油菜基因BnPEP5在菌核病防控中的应用

油菜基因bnpep5在菌核病防控中的应用
技术领域
1.本发明属植物抗病性技术领域，涉及一个油菜(brassica napus)基因bnpep5的抗病调控功能的应用，尤其涉及油菜(brassica napus)基因bnpep5在菌核病防控中的应用。


背景技术：

2.1、植物基因功能分析技术植物基因的功能通常通过比较分析基因的超常表达与正常表达情况下的表型(phenotype)或功能情况加以判断和明确。基因的超常表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过rna干扰(rna interfering,rnai)、基因敲除(knock-out)等方式来达到。rnai通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除(knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。构建基因超表达植株和/或rnai植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，即能明确目的基因对该性状的调节功能。
3.2、植物免疫激发技术植物免疫是植物通过受体识别病原物分子从而激活的防卫反应。植物免疫系统有多个层次，其中第一层次为植物细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors，prrs)识别来自病原物及植物自身的保守的分子模式产生的免疫，称为模式触发性免疫(pattern-triggered immunity，pti)。植物能感知病原物侵染等引起的对植物细胞完整性的破坏，并产生伤害相关分子模式(damage-associated molecular patterns,damps)，这些damps通过prr受体识别激发植物产生pti免疫反应，包括活性氧迸发、激酶级联的活化、防卫相关基因的表达等，最后表现对病原物的抗性。pti在防止非适应性微生物侵染植物的非寄主抗性(nonhost resistance)和限制适应性病原物侵染感病寄主植物的基础抗性(basal resistance)中起重要作用。pep(plant elicitor peptides)是一类抗病激发短肽，是能够触发植物免疫反应的damp。利用pep基因创制抗病性增强的作物种质具有广谱、稳定、持久等优点。
4.3、菌核病防控技术植物菌核病由核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是坏死营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、易使病原物产生抗药性等问题，鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
5.4、植物抗病育种技术
植物抗病育种技术包括传统抗病育种和通过基因工程抗病育种等。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种油菜(brassica napus)基因bnpep5在菌核病防控中的应用，是通过油菜(brassica napus)抗病激发短肽基因bnpep5的抗病性诱导功能及其在创制抗核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)种质中的应用，从而体现其对菌核病绿色防控的重要意义。所述油菜基因bnpep5的核苷酸序列如seq id：1所示，其编码的蛋白由99个氨基酸组成，序列如seq id：2所示。
7.本发明所述应用是通过创制转基因油菜(brassica napus)来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，进一步的是通过创制超表达bnpep5的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用。
8.本发明以油菜中双11品种cdna为模板，通过pcr克隆获得油菜基因bnpep5，其核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长300bp，编码的蛋白由99个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。本发明克隆的核苷酸序列与ncbi数据库中油菜品种zs11的loc111209330核苷酸序列有1个碱基的区别，a46替换成c，导致相应氨基酸t16替换成p，即本发明克隆的蛋白序列与ncbi数据库中油菜品种zs11的蛋白序列xp_022564845.1有此氨基酸的区别。
9.在本发明之前，该基因的功能没有任何公开报告。本发明首次通过构建bnpep5基因的超表达转基因油菜及其抗病分析，阐明了该基因增强油菜菌核病抗性的作用。病斑面积分析结果显示，核盘菌接种24h后，超表达转基因油菜植株相比于转化空载的植株病斑面积显著减少，表现出更加抗病的表型，表明超表达油菜bnpep5基因增强了油菜对菌核病的抗性。
10.基于以上本发明阐明的bnpep5基因功能，本发明的应用目的是提供所述的油菜bnpep5基因通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，通过创制超表达bnpep5的转基因油菜纯合系来获得增强对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例1中的说明)。
11.油菜bnpep5基因在通过创制超表达bnpep5的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：
12.(1)bnpep5基因超表达结构的构建和获取将bnpep5基因开放阅读框(orf)克隆入一个植物表达载体(pbwa(v)hs)，使其受强启动子的驱使表达。
13.(2)转化bnpep5基因超表达结构的农杆菌的获取
