序列。imtt2是基因id：34716166的290bp下游序列。imtt1和imtt2与imtcp1或imtcp2结合使用来表达编码萤火虫荧光素酶的基因。通过测量发光作为荧光素酶活性的报道子来检查在imtcp1或imtcp2启动子与不同终止子的组合控制下表达的萤火虫荧光素酶的细胞丰度。35.在另一个实施方案中，提供了用于蛋白质的高水平表达的启动子和终止子的组合：(1)imtcp1和imtt1(2)imtcp1和imtt2(3)imtcp2和imtt1(4)imtcp2和imtt2。36.在另一个实施方案中，imtcp1启动子由seqidno:1表示或与seqidno:1具有至少约70％或更多的同一性，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母之外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有启动子活性。37.一种多核苷酸，其在由seqidno:1表示的多核苷酸中具有至少一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有启动子活性。38.在另一个实施方案中，imtcp2启动子由seqidno:2表示或与seqidno:2具有至少约70％或更多的同一性，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有启动子活性。一种多核苷酸，其在由seqidno:2表示的多核苷酸中具有至少一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有启动子活性。39.在另一个实施方案中，本发明的启动子位于表达载体上，在与限制性位点相邻的异源多核苷酸的正确阅读框或翻译起始密码子中。40.在另一个实施方案中，本发明提供了终止子的多核苷酸序列：imtt1终止子由seqidno:3表示或与seqidno:3具有至少约70％或更多的同一性，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有终止子活性。一种多核苷酸，其在由seqidno:3表示的多核苷酸中具有至少一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加，并且在马克斯克鲁维酵母和除了马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有终止子活性。41.在另一个实施方案中，imtt2终止子由seqidno:4表示或与seqidno:4具有至少约70％或更多的同一性，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有终止子活性。一种多核苷酸，其在由seqidno:4表示的多核苷酸中具有至少一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加，并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母外的至少一种或多种酵母如酿酒酵母中具有终止子活性。42.本发明的终止子的多核苷酸序列位于表达载体上，在异源多核苷酸下游或位于邻近限制性位点的基因的终止密码子之后。43.在另一个实施方案中，提供了本发明的杂合载体，其具有在本发明的seqidno:1、seqidno:2的启动子和seqidno:3、seqidno:4的终止子控制下的一个或多个dna插入序列或由dna序列或基因编码的所需多肽。本发明的载体编码特征在于，例如用于克隆dna的合适限制性位点、在宿主中的复制、选择性遗传标记、酵母复制起点。44.本发明的质粒具有马克斯克鲁维酵母来源的自主复制片段(ars)，用于在转化后在宿主细胞中维持。多核苷酸序列中的启动子和终止子活性使用报道基因测定法来评估，该报道测定法测量被亚克隆在启动子和终止子之间的基因产物的稳态水平。在报道基因测定中，编码蛋白质产物的报道基因在启动子和在其3'端的终止子序列的控制下表达。报道基因(编码报道蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)(bierhuizen等人,1997)和荧光素酶(himes和shannon,2000))被克隆在杂合质粒的启动子和终止子之间。质粒被转化到酵母宿主中，表达的蛋白质的丰度可以使用生化测定或用适当抗体在免疫印迹上测量。45.在一个实施方案中，本技术提供了马克斯克鲁维酵母启动子pimtcp1和pimtcp2(如seqidno:1和seqidno:2所示)。启动子的强度与已知的马克斯克鲁维酵母启动子(inu1、eno1、tdh3和pgk1)比较。通过测量在各种启动子控制下表达的egfp的稳态水平来比较启动子强度。首先，将编码egfp的基因亚克隆到酿酒酵母cyc终止子的核苷酸序列的5'端。46.在本发明的另一个实施方案中，将本发明的启动子imtcp1，imtcp2，和其他已知启动子亚克隆到编码egfp的基因的5'端，从而设计出含有核苷酸盒例如pimtcp1-egfp-tcyc、pimtcp2-egfp-tcyc、pinu1-egfp-tcyc、peno1-egfp-tcyc、ptdh3-egfp-tcyc和ppgk1-egfp-tcyc的各种表达载体。