D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法

文档序号：24875881发布日期：2021-04-30 12:51阅读：289来源：国知局

本发明涉及d-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法，属于生物技术领域。

背景技术：

d-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的己酮糖单糖，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖的0.3％，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，同样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应可作为食品中蔗糖理想的替代品。毒理学实验证实，d-阿洛酮糖的半数致死量(ld50)为16.3g/kg，相比果糖的ld50为14.7g/kg，赤藻糖醇的ld50为15.3g/kg，根据毒性评级，d-阿洛酮糖属于“相对无害”类别(毒性评级最低)。2014年，美国食品药品监督管理局(u.s.foodanddrugadministration，fda)正式批准d-阿洛酮糖为一般公认安全(generallyrecognizedassafe，gras)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。d-阿洛酮糖具有多种保健作用，可抗高血糖症，预防或治疗肥胖及因肥胖引起的炎症，有利地调节胆固醇代谢，通过调节肠道微生物群发挥其生物学效应。在最大剂量2000mg/kg时，d-阿洛酮糖对大鼠的生殖毒性无不良影响。d-阿洛酮糖天然存在于一些水果中，含量极低，化学方法合成d-阿洛酮糖步骤繁琐且效率低，经济便捷的生物法合成d-阿洛酮糖成为研究热点。日本香川大学izumori团队利用一株产碱菌首次实现生物法合成d-阿洛酮糖，并通过固定化酶异构化d-果糖合成d-阿洛酮糖。d-阿洛酮糖3-差向异构酶为胞内酶，获得纯酶需浓缩、破细胞、纯化等步骤，工业生产选择全细胞催化较为经济快捷。全细胞生物催化，要求宿主细胞是不分泌内毒素、外毒素、异味物质的gras菌株，枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌的模式生物是宿主细胞的最佳选择。

游离的全细胞在催化反应结束后，收集困难并且在重复使用的过程中会造成细胞破损。为解决游离细胞的生产弊端，固定化细胞技术应运而生，固定化细胞制备方法包括吸附法、包埋法、共价法和交联法四种，固定化材料要求无生物毒性，性质稳定，廉价耐用。

技术实现要素：

本发明通过在d-阿洛酮糖3-差向异构酶(dsdpease)基因n端融合双亲短肽(saps)，筛选出热稳定性提高的saps-dsdpease枯草芽孢杆菌重组菌株。为提高重复利用性，本发明通过添加适当比例的二氧化钛与海藻酸钠形成混合固定化载体，制备saps-dsdpease枯草芽孢杆菌重组菌株固定化细胞。

本发明的目的是提供一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖异构酶的改造方法和一种简单有效的制备重组dsdpease固定化细胞的方法，所制备的固定化细胞的应用，从而解决了现有的技术中存在的困难。

本发明的第一个目的是提供一种表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，所述重组菌表达n端融合双亲短肽的d-阿洛酮糖异构酶基因。

在一种实施方式中，所述n端融合双亲短肽的d-阿洛酮糖异构酶基因的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2或seqidno.3所示。

在一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为宿主，以pma5为表达载体。

本发明的第二个目的是提供一种提高d-阿洛酮3-差向异构酶热稳定性的方法，所述方法为在d-阿洛酮糖异构酶基因n段融合双亲短肽。

在一种实施方式中，所述双亲短肽的核苷酸序列如seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6所示。

本发明的第三个目的是提供一种固定化细胞，所述固定化细胞包埋有上述重组菌。

本发明的第四个目的是提供一种固定化细胞的制备方法，所述方法步骤如下：

1)将重组菌在tb培养基中200-220rpm，35-38℃，培养20-28h，获得发酵液，将发酵液离心收集细胞；

2)用生理盐水悬浮细胞并加入海藻酸钠溶液和二氧化钛，充分搅拌获得混合物；

3)使用针头式注射器以0.5-1.5d/s的速度将混合物滴入cacl2溶液中成型，并在4℃硬化得到微球；

4)将硬化后的微球弃去上清，用生理盐水洗涤3次，真空抽滤去除水分，即得到固定化细胞；

5)将固定化细胞置于戊二醛溶液中交联。

在一种实施方式中，所述海藻酸钠溶液浓度为1.5-2％。

在一种实施方式中，所述细胞的终浓度为60-70g/l。

在一种实施方式中，所述二氧化钛是海藻酸钠质量的1/2～1/4。

在一种实施方式中，所述cacl2溶液浓度为2％。

在一种实施方式中，所述戊二醛溶液浓度为0.01～0.04％。

本发明的第五个目的是提供一种固定化细胞生产d-阿洛酮糖的方法。

在一种实施方式中，所述方法为在发酵罐中，加入溶于ph6-8.5磷酸盐缓冲液的d-果糖溶液，加入固定化细胞，转速180-220转/分，转化温度45-55℃，反应50-100min。

