一种金霉素链霉菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有抑制三七根腐病菌活性的金霉素链霉菌及其应用。


背景技术：

2.三七[panax notoginseng(burk.)]为五加科人参属植物，以根、根状茎入药，具活血化瘀、消肿定痛等功效。近代药理及临床研究表明，三七对心脑血管系统疾病具有很好疗效。目前，三七的应用已十分广泛，统计表明仅国内就有1300多家企业以三七为原料，获3207个生产批文，生产400多个产品，其中中成药品种超过了300个，几乎涵盖了所有的中药制药企业。
[0003]
连作障碍(consecutive monoculture problem)是指在同一块土地中连续栽培同种或同科作物时，即使在正常的栽培管理条件下，也会出现生长势变弱、产量降低、品质下降、病虫害加重的现象(张重义等，2009)。目前中国对连作障碍的研究多集中于粮食作物小麦、玉米、高粱、大豆以及蔬菜作物茄子、黄瓜等，药用植物连作障碍的研究则相对较少。现常见栽培药用植物中，根(根茎)类药材占70％左右(张爱华等，2011)。然而，绝大多数的根(根茎)类药用植物，在栽培过程中都存在连作障碍现象，如苍术、地黄、人参、三七、太子参、黄连、当归等(夏品华等，2010)。随着药用植物规范化栽培的推进及种植面积不断扩大，连作障碍已成为药用植物栽培过程中的技术瓶颈(郭兰萍等，2006)。
[0004]
与其他人参属药用植物一样，三七种植忌地性极强，存在严重的连作障碍问题。一般认为栽种过三七的地块需要连续栽种玉米、旱稻、苜蓿等作物10年以上才能再次种植三七(简在友等，2009)。据课题组前期调查，在有些地块甚至需要长达30年的轮作间隔时间才能再次种植三七。市场需求的驱动，加之连作障碍暂无有效克服办法导致三七传统产区的适宜土地逐渐紧张，种植区不断外延，药材生产的道地性难以保证。
[0005]
三七栽培周期一般为3年，育苗期1年；种苗移栽以后，需再生长2年即连作两年，其中移栽后生长1年的称为二年七，生长2年的称为三年七。在生产上，连作后种植的二年七、三年七植株病虫害发生严重、植株存活率低，即为三七连作障碍表现特征之一。另一方面，三年七收获后的土地如接着再次移栽(重茬)三七种苗，三七发病率达到90％以上、一年后几乎无健康植株存在，即为三七连作障碍的另一表现特征。因此，三七表现出典型的连作障碍特征———病害严重。三七连作过程中的主要病害有根腐病、黑斑病、白粉病、立枯病和疫病等(王朝良等，2000)。其中根腐病的发病率可达到50％，是危害三七根系生长的一种近乎毁灭性的病害(游佩进，2009)。因此，迫切需要开发能够抑制三七病害以及连作障碍的技术方案，提高单位土壤种植三七的经济价值。


