一种肠道益生菌及其在治疗肿瘤和替代抗生素中的应用

本发明属于生物
技术领域：
，涉及基于肠道益生菌的肿瘤治疗新策略和替代抗生素在畜牧养殖中的应用，尤其涉及一种肠道益生菌及其在治疗肿瘤和替代抗生素中的应用。
背景技术：
：人体肠道微生物是指肠道黏膜上数量庞大的微生物群，包括细菌、古细菌、真菌、原生动物和病毒等生命体，在长期的进化过程中，肠道微生物菌群和宿主已成为一个共生的生态系统，与机体疾病、代谢、免疫等密切相关。肠道菌群主要由共生菌(以双歧杆菌和乳酸杆菌为主)，条件致病菌(以肠球菌、大肠杆菌为主)及致病菌群(如沙门氏菌、产气荚膜梭菌等)组成。众多研究表明，肠道共生菌群与癌症之间存在密切联系，特别是胃肠道(肠道)微生物群在调节肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用，肠道菌群的失调与癌症的发生密切相关。因此，开发调节胃肠道平衡、提高免疫、具有预防和治疗结直肠癌和乳腺癌等恶性肿瘤、提高重离子辐照治疗效率的益生菌药物意义重大。此外，随着我国畜牧养殖业的快速发展，我国成为世界畜牧养殖第一大国。但畜牧养殖业过程中动物抗生素使用带来的一系列健康和安全隐患日渐凸显。抗生素的大量使用不仅会造成耐药菌的产生，而且会造成肉、蛋、奶中抗生素的大量残留，严重危害人民生命健康。目前，许多国家已禁止使用抗生素作为动物生长促进剂，然而停止动物饲料中抗生素的使用给牲畜和家禽养殖业的发展带来巨大的挑战。因此，开发环保、安全、能增强动物先天免疫力、可预防治疗动物疾病的抗生素替代物已成为必然。技术实现要素：本发明的一个目的是提供罗伊氏乳杆菌。本发明提供的罗伊氏乳杆菌jmr-01，其保藏编号为cgmccno.21304。本发明还有一个目的是提供一种二价肠道益生菌制剂。本发明提供的二价肠道益生菌制剂，其活性成分为上述的罗伊氏乳杆菌jmr-01和干酪乳杆菌jy300-8；所述干酪乳杆菌jy300-8的保藏编号为cgmccno.21303。上述二价肠道益生菌制剂中，所述干酪乳杆菌jy300-8和所述罗伊氏乳杆菌jmr-01的cfu比为1:0.5-5。上述二价肠道益生菌制剂中，所述罗伊氏乳杆菌jmr-01和所述干酪乳杆菌jy300-8为活菌或者灭活菌。所述二价肠道益生菌制剂由上述干酪乳杆菌jy300-8菌液或菌体和上述罗伊氏乳杆菌jmr-01菌液或菌体组成。本发明还有一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，包括如下1)：或，本发明提供的产品，包括如下1)和2)：1)上述的罗伊氏乳杆菌jmr-01或上述的二价益生菌制剂。2)放射治疗肿瘤所需试剂或设备。上述产品具有如下至少一种功能：1)治疗和/或预防肿瘤；2)抑制肿瘤细胞增殖；3)预防或治疗由致病菌引发的疾病；4)替代抗生素；5)抑制病原菌；6)促进或协同放射治疗肿瘤。上述罗伊氏乳杆菌jmr-01、上述的复合菌剂在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能产品中的应用也是本发明保护的范围：1)治疗和/或预防肿瘤；2)抑制肿瘤细胞增殖；3)预防或治疗由致病菌引发的疾病；4)替代抗生素；5)抑制致病菌增殖；6)促进或协同放射治疗肿瘤。上述中，所述肿瘤为乳腺癌或结直肠癌；具体乳腺癌为her2阳性乳腺癌。或，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞或结直肠癌细胞；或，所述致病菌引发的疾病为动物肠道疾病、动物乳房炎或动物子宫内膜炎；或，所述致病菌引发的疾病为由产肠毒素性埃希氏大肠杆菌、弯曲杆菌、沙门氏杆菌或产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的动物腹泻；具体为由产肠毒素性埃希氏大肠杆菌、弯曲杆菌、沙门氏杆菌或产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的犊牛腹泻或羔羊腹泻；或，所述致病菌引发的疾病为由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或链球菌引起的动物乳房炎；具体为由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或链球菌引起的奶牛乳房炎；或，所述致病菌引发的疾病为由化脓性放线菌、坏死梭杆菌、拟杆菌、大肠杆菌或溶血性链球菌引起的动物子宫内膜炎；具体为由化脓性放线菌、坏死梭杆菌、拟杆菌、大肠杆菌或溶血性链球菌引起的奶牛子宫内膜炎。或，所述放射治疗为重离子束治疗，在本发明的实施例中具体为12c6+离子束治疗。