本发明的第六个目的是所述重组菌或固定化细胞在制备d-阿洛酮糖或制备含有d-阿洛酮糖的食品、膳食补充剂或医药制剂的应用。

有益效果：将dsdpease、sap1-dsdpease、sap2-dsdpease、sap3-dsdpease纯酶置于40℃水浴锅孵育48h，每隔6h取出100μl，检测残余酶活。sap1-dsdpease表现出比dsdpese更稳定的残余酶活为58％。按照优化后的条件制备的固定化细胞连续操作10次，固定化小球机械强度依然维持在80％，残余酶活回收率保留58％。利用固定化细胞5l发酵罐转化d-果糖合成d-阿洛酮糖，催化反应80min，d-阿洛酮糖浓度可达153.3g/l，转化率为30.7％。

附图说明

1、图1saps-dsdpeasesds-page分析。泳道1：对照；泳道2：

b.subtilis/pma5-dsdpease破细胞上清液；泳道3：sap1-dsdpease纯酶；泳道4：sap2-dsdpease纯酶；泳道5：sap3-dsdpease纯酶。

具体实施方式

实施例1构建枯草芽孢杆菌重组菌株saps-dsdpease

质粒pma5被快速限制性内切酶bamhⅰ、mlui线性化并进行琼脂糖凝胶电泳，将琼脂凝胶回收后，得到纯净的pma5线性化质粒。

使用引物dsdpe-f和r-pma5-ds(mlui-6×his)，以核苷酸序列如seqidno.7所示的dsdpease基因为模板，pcr克隆纯化后得到pcr产物dsdpease-6×his。以上述pcr产物作为模板，使用引物r-pma5-ds(mlui-6×his)和长引物pma5(bamhi)-sap1-f或pma5(bamhi)-sap3-f或pma5(bamhi)-sap3-f引入不同的saps序列，分别得到sap1-dsdpease-6×his、sap2-dsdpease-6×his和sap3-dsdpease-6×his基因片段。将上述获得的dsdpease-6×his、sap1-dsdpease-6×his、sap2-dsdpease-6×his和sap3-dsdpease-6×his分别与pma5线性化质粒连接得到重组质粒，将重组质粒pma5-dsdpease、pma5-sap1-dsdpease、pma5-sap2-dsdpease和pma5-sap3-dsdpease分别转化到e.coildh5α感受态细胞中，挑取正确的转化子，在10mllb液体培养基中过夜培养获得菌液，使用质粒小量制备盒提取菌液得到重组质粒。将获得的重组质粒分别转化到b.subtilis168感受态细胞中，过夜培养，挑取单菌落通过pcr验证，得到重组菌株b.subtilis168/pma5-dsdpease、b.subtilis168/pma5-sap1-dsdpease、b.subtilis168/pma5-sap2-dsdpease和b.subtilis168/pma5-sap3-dsdpease，并甘油保存于-80℃。

表1引物表

实施例2摇瓶发酵产酶

1)发酵培养

分别蘸取-80℃保存的实施例1得到的甘油管菌液，在含有50μg/ml卡那霉素的lb抗性平板划线活化，37℃培养8-10h，分别挑取活化后的单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的10mllb液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养12h，以体积比2％的接种量转接到含有50μg/ml卡那霉素的500mltb培养基中，220rpm，37℃，培养24h获得发酵液，使用高速冷冻离心机8000rpm离心15min收集细胞，超声破碎获得粗酶液，经ni²⁺柱亲和层析纯化得到纯酶。

lb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。

lb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油4，kh2po42.31，k2hpo412.54。

2)酶活测定

取100μl酶液加入到900μl底物溶液(100g/ld-果糖，140μmol/lco²⁺，50mmol/ltris-hcl，ph8.5)中，在60℃，1000rpm振荡金属浴中反应2min，沸水煮5min，终止酶催化反应。样品离心，经孔径0.22μm水系纤维虑膜处理后，经高效液相色谱仪(hplc)分析，检测器为示差检测器。