将设计的载体转化到马克斯克鲁维酵母的ura3(尿嘧啶营养缺陷型菌株)营养缺陷型菌株中。47.在另一个实施方案中，将转化体选择到不含尿嘧啶的固体sd(sabouraud琼脂)琼脂平板上。汇集获得的4-5个转化体，并在30℃下在s.d.培养基中生长。将过夜生长的培养物稀释100倍到含有葡萄糖或木糖作为碳源的新鲜生长培养基中，培养物在30-45℃下生长。至对数中期，离心收集细胞，用pbs缓冲液洗涤。细胞被裂解，全细胞裂解物中等量的总蛋白用于通过抗gfp抗体在免疫印迹上检测蛋白表达。48.在本发明的一个实施方案中，提供了一种具有启动子序列和终止子序列的重组载体，用于同源和异源蛋白质的组成型表达，其中启动子序列选自由seqidno:1和seqidno:2组成的组以及终止子序列具有选自由seqidno:3和seqidno:4组成的组的序列。49.在另一个实施方式中，本发明提供的启动子序列包含与seqidno:1或seqidno:2具有至少70％同源性的序列。50.在本发明的另一实施方案中，本发明提供的终止子序列包含与seqidno:3或seqidno:4具有至少70％序列同源性的序列。51.在另一个实施方案中，本发明提供了一种载体，该载体选自包含用于在马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母中表达蛋白质的载体的组。52.在又一个实施方案中，本发明提供了与编码选自包含诸如egfp和荧光素酶的蛋白质的组的任何蛋白质的dna连接的启动子和终止子序列。53.在又一个实施方案中，本发明提供了用于在酵母中表达同源和异源基因的表达载体，其中所述酵母选自包含马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的组。54.在又一个实施方案中，本发明提供了具有重组载体的宿主细胞。55.在一个实施方案中，本发明提供了一种分离具有高于任何其他已知马克斯克鲁维酵母启动子的活性的启动子的方法。56.在另一个实施方案中，本发明使用体内荧光素酶测定进一步验证和量化启动子和终止子的不同组合的强度。在各种设计的ppkm316fluccyc中，编码egfp的基因被来自萤火虫(photinuspyralis)的编码荧光素酶(fluc)的基因取代。57.在另一个实施方案中，cyc终止位点被新鉴定的终止子imtt1和imtt2取代。58.在另一个实施方案中，提供了启动子和终止子的不同组合，例如pimtcp1-fluc-timtt1、pimtcp1-fluc-timtt2、pimtcp2-fluc-timtt1和pimtcp2-fluc-timtt2。将启动子的强度与先前已知的强启动子pgk与终止cyc的结合进行比较。59.在另一个实施方案中，包含这些盒的多核苷酸被克隆到质粒ppkm316中。得到的质粒被单独转化到马克斯克鲁维酵母中。转化体在液体生长培养基中生长。过夜生长的细胞在新鲜生长培养基中稀释100倍，并在30℃下进一步生长直至对数中期。通过离心收集细胞并重新悬浮在酵母氮源基础(ynb)培养基中。通过监测发光来测量荧光素酶表达。将50μl1mg/mld-荧光素添加到200μl0.3o.d细胞中，并在多模式酶标仪(tecaninfinitem200pro，瑞士)中测量发光。60.在本发明的另一个实施方案中，与先前已知的启动子和终止子相比，启动子和终止子的组合提供了高强度的蛋白质表达。与先前已知的启动子pgk1和终止子cyc表达的组合相比，启动子imtcp2和终止子imtt1的组合显示出最高的表达强度(图7)。61.在本发明中，在酿酒酵母中比较了来自马克斯克鲁维酵母的启动子和终止子和常用的酿酒酵母启动子如gpd和常用的酿酒酵母终止子cyc。可以将合适的启动子和转录终止子克隆到穿梭载体中，并转化到酵母细胞中。构建了启动子和终止子的不同组合，例如pimtcp1-fluc-timtt1(启动子imtcp1和终止子imtt1)、pimtcp1-fluc-timtt2(启动子imtcp1和终止子imtt2)、pimtcp2-fluc-timtt1(启动子imtcp2和终止子imtt1)、pimtcp2-fluc-timtt2(启动子imtcp2和终止子imtt2)和s.c.gpd-fluc-tcyc(启动子gpd和终止子cyc)。这些构建体被亚克隆到像prs316这样的穿梭载体中。将具有这些构建体的设计质粒转化到酿酒酵母菌株by4741中。细胞在30℃下在液体生长培养基中生长。收集细胞，并重新悬浮在ynb培养基中。通过监测发光来测量荧光素酶表达。将50μl1mg/mld-荧光素添加到200μl0.3o.d细胞中，并在多模式酶标仪(tecaninfinitem200pro，瑞士)中测量发光。62.因此，本发明提供了本发明的启动子和终止子的组合在酿酒酵母中具有活性或与先前已知的酿酒酵母中的启动子和终止子的组合相比具有高强度的蛋白质表达(图8)。实施例63.本发明在以下实施例中进一步定义。应当理解，这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。以下实施例是为了说明而给出的，因此不应解释为限制本发明的范围。64.实施例165.尿嘧啶营养缺陷型马克斯克鲁维酵母的构建66.