本发明还提供了一种检测上述二价益生菌制剂在动物体内定殖的方法，包括如下步骤：1)将上述二价益生菌制剂导入动物体内(具体为灌胃)，导入4天后收集动物粪便；2)用引物对a和引物对b分别对所述动物粪便进行qpcr扩增，实现检测上述二价益生菌制剂在动物体内定殖；所述引物对a由序列表中序列3所示的单链dna分子和序列4所示的单链dna分子组成；所述引物对b由序列表中序列5所示的单链dna分子和序列6所示的单链dna分子组成。本发明还提供了一种，干酪乳杆菌jy300-8，其保藏编号为cgmccno.21303。本发明的有益效果：本发明从玉米秸秆分离鉴定具有益生功能的干酪乳杆菌jy，经辐照诱变和高通量筛选技术获得优良益生功能的突变菌株jy300-8；从jy300-8辅助12c6+离子治愈的乳腺癌bablc小鼠肠道中分离具有抗肿瘤效果的优势乳酸菌-罗伊氏乳杆菌jmr-01；进行了单一菌株、复合菌株抑制病原菌及体外抗乳腺癌细胞、结直肠癌细胞效果评价，以及优化的二价肠道益生菌在体内预防、治疗肿瘤及辅助重离子提高肿瘤治疗效果的益生菌制剂关键技术方案。在结直肠癌及her2阳性乳腺癌小鼠模型的研究中发现，二价肠道益生菌对结直肠癌和乳腺癌小鼠模型肿瘤的增殖具有明显的抑制作用，显著延长其存活。此外，二价肠道益生菌能显著提高重离子治疗乳腺癌小鼠治愈效率，并能显著延长其存活率。本发明创新性在于如下：1)通过肠道微生物-免疫-新型放疗轴线为肿瘤的防治提供新的思路；2)通过重离子诱变和高通量筛选技术选育性状优良、抗肿瘤增殖的益生菌；3)通过辐照诱变和高通量筛选技术选育开发替代抗生素物的动物饲料添加剂和预防和治疗犊牛腹泻、羔羊腹泻、奶牛乳房炎、奶牛子宫内膜炎的微生态制剂；4)在肿瘤治愈机体内分离抗肿瘤相关的肠道益生菌的方法和思路。总之，本发明提供了基于肠道益生菌治疗肿瘤、辅助放射治疗提高肿瘤治疗效果的方法和肠道益生菌为原料治疗肿瘤的方法。保藏说明菌种名称：干酪乳杆菌拉丁名：lactobacilluscasei分类命名：干酪乳杆菌lactobacilluscasei菌株编号：jy300-8保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2020年12月07日保藏中心登记入册编号：cgmccno.21303菌种名称：罗伊氏乳杆菌拉丁名：lactobacillusreuteri分类命名：罗伊氏乳杆菌lactobacillusreuteri菌株编号：jmr-01保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2020年12月07日保藏中心登记入册编号：cgmccno.21304附图说明图1为jy菌株的分子鉴定。图2为重离子辐照jy菌株的存活率。图3为jy300-8菌株的筛选，其中，((a)以hc值为指标筛选高胆盐耐受性突变株；(b)以od600为指标筛选高耐酸突变体；(c)突变株在人工胃肠道液中的存活率；(d)突变株的黏附率和乳酸产量统计。图4为jmr-01菌株分子进化树。图5为jy300-8和jmr-01在小鼠模型肠道中的定殖研究。图6为二价益生菌对结直肠癌小鼠肿瘤的治疗作用。图7为二价益生菌预防结直肠癌小鼠模型的研究。图8为二价益生菌对乳腺癌小鼠肿瘤的治疗作用。图9为二价益生菌辅助重离子治疗乳腺癌小鼠肿瘤的研究。图10为td菌株的16srrna分子鉴定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。下述实施例中部分致病菌如下：大肠杆菌atccc25922，金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003，沙门氏菌atcc14028购自上海鲁威科技有限公司。下述实施例中pbs缓冲液如无特殊说明，均为浓度为0.01mol/l、ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液。实施例1、jy菌株辐照诱变、筛选及优良突变株jy300-8的获得1、12c6+离子辐照诱变jy菌株采用乳酸杆菌分离纯化方法，用mrs培养基从玉米秸秆中分离纯化乳酸杆菌jy，jy菌株经16srdna分子鉴定为干酪乳杆菌(如图1所示)。为进一步提高其益生性能，利用兰州重离子加速器国家实验室(hirfl)tr4生物辐照终端提供的重离子束12c6+，对jy菌悬液进行辐照。剂量率为40gy/min，辐照能量为80mev/u，辐照剂量分别为0,40,80,120,160,200,300，400gy，每个剂量设三个重复，不同剂量下的存活率曲线如图2所示，由图2可知，重离子对干酪乳杆菌的半致死剂量为150gy。