将构建好的bnpep5基因超表达结构通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株。
14.(3)超表达bnpep5的转基因油菜创制和获取通过农杆菌介导法将bnpep5基因超表达结构导入油菜，获取转bnpep5基因超表达结构的油菜。
15.(4)超表达bnpep5的转基因油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和bnpep5基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达bnpep5的转基因油菜纯合系。
16.(5)对菌核病抗性增强的超表达bnpep5的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取以超表达bnpep5的转基因油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗病性增强的转bnpep5基因油菜。
17.本发明的优点：(1)本发明提供的bnpep5基因是优质抗菌核病基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强等优点。油菜菌核病抗性是数量性状抗性，由多基因控制。一般而言，单个基因对该抗性的调控程度较低。因此，全世界范围内，油菜菌核病抗性材料都很匮乏，尚无高抗材料。bnpep5编码一条抗病激发短肽，是能够触发植物免疫反应的damp。bnpep5被植物表面特异性受体识别后，触发植物pti免疫反应，作用位于植物免疫反应的上游，具有广谱、强烈、稳定持久等优点，因而是优质抗病基因资源。利用bnpep5创制抗病品种和种质是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。因此，bnpep5基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的全新基因资源。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用抗病调控基因bnpep5，采用基因工程方法，创制培育高抗菌核病的油菜材料，具有周期短，选育快速等特点。
附图说明
18.图1提供本专利获取的bnpep5超表达转基因油菜植株的证据，显示转基因油菜植株中bnpep5基因表达检测结果。利用实时荧光定量pcr检测超表达油菜植株中bnpep5基因表达水平。选用油菜bnactin7作为内参基因，转化空载体植株(ev)的相对表达量设置为1。实验重复三次。对表达结果进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。***表示差异极显著(p《0.005)。结果显示，bnpep5超表达(bnpep5-oe)株系中，bnpep5的表达量明显提高，为对照的6.2倍。表明该植株为真正的bnpep5基因超表达植株。
19.图2提供bnpep5基因对菌核病抗性的强烈激发功能的证据，显示超表达bnpep5的转基因油菜显著增强了对核盘菌的抗性。对油菜bnpep5转基因油菜植株进行了核盘菌uf-1的接种分析。图中显示接种后24h的表型(a)和病斑面积定量统计分析结果(b)。实验重复三次。对病斑面积进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。***表示差异极显著(p《0.005)。结果显示，bnpep5超表达(bnpep5-oe)植株比转化空载体植株(ev)对照表现出明显更抗病的表型，bnpep5-oe中病斑没有明显扩展。表明超表达bnpep5基
因显著增强了油菜对核盘菌的抗性。
具体实施方式
20.本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
21.实施例1本发明克隆了一个油菜基因bnpep5，首次通过构建超表达转基因油菜，阐明了该基因的抗菌核病功能，揭示了该基因对油菜菌核病抗性具有强烈的激发功能。因为bnpep5基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著提高，因此，可以采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料，即可以通过构建bnpep5基因的超表达油菜来创建获取对菌核病抗性显著增强的油菜新材料，为油菜菌核病绿色防控提供新材料和新技术。主要步骤包括：
22.1)油菜bnpep5基因的克隆和保存本发明提供的油菜bnpep5基因通过以下步骤克隆获得。先根据油菜基因组数据库中bnpep5序列设计了引物bnpep5-f(5
’‑
atg cag aaa gag agc gat aag aaa-3’)(序列如seq id：3所示)，以及bnpep5-r(5
’‑
cta cat gtc gtg gtt gtt aac-3’)(序列如seq id：4所示)。采用trizol试剂提取油菜品种中双11叶片总rna，采用rt-pcr方法扩增获取bnpep5 cdna，通过1％琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收pcr产物，使用golden gate内切酶，直接将目的片段连接到pbwa(v)hs超表达载体，热击转化大肠杆菌dh5α，在lb培养基中摇菌复苏1h，吸取菌液涂布在卡那霉素的平板上过夜培养，挑取单克隆，提取质粒，以bnpep5-f/bnpep5-r为引物进行pcr检验所提取的质粒是否包含bnpep5基因，最后送公司测序验证，从而成功克隆和获取bnpep5基因cdna全长序列。bnpep5核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长273bp，编码的蛋白由90个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。本发明克隆的核苷酸序列与ncbi数据库中油菜品种zs11的gene id号为loc111209330一致，蛋白序列与xp_022564845.1相同。在本发明之前，该基因功能没有任何公开报告。