构建了马克斯克鲁维酵母尿嘧啶营养缺陷型以使用尿嘧啶作为选择标记。为此，设计了与马克斯克鲁维酵母ura3基因上游250个碱基对(bp)和下游250bp同源的dna序列，并从genscriptusa，inc合成了具有设计dna序列的盒。将该盒转化到马克斯克鲁维酵母(nbrc1777)中并且所需的尿嘧啶营养缺陷型是根据它们在含有5-氟乳清酸(5-fluorooroticacid)(5-foa)的固体生长培养基上生长的能力来选择的。67.实施例268.2.1表达载体的制备69.整合穿梭载体质粒prs306(atcc77141)用作构建重组酵母表达载体的骨架。首先，使用分别由马克斯克鲁维酵母的ars/cen起始序列上游40bp和下游40bp的核苷酸组成的正向和反向引物，从马克斯克鲁维酵母菌株nbrc1777的基因组dna中扩增出自主复制序列/着丝粒序列(ars/cen)的1265个dna碱基。通过转移-pcr方法(erijman等人,2011)将纯化的扩增产物插入载体prs306(addgene#15831)中。得到的表达载体称为ppkm316。70.2.2ppkm316-egfp-tcyc的构建71.将编码增强型绿色荧光蛋白(egfp)的基因亚克隆到质粒ppkm316中。对应于egfp(addgene#40822)的orf用限制性内切核酸酶bamhi和xhoi消化，随后连接到载体pkm316(用相同的限制性内切核酸酶消化)以构建ppkm316-egfp。来自酿酒酵母的cyc终止子用限制性内切核酸酶xhoi和kpni消化，然后在编码egfp的基因的3'末端连接到ppkm316-egfp中，以构建ppkm316-egfp-tcyc。72.2.3将启动子序列插入ppkm316-egfp-tcyc73.使用启动子特异性正向和反向引物从马克斯克鲁维酵母菌株nbrc1777的基因组dna中pcr扩增编码启动子如imtcp1、imtcp2、inu1、eno1、tdh3和pgk1的dna序列。用限制性内切核酸酶saci和xbai消化扩增的dna序列。将消化产物连接到ppkm316-egfp-tcyc中以构建载体ppkm316-pimtcp1-egfp-tcyc、ppkm316-pimtcp2-egfp-tcyc、ppkm316-pinu1-egfp-tcyc、ppkm316-peno1-egfp-tcyc、ppkm316-ptdh3-egfp-tcyc和ppkm316-ppgk1-egfp-tcyc。74.实施例375.通过蛋白质印迹分析egfp的启动子强度76.对nbrc1777的全细胞提取物进行egfp的蛋白质印迹分析：所述nbrc1777为含有如ppkm316-pimtcp1egfp-tcyc、ppkm316-pimtcp2-egfp-tcyc、ppkm316-pinu1-egfp-tcyc、ppkm316-peno1-egfp-tcyc、ppkm316-ptdh3-egfp-tcyc和ppkm316-ppgk1-egfp-tcyc的质粒的δura3菌株。77.阳性细胞在ynb+葡萄糖(s.d.)培养基中于30℃生长。在0.05o.d.600nm处将过夜生长的原代培养物重新接种到ynb+葡萄糖和ynb+木糖(s.x.)培养基中，并在30–45℃下进一步生长至对数中期。在这个阶段，通过离心收集细胞，用1xpbs缓冲液洗涤。使用玻璃珠通过机械搅拌裂解细胞。对于免疫印迹，来自全细胞裂解物的10μg总蛋白在12％sds聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并通过电印迹转移到pvdf膜上。1:5000稀释度的抗gfp小鼠抗血清(catno.ma5-15256；thermofisherscientific)随后与1:5000稀释度的与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体进行二次孵育。(cat.no.7076；cellsignalingtechnology,inc.)。78.实施例479.使用荧光素酶测定检查启动子强度80.为了进一步检查启动子强度，使用限制性位点bamhi和xhoi将萤火虫(photinuspyralis)的荧光素酶基因(fluc)(addgene#24942)亚克隆到启动子ppkm316-pimtcp1-fluc-timtt1(pkmdsh1)、ppkm316-pimtcp1-fluc-timtt2(pkmdsh2)、ppkm316-pimtcp2-fluc-timtt1(pkmdsh3)、ppkm316-pimtcp2-fluc-timtt2(pkmdsh4)和ppkm316-ppgk1-fluc-tcyc1的下游。将构enhancingterminatorsinsaccharomycescerevisiaetoincreasemrnahalf-lifeandimprovegeneexpressioncontrolformetabolicengineeringapplications.metabeng.19:88–9794.7.erijman,a.,dantes,a.,bernheim,r.,shifman,j.m.andpeleg,y.