2、od600代替活菌数建立标准曲线乳酸杆菌jy在mrs培养基37℃厌氧发酵24h，得到jy菌悬液；再用无菌pbs分别调od600值至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，并采用梯度稀释平板涂布法统计各od600值下的活菌数。以活菌数为横坐标，od600值为纵坐标，建立标准曲线，用吸光值的测定代替后续菌株筛选过程中活菌数的统计。拟合的曲线方程为y＝0.04595x+0.09309，r2＝0.98633，其中，y为od600，x为活菌数(cfu/ml)。3、耐胆盐突变体的初筛以耐酸性(ph＝3)和胆盐耐受性(0.3％的胆盐)为主要筛选指标，结合人工胃液和人工肠液中菌株的存活率以及对肠上皮细胞的粘附性等指标进行了优良突变菌株的筛选(如图3所示)。耐胆盐突变体的初筛:每个辐照剂量下的菌悬液稀释至适当的浓度，并取100μl涂布于含有0.3g/100ml牛胆盐的碳酸钙-溴甲酚紫的选择性mrs固体平板培养基上。胆盐耐受性良好的菌株可以在培养基上生长形成菌落。由于乳酸菌发酵糖会产生有机酸，当菌落产生酸时，会结合培养基中的碳酸钙，生成乳酸钙，出现透明的溶钙圈。选择hc值大于原始菌株20％的单菌落划线保存于mrs斜面，37℃培养48h后进行后续筛选实验。hc值＝溶钙圈直径mm/菌落直径mm。从10500个单菌落中筛选出381株耐胆菌株(hc值比原菌株jy高出20％)(图3a)。4、耐酸突变体96孔板筛选采用6mol/lhcl调节mrs液体培养基ph至3后进行灭菌(115℃，30min)，冷却至室温后，按每孔100ul加至96孔板中，将上述3中保存的耐胆盐菌株采用竹签挑取少许，接种至96孔板的液体培养基中，37℃厌氧发酵24h，在600nm下测定菌液的吸光值，选择吸光值较原始菌株提高200％的菌落进行后续筛选。通过48孔板培养，筛选出了381株胆汁酸耐受性菌株，最终得到了71株胆汁酸耐受性菌株和耐酸突变株(图3b)。5、模拟人工胃肠液24孔板筛选高存活率菌株人工胃液(采用6mhcl调节pbs缓冲液ph至2.5，胃蛋白酶溶解至其中，使其终浓度为0.3g/100ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，制得人工胃液)采用0.22μm过滤除菌后按每孔2ml加入24孔板中，选择4中所筛选的71株胆汁酸耐受性菌株和耐酸突变株接种于24孔板的人工胃液中，于37℃静置培养，分别测定0h和3h各孔600nm下的吸光值，根据2中标准曲线计算活细菌数，并计算各菌株在人工胃液中的存活率。选取人工胃液作用3h后存活率高于80％的菌株，将其接种至24孔板的人工肠液(采用naoh调节pbs缓冲液ph至8，胰蛋白酶溶解至其中，使其终浓度为0.1g/100ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，制得人工肠液)中，37℃静置培养，分别测定0h和6h时各孔600nm下的吸光值，根据2中标准曲线计算活菌数，并计算各菌株在人工肠液中的存活率。选取人工肠液作用6h后存活率高于80％的菌株进行后续肠上皮细胞粘附性筛选。在24孔板上模拟胃液条件，从上述71株菌株中筛选出26株存活率较高的突变菌株(图3c)。原始菌株(辐射前的jy)在人工胃液(3h)和人工肠液(6h)的存活率分别为：70.83％和42.6％，26株突变菌株在人工胃液和人工肠液中的存活率均高于原菌株，其中，jy160-15,jy300-8,jy300-10在人工胃液和肠液中的存活率较高，jy160-15在人工胃液(3h)和人工肠液(6h)的存活率分别为：57.8％和66.09％，其在人工肠液的存活率较原始菌株(42.6％)提高了35.54％；jy300-8在人工胃液(3h)和人工肠液(6h)的存活率为：72.93％和80.91％，分别较原始菌株(70.83％和42.6％)提高了2.8％和47.35％；jy300-10在人工胃液(3h)和人工肠液(6h)的存活率为：85.54％和84.93％，分别较原始菌株(70.83％和42.6％)提高了17.2％和49.84％。6、肠上皮细胞高粘附性菌株筛选caco-2细胞由于其结构和功能与分化的小肠上皮细胞类似，含有类似的酶系和微绒毛结构，且易于培养，通常用来模拟体内肠细胞的研究。因此，选用caco-2细胞模型用于筛选具有高粘附性的优良益生菌突变菌株。