23.转化了携带有bnpep5基因序列的载体的大肠杆菌，保存于－80℃冰箱。可随时通过活化菌株，提取质粒，通过pcr扩增，将bnpep5基因亚克隆至目的载体中，用于转基因等研究。同时，pbwa(v)hs超表达载体以camv 35s强启动子驱动目的基因的表达，并且携带3
×
flag标签，便于分子鉴定和基因功能研究。
24.2)转化bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5的农杆菌的获取将bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5通过电击等方法转化对油菜具有强侵染力的农杆菌菌株，如ehal05，在含卡那霉素和利福平抗生素的yep培养基上筛选转化子，再通过pcr鉴定阳性菌株，获取携带bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5的农杆菌。用于下一步油菜的遗传转化。
25.3)转bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5油菜的创制和获取通过农杆菌介导法将bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5导入油菜，最后获取转pbwa(v)hs-bnpep5的油菜t0代。具体操作步骤如下：
26.(i)种子清洗及萌发75％乙醇30-60s，无菌水1次，1min/次；0.15％升汞10min，无菌水清洗2次，1min/次；无菌水清洗30min，接种于无菌滤纸晾干；将种子接种于培养瓶，23℃暗培养5-6d；
27.(ii)预培养
将萌发的油菜苗下胚轴切成0.4-0.6cm的切段，接种于预培养基，23℃光照培养2-3d；
28.(iii)农杆菌侵染及共培养挑取农杆菌于侵染液中，制备od
600
＝0.2的农杆菌重悬液，将外植体接种于农杆菌悬浮液中侵染10min。将侵染后的外植体接种于无菌滤纸上晾干，接种于共培养基上，23℃暗培养48-72h；
29.(iv)脱菌(延筛)将共培后的外植体接种于脱菌培养基上，23℃光照培养6d；
30.(v)筛选/分化将脱菌处理的外植体接种于筛选/分化培养基上，每皿接种30个外植体，23℃光照培养，15d换一次培养基；
31.(vi)生根培养将分化出的芽接种于生根培养基，23℃光照培养，直至生根。
32.(vii)土壤种植等卡那霉素抗性苗长到根系完全后，将t0代无菌小苗在27℃下开盖培养锻炼2d，然后移栽到土中，置于培养箱中进行常规管理，最后收获得到t0种子。
33.4)转bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5的油菜纯合系的筛选鉴定和获取分别以卡那霉素抗性和bnpep5基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。观察待检测油菜种子能否在卡那霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量pcr等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bnpep5基因超表达结构pbwa(v)hs-bnpep5的油菜纯合系。
34.本发明获取的转基因油菜纯合系，在卡那霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且bnpep5基因表达水平均显著高于转空载体的对照，为对照的6.2倍(图1)。表明这些植株为真正的bnpep5基因超表达植株。
35.5)bnpep5基因超表达油菜纯合系的抗病性检测分析以4)中获取的bnpep5基因超表达油菜纯合系为材料，通过接种核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)，检测分析其对油菜菌核病的抗性，从而明确bnpep5基因对油菜菌核病抗性的调控作用，为利用该基因创建和获取抗菌核病油菜奠定基础。
36.核盘菌的活化培养：选取饱满无污染的核盘菌菌核，用酒精灯灼烧过的无菌刀片将菌核切为两半，切面朝下放于pda固体平板上，23℃避光培养3d，选用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3～5mm的菌丝块，带菌丝的一面朝下接种到新的pda固体平板上，23℃避光培养36h左右可进行接种。
37.核盘菌的接种：选取长势一致的油菜植株供接种。用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3-5mm的菌丝块，菌丝面朝下接种到发育完全的叶片，每叶左右半叶对称各接种一个菌丝块，覆膜保湿，置于23℃温室培养，适当时间(约24h)后进行拍照记录，病斑面积用imagej软件分析。
38.接种实验重复三次。对病斑面积进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(***，p《0.005)。结果显示，bnpep5超表达(bnpep5-oe)植株比转化空载体植株(ev)表现出显著更抗病的表型。bnpep5-oe中病斑没
有明显扩展。表明超表达bnpep5基因显著增强了油菜对核盘菌的抗性(图2)。
39.这些结果表明，bnpep5超表达植株对菌核病的抗性显著高于转空载体植株对照。bnpep5基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著提高，因此，bnpep5对油菜菌核病的抗性起正调控作用。
40.综上，本发明结合图1-图2的结果，首次揭示了bnpep5基因的抗病激发功能，提供了bnpep5基因通过创制超表达油菜来获取菌核病抗性显著增强的油菜材料。本发明提供的bnpep5基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的新基因资源。更重要的是，本发明提供了bnpep5在创制抗菌核病作物种质中的应用途径和应用技术，并提供了实施例，成功获取了高抗菌核病油菜。