(2011)transfer-pcr(tpcr):ahighwayfordnacloningandproteinengineering.j.struct.biol.,175,171–177.95.8.fonseca,g.g.,heinzle,e.,wittmann,c.,gombert,a.k.(2008).theyeastkluyveromycesmarxianusanditsbiotechnologicalpotential.appl.microbiol.biotechnol.79:339–345.96.9.gao,j.q.,yuan,w.j.,kong,l.,xiang,r.j.,zhong,s.j.(2015)efficientethanolproductionfrominulinbytwo-stageaeratestrategy.biomassbioenerg80:10-16.97.10.himes,s.r.,shannon,m.f.(2000)assaysfortranscriptionalactivitybasedontheluciferasereportergene.methodsmolbiol,130,165-174.98.11.kim,j.s.,park,j.b.,jang,s.w.,ha,s.j.(2015).enhancedxylitolproductionbymutantkluyveromycesmarxianus36907-fmel1duetoimprovedxylosereductaseactivity.appliedbiochemistryandbiotechnology,176(7),1975-1984.99.12.lertwattanasakul,n.,kosaka,t.,hosoyama,a.,suzuki,y.,rodrussamee,n.,matsutani,m.(2015)geneticbasisofthehighlyefficientyeastkluyveromycesmarxianus:completegenomesequenceandtranscriptomeanalyses.biotechnolbiofuels8:1–14.100.13.liu,g.l.,chi,z.,chi,z.m.(2013)molecularcharacterizationandexpressionofmicrobialinulinasegenes.critrevmicrobiol39(2):152–165.101.14.nonklang,s.,ano,a.,abdel-banat,b.m.a.,saito,y.,hoshida,h.,akada,r.(2009)constructionofflocculentkluyveromycesmarxianusstrainssuitableforhigh-temperatureethanolfermentation.bioscibiotechbioch73(5):1090–1095102.15.nonklang,s.,abdel-banat,b.m.,cha-aim,k.,moonjai,n.,hoshida,h.,limtong,s.,yamada,m.,akada,r.(2008)high-temperatureethanolfermentationandtransformationwithlineardnainthethermotolerantyeastkluyveromycesmarxianusdmku3-1042.applenvironmicrobiol74:7514-7521.103.16.pecota,d.c.,rajgarhia,v.,dasilva,n.a.(2007)sequentialgeneintegrationfortheengineeringofkluyveromycesmarxianus.jbiotech127(3):408–416.104.17.yang,c.,hu,s.,zhu,s.,wang,d.,gao,x.,hong,j.(2015).characterizingyeastpromotersusedinkluyveromycesmarxianus.worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology,31(10),1641-1646.105.18.zhang,j.,zhang,b.,wang,d.,gao,x.,hong,j.(2014)xylitolproductionathightemperaturebyengineeredkluyveromycesmarxianus.bioresour.technol.,152,192–201.106.19.zhang,j.,zhang,b.,wang,d.,gao,x.,hong,j.(2015).improvingxylitolproductionatelevatedtemperaturewithengineeredkluyveromycesmarxianusthroughover-expressingtransporters.bioresourcetechnology,175,642-645.107.专利108.1.美国专利8,846,343,akadaetal.,2014。当前第1页12当前第1页12