将caco-2细胞(上海酶研生物科技有限公司，cc-y1089)在dmem培养基(含10％胎牛血清、1％青链霉素)中于37℃co2培养箱中培养，待细胞贴壁后，用edta-胰酶消化1min，终止消化后吹打成单细胞，转至6孔细胞培养板中，每孔2ml，调整每孔培养板中细胞数约为2×105cfu/孔，置于37℃co2培养箱中过夜。选取上述5得到的26株存活率较高的突变菌株接种于mrs液体培养基中37℃静置培养24h得菌液，各菌株菌液于8000rpm下离心15min收集菌体沉淀，无菌pbs洗涤菌体沉淀两次后重悬浮于不含胎牛血清，不含双抗的dmem培养基中，调节菌液浓度至1×109cfu/ml。6孔板过夜培养待细胞贴壁后，用无菌pbs清洗caco-2细胞培养板2次，加入1ml调好浓度的菌悬液，共同培养2h后用无菌pbs洗涤4次，洗去未粘附的菌体细胞，加入1ml1％tritonx100，使粘附的菌体同细胞分离，吹打混匀后，采用梯度稀释平板涂布法统计粘附细菌数，以共培养前的细菌数为对照，计算菌株的粘附率，粘附率高于85％的菌株保存于mrs斜面。以caco-2细胞(上海酶研生物科技有限公司，cc-y1089)为模型，对26株优良菌株的粘附和产酸能力进行评价。结果表明，10株菌株具有较高的粘附力和产酸能力(图3d)。其中，粘附能力最强的菌株是jy160-15，jy300-10，jy300-8，乳酸菌黏附的细胞的数量是1.05×108cfu/ml，1.01×108cfu/ml，7.73×107cfu/ml(乳酸菌初始数量为1.22×109cfu/ml)，粘附率分别为88.26％，88.09％和86.81％，较对照提高了29.98％，29.73％和27.85％，乳酸含量分别比原始菌株jy提高50％、83.3％和58.3％。随后根据菌株自凝聚和疏水性实验筛选得到jy300-8是最优菌株，具体实验结果为：菌株jy300-8的自凝聚百分比在24h达到71.7％，比菌株jy、jy160-15、jy300-10分别高19.7％、28.8％、29.6％(p＜0.05)；jy300-8菌株的疏水性百分比为72.3％，比菌株jy、jy160-15、jy300-10分别高4.1％、8.0％、7.5％(p＜0.05)。7、jy300-816srrna序列测定用mrs液体培养基培养干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)jy300-8，液体培养24h后分别离心取菌体沉淀，取适量按照细菌基因组提取试剂盒要求，提取jy300-8的全基因组dna，提取后用微黑子在酶标仪中检测所提取的基因组dna的质量和纯度，检验合格后，分别用细菌通用引物(27f和1492r，序列如下表1所示)进行pcr扩增得16srdna，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测电泳条带，将条带清晰且在分子量在1500bp左右pcr产物送至上海生工进行sanger一代测序，得到序列为序列1。经过比对，jy300-8为干酪乳杆菌，随后将性状优良且稳定的干酪乳杆菌jy300-8于2020年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21303，该菌株的分类命名为干酪乳杆菌lactobacilluscasei，为乳杆菌科乳杆菌属干酪乳杆菌种。实施例2、罗伊氏乳杆菌jmr-01的分离、纯化、鉴定采用乳酸杆菌分离纯化方法，从jy300-8辅助12c6+离子治愈的bablc乳腺癌小鼠肠道中分离纯化优势乳酸杆菌jmr-01，具体为：收集jy300-8辅助12c6+治愈的乳腺癌小鼠模型粪便若干，按照梯度稀释法对粪便样品进行无菌稀释(稀释梯度为10-1,10-2,10-3,10-4)，挑取合适梯度(10-4)的粪便菌液以平板划线方法在mrs固体琼脂培养基上划线培养，37℃培养36h，挑取mrs琼脂平板上菌落形态最大、表面光滑的单菌落，按如上方法继续纯化2-3次，得一株在粪便菌液中优势的乳酸杆菌菌株jmr-01。将乳酸杆菌菌株jmr-01按照如下方法进行分子鉴定：(1)取发酵24h的jmr-01乳酸菌菌液1ml于离心管中，10000rpm离心1min，弃上清液，菌体沉淀中加180μl溶菌酶，37℃放置2h。(2)严格按照细菌基因组dna提取试剂盒说明书提取jmr-01菌株的基因组dna。(3)吸取2μljmr-01菌株dna提取液加至核酸检测板于酶标仪检测od260/od280，od260/od280值在1.8-2.0之间为纯dna，保存于-20℃冰箱备用。(4)pcr扩增：扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃延伸10min。