酶活单位定义：在ph8.5tris-hcl缓冲液中，振荡金属浴60℃，1000rpm条件下，1min生成1μmold-阿洛酮糖(d-allulose)作为一个酶活单位。

将实施例2中步骤1)获得的纯酶在40℃孵育48h后测定酶活，以未孵育的初始酶活为100％，sap1-dsdpease残余酶活保持58％，dsdpease残余酶活保持40％，sap3-dsdpease残余酶活保持46％，sap2-dsdpease残余酶活保持25％。蛋白表达在33kda处有一条与理论分子量一致的条带，sds-page分析如图1。

实施例3海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活回收率的影响

配制终浓度为0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％的海藻酸钠溶液加热溶解后置于冰上冷却，然后将实施例2的重组菌株b.subtilis168/pma5-sap1-dsdpease发酵液离心收集细胞，用生理盐水悬浮，加到海藻酸钠溶液中，使细胞终浓度为30g/l，加入1:2(二氧化钛：海藻酸钠w/w)的二氧化钛，充分搅拌均匀得到混合物。使用针头式注射器以1d/s的速度将混合物滴入2％的cacl2溶液中成型，并在4℃硬化。将硬化后的微球弃去上清，用生理盐水洗涤3次，真空抽滤去除水分，即得到固定化细胞。

结果如表2所示，酶活回收率随海藻酸钠浓度的增大而下降，机械强度随着海藻酸钠浓度的增大而增强，在保证较好的机械强度和酶活回收率的情况下，2％的海藻酸钠最合适。

表2海藻酸钠浓度对固定化细胞的影响

固定化细胞机械强度测定：将一定量细胞置于50ml三角瓶中，加入10ml生理盐水，使用磁力搅拌器在50℃，200rpm条件下搅拌8h，计数完整的固定化细胞小球。

机械强度(％)＝完整的固定化细胞小球数/初始固定化细胞小球数×100

实施例4细胞浓度对固定化细胞酶活回收率的影响

配制终浓度为2％的海藻酸钠溶液，将实施例2的重组菌株b.subtilis

168/pma5-sap1-dsdpease发酵液离心收集细胞，用生理盐水悬浮，得到不同菌体浓度的菌悬液，加入到海藻酸钠溶液中使细胞终浓度分别为20g/l，30g/l，40g/l，50g/l，60g/l，70g/l，80g/l，90g/l，加入1:2(二氧化钛：海藻酸钠w/w)的二氧化钛。按照实施例3的方法制备固定化细胞。如表3所示，随着细胞浓度的增大，固定化细胞相对活性先增大然后减少，相对酶活回收率一直呈下降趋势。细胞包埋量为20g/l时，酶活回收率较高，固定化细胞小球中的单位细胞传质效率较高，但是催化活性相对偏低，细胞量少会影响固定化小球的整体催化活性。细胞包埋量60g/l时，相对活性达到最大，更有利于固定化细胞在生产中发挥催化作用。

表3细胞浓度对固定化细胞酶活回收率的影响

实施例5二氧化钛与海藻酸钠比例对固定化细胞的影响

配制终浓度为2％的海藻酸钠溶液，将实施例2的重组菌株b.subtilis

168/pma5-sap1-dsdpease发酵液离心收集细胞，用生理盐水悬浮，加到海藻酸钠溶液中，使细胞终浓度为60g/l，加入二氧化钛的量分别为(二氧化钛：海藻酸钠w/w)0，1:2，1:4，1:6，1:8，1:10，充分搅拌。按照实施例3的方法制备固定化细胞。如表4所示，随着二氧化钛添加量的增大，相对酶活回收率逐渐增大，机械强度增大。当不添加二氧化钛时，相对酶活回收率98.2％，但机械强度较低为95％。当二氧化钛添加量为1:4时，相对酶活回收率最高，机械强度也较好，所以二氧化钛：海藻酸钠(w/w)为1:4最适。

表4二氧化钛与海藻酸钠比例对固定化细胞的影响

实施例6戊二醛浓度对固定化细胞的影响

配制2％的海藻酸钠溶液，将实施例2的重组菌株b.subtilis168/pma5-sap1-dsdpease发酵液离心收集细胞，用生理盐水悬浮，加到海藻酸钠溶液中，使细胞终浓度为60g/l，加入二氧化钛的量为1:4(二氧化钛：海藻酸钠w/w)，按照实施例3的方法制备固定化细胞，将制备好的固定化细胞分别置于浓度为0，0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％的戊二醛溶液中进行交联。如表5所示，戊二醛浓度0～0.03％对固定化细胞的酶活没有影响，当戊二醛浓度超过0.03％时，戊二醛浓度越大固定化细胞酶活损失越大，因此0.03％的戊二醛溶液作为交联剂较合适。