技术实现要素：

[0006]
为了解决现有技术中的存在的问题，本发明提供一种链霉菌及其应用，用以解决现有技术中三七种植中的病害严重以及连作障碍导致其产量和品质下降的问题。为解决上
述技术问题，本发明具体提供如下的技术方案：
[0007]
本发明的第一方面，提供一种金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372，其保藏信息如下：保藏编号为cgmcc no.22755；分类命名为：金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0008]
本发明的第二个方面，提供一种抑制三七主要根腐病菌的菌剂，所述菌剂包含上述金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372。在一种优选的实施方案中，所述菌剂中金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372的活菌数为106～108cfu/ml，最为优选的，所述菌剂中金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372的活菌数为108cfu/ml。
[0009]
本发明的第三个方面，提供一种上述金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372或由其所制备的菌剂在抗三七锈腐病菌中的应用。
[0010]
在一种实施方式中，上述应用是指减少三七根腐病的发生。
[0011]
在一种优选的实施方案中，上述应用包括将金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372施用于种植的三七根部土壤中，施用时的金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372活菌数为106～108cfu/ml，最为优选的，施用时的金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372的活菌数为108cfu/ml。
[0012]
本发明的第四个方面，提供一种上述金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372或由其所制备的菌剂在促进三七生长方面的应用。
[0013]
在一种实施方式中，上述应用是指抑制三七连作障碍的发生。
[0014]
在另一种实施方式中，在一种实施方式中，上述应用是指提升三七的出苗率以及单株鲜重。
[0015]
在一种优选的实施方案中，上述应用包括将金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372施用于种植的三七根部土壤中，施用时的金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372活菌数为106～108cfu/ml，最为优选的，施用时的金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)90372的活菌数为108cfu/ml。
[0016]
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
[0017]
本发明提供的金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)能利用糊精、d-半乳糖、n-乙酰-d-葡糖胺、α-d-葡糖、果胶以及d-葡糖酸作为碳源生长；能在ph＝5，ph＝6，或含有1％nacl的环境中生长；对乳酸钠，利福霉素sv，二甲胺四环素，林肯霉素，盐酸胍，四唑紫，四唑蓝，萘啶酮酸，亚碲酸钾，氨曲南，丁酸钠不敏感，对三七主要根腐病菌——锈腐病菌有较强的抑制活性，在作为菌剂施用于三七根部时可有效减少三七锈腐病的发生，并提升连作土壤中种植三七出苗率以及单株鲜重，具有极高的经济价值。
附图说明
[0018]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019]
图1为本发明实施例1提供的金霉素链霉菌90372的菌落图。
[0020]
图2为本发明实施例1提供的金霉素链霉菌90372革兰氏染色图。
[0021]
图3为金霉素链霉菌90372对三七鲜重的影响。
具体实施方式
[0022]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0023]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0024]
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0025]
实施例1：菌株的分离及生理生化功能的鉴定
[0026]
采用平板分离法从健康三七根际土壤中分离得到一株链霉菌(streptomycessp.)，将其自编号为90372，并对其形态、生理生化特征进行鉴定，具体结果如下：该菌为革兰氏阴性菌，链条状、菌落黄色、圆形、边缘隆起。利用α-d-葡萄糖、d-半乳糖、d-甘露醇、醋竹桃霉素、利福霉素sv、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-精氨酸、l-组胺、林肯霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、d-葡糖酸、粘酸、奎宁酸、万古霉素、四唑蓝、四唑紫、柠檬酸、l-苹果酸、γ-氨基丁酸、溴酸钠，符合链霉菌的形态及生理生化特征。将其于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22755；分类命名为：金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0027]
考察90372菌株对biolog gen iii微孔板上71种碳源底物的利用能力以及对23种化学物质的敏感性，测定结果如表1所示：
[0028]
表1
[0029]
[0030][0031]
+：表示阳性反应；-：表示阴性反应。
[0032]
由表1可知，90372菌株能利用糊精、d-半乳糖、n-乙酰-d-葡糖胺、α-d-葡糖、果胶以及d-葡糖酸作为碳源生长；能在ph＝5，ph＝6，或含有1％nacl的环境中生长；对乳酸钠，利福霉素sv，二甲胺四环素，林肯霉素，盐酸胍，四唑紫，四唑蓝，萘啶酮酸，亚碲酸钾，氨曲南，丁酸钠不敏感。
[0033]
实施例2金霉素链霉菌90372抑菌能力测试
[0034]
本实施例中4种供试锈腐病菌(cylindrocarpon destructans)由云南农业大学植保学院植物病理实验室提供。
[0035]
检测方法如下：
[0036]
采用平板对峙培养法测定金霉素链霉菌90372对供试锈腐病菌菌丝生长的抑制活性。在超净工作台上将在pda培养基上长好的供试锈腐病菌用直径为5mm的打孔器制成菌饼，然后将菌饼转至pda培养基平板中央，再用无菌的牙签将分离纯化的金霉素链霉菌接种到距病原菌2.5cm处，设置10次重复，以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃恒温培养，待对照菌落长到培养基的2/3时，测量菌落直径，并按照以下供试计算抑菌率。抑菌率(％)＝
[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]
×
100％。
[0037]
其中，pda培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，水1000ml。
[0038]
检测结果如表2所示，金霉素链霉菌90372对4种供试锈腐病菌的抑制能力不同，抑制率最高达到70％以上。表明该菌株对于三七主要根腐病菌——锈腐病菌有较强的抑制活性。
[0039]
表2
[0040][0041]
实施例3金霉素链霉菌90372对三七种子出苗的促进作用
[0042]
1、菌液制备
[0043]
将金霉素链霉菌90372于kb固体培养基上活化，挑取单菌落于kb液体发酵培养基中160rpm、28℃振荡培养48h，将发酵液稀释至od
600
＝0.3用于后续田间灌根。
[0044]
其中kb固体培养基每1l培养基配方为：20g蛋白胨，10ml甘油，1.5gk2hpo4·
3h20，1.5g mgso4·
7h2o，17g琼脂，1000ml蒸馏水，ph 7.0。
[0045]
2、链霉菌90372对三七种子出苗的影响
[0046]
试验安排在寻甸大河桥农场三七种植棚中进行。三七连作土壤一部分121℃湿热灭菌20min，另一部分三七连作土不做处理。所有连作土壤分别放到花盆，每盆种入12粒三七种子，每个处理5个重复。三个月后取样调查，测量记录植株的出苗率。
[0047]
结果得到如表3所示结果，在土壤灭菌/未灭菌条件下，金霉素链霉菌90372灌根后，三七出苗率均升高。
[0048]
表3链霉菌90372对三七种子出苗的影响
[0049][0050]
3、链霉菌90372对三七鲜重的影响
[0051]
在装有灭菌土的花盆中种入三七种子，每瓶12棵，然后将金霉素链霉菌90372悬浮液接种到花盆中，悬浮液中金霉素链霉菌90372活菌含量为106～108cfu/ml，每瓶25ml，以加入相同体积的液体kb培养基作为对照，每个处理5盆自然条件下培养3个月后，测量记录植株的单株鲜重。
[0052]
结果得到如图3所示结果，在灭菌土壤中，金霉素链霉菌90372灌根后，三七平均单株鲜重增加。
[0053]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。