上述pcr扩增体系如下表1所示：表1为25μlpcr体系(5)pcr产物电泳检测：1)制胶：准确称取1g琼脂糖粉末于烧杯中，加入100ml1×tae缓冲液,放置在微波炉内加热煮沸3次至琼脂糖粉末完全融化呈透明状，冷却至60℃左右时加入5μli型核酸染料，混匀。倒入洗干净的制胶槽内，待胶块完全凝固后，拔出梳子，取掉胶块放置于电泳槽内，加1×tae电泳缓冲液没过凝胶。2)加样：在微量离心管里混合pcr产物与上样缓冲液，样品与上样缓冲液比例为5:1，加样量为10ul，点样及dnamarkerd2000。3)电泳：加样后进行电泳，电压为120v，电泳时间40min。4)电泳完毕后，取出凝胶，观察照相，采用凝胶成像系统拍照保存。5)送样测序：pcr产物送至苏州生工生物有限公司，进行16srdna测序分析，序列为序列2；6)利用ncbi的blast程序比对分析16srdna基因序列测序结果。采用mega5.0建立系统发育树(图4)，确定菌株种属。jmr-01经16srdna分子鉴定为罗伊氏乳杆菌。jmr-01于2020年12月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21304，该菌株的分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillusreuteri，为乳杆菌科乳杆菌属罗伊氏乳杆菌。罗伊氏乳杆菌作为国家食品药品监督管理局规定的可用于保健食品的益生菌菌种名目。实施例3、菌株抑制肿瘤细胞增殖的研究一、菌株体外抗乳腺癌细胞的研究为了进一步验证从乳腺癌治愈的肠道微生物组中分离纯化的优势乳酸杆菌-罗伊氏乳杆菌jmr-01对乳腺癌细胞的抑制作用，采用mtt法检测如下不同益生菌抑制乳腺癌tubo细胞的增殖能力：干酪乳杆菌(td，为实验室分离所得，经16srrna鉴定为干酪乳杆菌(如图10所示))、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus，鼠李糖乳杆菌为吉林标普生物科技有限公司益生菌冻干粉中分离而来，产品批号为：xz-jdq-1808a)、实施例1获得的干酪乳杆菌jy300-8和实施例2获得的罗伊氏乳杆菌jmr-01。具体为：乳腺癌tubo细胞(丰晖生物有限公司，cl0719)消化后，用dmem培养基调整细胞浓度为106个/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。将细胞培养板置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜，待细胞贴壁后备用。将不同益生菌菌株的活菌体在不含双抗的dmem培养基中稀释，加入已贴壁的96孔板细胞培养板中，每孔100μl。调整菌体与癌细胞的最终比例(cfu:cells数量)为1∶1，分别检测益生菌菌体细胞对乳腺癌tubo细胞增殖的抑制作用。以不添加益生菌菌株的tubo细胞为阴性对照。5％co2、37℃条件下分别培养24h、48h、72h、96h，在每个时间点到达前4h每孔中加入10μl5mg/ml的mtt溶液，置于培养箱中继续孵育4h后，吸掉各小孔内的液体，然后每孔中加入150μl二甲基亚砜，置于摇床振荡10min。用酶标仪检测96孔细胞培养板在490nm处的吸光值，计算肿瘤细胞抑制率。抑制率％＝(1-实验组孔吸光值/阴性对照孔吸光值)×100％不同益生菌对乳腺癌细胞tubo的抑制情况如表2所示。表2不同益生菌对乳腺癌细胞tubo的抑制率(1：1)由表2所示，在jy300-8:肿瘤细胞(cfu:cells)＝1：1时，在48h，jy300-8对乳腺癌tubo细胞的抑制率为82.91％，表明该菌株能显著抑制乳腺癌的发生和发展；益生菌jmr-01菌株在jmr-01:肿瘤细胞(cfu:cells)＝1：1时，48h对乳腺癌tubo细胞具有极强的抑制能力(如表1所示)，jmr-01在24h对乳腺癌tubo细胞具有很强的抑制作用；在四种益生菌中，jmr-01和jy300-8抑制乳腺癌tubo细胞增殖的能力显著强于鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌td，可作为进一步优化抗肿瘤细胞的优良候选菌株；但jy300-8和jmr-01在长时间作用如72h抑制率均不超过71％。这表明益生菌jmr-01和jy300-8在治疗恶性肿瘤乳腺癌方面具有很大的潜力。二、菌株体外抑制结直肠癌细胞的研究1、jy300-8体外抑制结直肠癌细胞的研究在体外采用mtt法(具体方法与上述一中的相同)进行jy300-8抑制结直肠癌细胞ct26(明舟生物科技有限公司，mz-0054)的研究，不同的是jy300-8和结直肠癌细胞的cfu:cells比例不同，采用的肿瘤细胞为结直肠癌细胞ct26。