表5戊二醛浓度对固定化细胞的影响

实施例7固定化细胞的最适反应温度与ph

在相同温度下，固定化细胞与游离细胞相比，传质更慢，温度是影响反应速率的关键因素，如表6所示，随着温度的升高，相对活性增大。在不同温度下测定固定化细胞的相对活性，如表6所示，固定化细胞和游离细胞的最适反应温度均为80℃，超过80℃，相对活性急剧下降至30.5％，当温度低于65℃时固定化细胞的相对酶活小于70％。

反应溶液的ph影响固定化细胞的催化活性，在不同ph下测定固定化细胞的相对活性，如表7所示，在ph3～5，固定化细胞的相对活性较低小于10％，当ph升到6.5时，固定化细胞相对活性最高，在ph值为7.0～8.5，固定化细胞的相对活性都保持在90％左右，由此可见，在中性偏碱的条件下反应溶液的ph对固定化细胞的催化活性影响不大，ph6.5-9时固定化细胞相对活性可以达到90％以上。

表6固定化细胞的最适反应温度

表7固定化细胞最适反应ph

实施例8固定化细胞热稳定性与ph稳定性

称取适量固定化细胞，分别在30～70℃水浴锅中过夜孵育10h，称取0.5g测定残余酶活，其余进行机械强度测定。如表8所示，固定化细胞在30℃、40℃保存10h残余酶活仍保持100％，机械强度没有降低；在50℃，固定化细胞残余酶活力99.6％，机械强度98％；固定化细胞在60℃孵育10h的残余酶活为68.1％，机械强度下降至86％，然而70℃下孵育10h已丧失酶活力，考虑到已失去研究意义，不再讨论该温度下的机械强度。

将适量细胞置于ph6～8.5的磷酸盐缓冲溶液中保存5h，用生理盐水洗涤3次，测定固定化细胞残余酶活与机械强度。如表9所示，固定化细胞在ph6.0的缓冲液中出现溶破现象，固定化材料被洗脱掉，细胞暴露相对活性较大，但机械强度仅有85％，在ph6.5缓冲液中相对活性增大，机械强度依然是85％。在ph7.0～8.5的缓冲液中固定化细胞不被破坏，相对活性受传质影响低于最高残余酶活，但机械强度均为100％，故认为固定化细胞在ph8.5的环境下稳定性最好。

表8固定化细胞热稳定性

表9固定化细胞ph稳定性

实施例9固定化细胞的操作稳定性

固定化细胞在优化后的反应条件下，重复使用，如表10所示，随着使用批次的增多，海藻酸钠包埋的固定化细胞机械强度不耐受加热及搅拌剪切力的作用急剧下降，残余酶活回收率在第3批次下降至60％，在第5批固定化细胞酶活回收率仅有30％，第6批次已无完整颗粒存在。二氧化钛-海藻酸钠复合包埋吸附的固定化细胞小球表现出极稳定的机械强度，从第8批开始小球开始被溶破且机械强度下降至94％，残余酶活回收率保留62％，连续操作10次，固定化小球机械强度依然维持在80％，残余酶活回收率保留58％。

表10固定化细胞操作稳定性

实施例10固定化细胞转化d-果糖合成d-阿洛酮糖的应用

在5l发酵罐中，加入1l溶于ph8.0磷酸盐的500g/ld-果糖溶液，加入500g根据实施例6方法制备得到的固定化细胞，转速200转/分，转化温度50℃，每隔10分钟从反应液中取出1ml，使用安捷伦1260示差检测器检测样品中d-果糖和d-阿洛酮糖的含量。在0～10min，反应体系温度在逐渐上至50℃并趋于稳定，反应速率相对较慢。在10～50min，固定化细胞被浸泡后加快了传质速度，体系中d-阿洛酮糖浓度增大至130.8g/l。50～100min，体系中d-阿洛酮糖浓度较高，反应达到平衡。催化反应80min，d-阿洛酮糖浓度153.3g/l，转化率为30.7％。

表11固定化细胞转化d-果糖合成d-阿洛酮糖

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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