结果如表3所示，在jy300-8:结直肠癌细胞(cfu:cells)＝1：1时，jy300-8对结直肠癌ct26细胞无抑制作用。尝试调整jy300-8和结直肠癌细胞的cfu:cells比例，发现当jy300-8:结直肠癌细胞(cfu:cells)＝100：1时，作用48h后，jy300-8对ct26细胞的抑制率大于73％，才具有很好抗结直肠癌的潜力。因此，jy300-8抗结直肠癌细胞需要大量的jy300-8菌，由于益生菌的使用有一定用量的限制，不利于该菌株抗结直肠癌的临床转化。表3为jy300-8不同浓度菌体对ct-26细胞的抑制率2、jmr-01体外抑制结直肠癌细胞的研究在体外采用mtt法(具体方法与上述一中的相同)进行jmr-01抑制结直肠癌细胞ct26的研究，其中jmr-01和结直肠癌细胞的cfu:cells比例为1:1，采用的肿瘤细胞为结直肠癌细胞ct26。结果如表4所示，jmr-01菌株在jmr-01:结直肠癌细胞(cfu:cells)＝1：1时，对结直肠癌ct26细胞具有一定的抑制效果，24h对ct26细胞的抑制率为28.44％。表4为罗伊氏乳杆菌jmr-01对ct-26细胞的抑制率(1：1)这表明jmr-01在治疗恶性肿瘤结直肠癌方面具有很大的潜力。三、二价益生菌抑制乳腺癌细胞的体外研究由上述一和二可知，不同浓度的单一菌株jy300-8和jmr-01分别对结直肠癌ct26和乳腺癌tubo细胞具有较强的抑制作用，尤其是乳腺癌tubo细胞，单一菌株jy300-8和jmr-01抑制率都很高，为进一步增强抑制效果，结合不同益生菌的特点，研究了jy300-8和jmr-01按不同比例复合对乳腺癌tubo细胞的抑制效果。具体如下：不同比例的二价益生菌菌液：分别将培养24h的jy300-8菌液和jmr-01菌液菌体浓度调至1ⅹ109cfu/ml，按一定体积比例混匀，使jy300-8和jmr-01的菌体cfu比分别为1:1、1:2、1:3和1:4。jy300-8菌液为将jy300-8菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，浓度为4.07ⅹ109cfu/ml。jmr-01菌液为将jmr-01菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，浓度为3.02ⅹ109cfu/ml。乳腺癌tubo细胞消化后，用dmem培养基调整细胞浓度为106个/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。将细胞培养板置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜，待细胞贴壁后备用。将不同比例的二价益生菌菌液加入已贴壁的96孔板细胞培养板中，每孔加入100μl不同比例二价益生菌菌液，调整二价益生菌菌液中总菌体与癌细胞的最终比例(cfu:cells数量)为1∶1，分别检测不同比例的二价益生菌菌液对乳腺癌tubo细胞增殖的抑制作用，设置5个平行实验。以不添加二价益生菌菌液的细胞为阴性对照。5％co2、37℃条件下分别培养24h、48h、72h、96h，在每个时间点到达前4h每孔中加入10μl5mg/ml的mtt溶液，置于培养箱中继续孵育4h后，吸掉各小孔内的液体，然后每孔中加入150μl二甲基亚砜，置于摇床振荡10min。用酶标仪检测96孔细胞培养板在490nm处的吸光值，计算肿瘤细胞抑制率。抑制率％＝(1-实验组孔吸光值/阴性对照孔吸光值)×100％结果如表5所示，不同比例的二价益生菌(jy300-8和jmr-01)对乳腺癌tubo细胞均具有明显抑制增殖的作用。在不同比例组合中，jy300-8:jmr-01＝1：2的组合对乳腺癌细胞的抑制作用更强(p＜0.05)，在48h达到抑制率为86.74％。与单价益生菌对tubo细胞的抑制率相比(见表2所示)，72h时不同比例的二价益生菌对tubo抑制率均高于单价益生菌，这表明与单加益生菌相比，二价益生菌对乳腺癌tubo的长期抑制潜力更强，可用于动物模型进一步研究该比例组合的二价益生菌对乳腺癌防治作用。表5为不同比例二价益生菌对乳腺癌tubo细胞的体外抑制结果实施例4、jy300-8和jmr-01菌株在抗病原微生物的研究及在替代抗生素方面的应用人体内常见的致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌和沙门氏菌等，机体感染后会引发胃肠疾病、化脓、败血症等，严重者危及生命。乳酸菌的次级代谢产物——有机酸、细菌素、过氧化氢等，可以有效抑制人体肠道中致病菌的生长繁殖，因此研究上述分离纯化的乳酸菌的抗菌性。一、jy300-8菌株的抑菌及其药敏性研究1、jy300-8菌株的抑菌研究jy300-8菌液为将jy300-8菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，菌体浓度为4.07ⅹ109cfu/ml。将致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌分别用接种环接种至lb液体培养基中，150r/min、37℃下震荡培养24h，调整各菌液od600值为0.8左右，取200μl致病菌液均匀涂布到lb琼脂平板上，于超净工作台中放置30min自然晾干。每个琼脂平板上放置3-4个牛津杯，牛津杯中添加200μljy300-8菌液后于37℃恒温培养24h，采用游标卡尺测定jy300-8对各致病菌的抑菌圈直径。以原始菌株jy为对照。通过测得抑菌圈的直径评价益生菌的抑菌能力，抑菌圈直径15-20mm表示强抑菌，抑菌圈直径为10-15mm表示抑菌，抑菌圈直径为5-10mm表示弱抑菌，抑菌圈直径为0-5mm表示不抑菌。结果如下：干酪乳杆菌jy300-8菌液对三种致病菌均有显著的抑制效果，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌圈分别达到25.35±1.23mm、18.37±0.44mm、17.88±0.69mm。原始菌株jy对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌圈分别达到19.4±1.44mm、15.80±1.75mm、14.80±1.45mm。上述结果表明，jy300-8菌株能强抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的繁殖，抑制沙门氏菌的生长繁殖，与原始菌株jy相比，jy300-8对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑制能力显著提高。2、jy300-8菌株的药敏性研究jy300-8菌液为将jy300-8菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的jy300-8菌液。将jy300-8菌液浓度调整至108cfu/ml，均匀涂布在mrs琼脂平板上，于超净工作台中放置30min自然晾干。将标准药物纸片均采购于杭州滨和微生物试剂有限公司(诺氟沙星(180910)、头孢拉定(18092)、氨苄西林(180826)、头孢曲松(180829))采用无菌镊子夹取，贴于平板表面，置37℃恒温培养箱中培养24h后观察其药敏性。结果表明，jy300-8对氨苄西林、头孢曲松、头孢拉定三种常见的抗生素高度敏感，对诺氟沙星不敏感。说明jy300-8在作为抗生素使用时不存在将抗性基因水平转移给宿主的问题，生物安全程度较高。综上，jy300-8符合益生菌规定的必要条件，可作为抗生素替代物用于预防和/或治疗由产肠毒素性埃希氏大肠杆菌(etec)、弯曲杆菌、沙门氏杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌等引起的犊牛腹泻或羔羊腹泻，由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等引起的奶牛乳房炎，以及由化脓性放线菌、坏死梭杆菌、拟杆菌、大肠杆菌、溶血性链球菌等引起的奶牛子宫内膜炎。二、jmr-01的抑菌研究罗伊氏乳杆菌jmr-01菌液为将jmr-01在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，菌体浓度3.02ⅹ109cfu/ml。将致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌分别用接种环接种至lb液体培养基中，150r/min、37℃下震荡培养24h，调整各菌液od600值为0.8左右，取200μl致病菌液均匀涂布到lb琼脂平板上，于超净工作台中放置30min自然晾干。每个琼脂平板上放置3-4个牛津杯，牛津杯中添加200μl罗伊氏乳杆菌jmr-01菌液后于37℃恒温培养24h，采用游标卡尺测定jy300-8对各致病菌的抑菌圈直径。通过测得抑菌圈的直径评价益生菌的抑菌能力，抑菌圈直径15-20mm表示强抑菌，抑菌圈直径为10-15mm表示抑菌，抑菌圈直径为5-10mm表示弱抑菌，抑菌圈直径为0-5mm表示不抑菌。结果如下：罗伊氏乳杆菌jmr-01菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌圈分别达到14.76±0.49mm、9.68±0.50mm、9.00±0.16mm。这表明jmr-01菌株能强抑制大肠杆菌，对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌也具有弱抑制效果，也满足益生菌的要求。三、jy300-8和jmr-01的联合抑制病原菌的研究jy300-8菌液为将jy300-8菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，菌体浓度为4.07ⅹ109cfu/ml。jmr-01菌液为将jmr-01菌株在mrs培养基中37℃条件培养24h，得到的菌液，菌体浓度为3.02ⅹ109cfu/ml。二价益生菌菌液：分别将培养24h的jy300-8菌液和jmr-01菌液菌体浓度调至1ⅹ109cfu/ml，按一定体积比例混匀，使jy300-8和jmr-01的菌体cfu比为1:2，得到的复合菌液(其中，jy300-8和jmr-01的cfu比为1：2)。将致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌分别用接种环接种至lb液体培养基中，150r/min、37℃下震荡培养24h，调整各菌液od600值为0.8左右，取200μl致病菌液均匀涂布到lb琼脂平板上，于超净工作台中放置30min自然晾干。每个琼脂平板上放置3-4个牛津杯，牛津杯中添加200μl复合菌液后于37℃恒温培养24h，采用游标卡尺测定复合菌液对各致病菌的抑菌圈直径。通过测得抑菌圈的直径评价益生菌的抑菌能力，抑菌圈直径15-20mm表示强抑菌，抑菌圈直径为10-15mm表示抑菌，抑菌圈直径为5-10mm表示弱抑菌，抑菌圈直径为0-5mm表示不抑菌。结果如下：二价益生菌菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌圈分别达到13.36±0.36mm、14.08±1.12mm、9.3±0.55mm。上述结果表明二价益生菌能强抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖，但对沙门氏菌具有弱抑制效果，满足益生菌的要求。实施例5、二价益生菌在小鼠模型肠道内的定殖研究一、jy300-8和jmr-0116srrna靶向引物设计jy300-8和jmr-0116srrna靶向引物的设计基于各自的16srrna序列，按照如下引物设计原则，利用网站(http://www.oligoarchitect.com/loginservlet)设计用于qpcr扩增的jy300-8和jmr-0116srrna靶向引物。根据jy300-8的16srrna序列，进行特异性引物设计，如表6：表6为干酪乳杆菌的16s靶向引物根据jmr-01的16srrna序列，进行特异性引物设计，如表7.表7为jmr-01的16s靶向引物二、jy300-8和jmr-0116srrna靶向引物筛选用mrs液体培养基分别培养干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)等实验室现有的乳杆菌属微生物，液体培养36h后离心取菌体沉淀，悬于pbs中，各种菌等体积混合后，取适量按照细菌基因组提取试剂盒要求，提取混合菌的基因组dna，提取后用微黑子在酶标仪中检测基因组的提取质量和纯度，检验合格后，分别用特异性引物进行pcr扩增，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测电泳条带，将扩增产物符合特异性引物扩增条带范围的pcr产物送样测序进一步鉴定，筛选jy300-8和jmr-01的16srrna的靶向引物。结果如下：干酪乳杆菌jy300-8的16srrna靶向引物为1.cas(f-cas.1/r-cas.1)，罗伊氏乳杆菌jmr-01的16srrna靶向引物为f/rleu.1。三、qpcr检测jy300-8和jmr-01在小鼠模型肠道的定殖1、二价益生菌活菌及灭活菌的制备用竹签分别挑取jy300-8和jmr-01菌株斜面少许，分别接种于mrs液体种子培养基中，37℃静置培养18h，以10％(v:v)的比例转接于mrs液体发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱中发酵24h。菌液4000rpm下离心30min，弃上清，pbs洗涤菌体沉淀2次，得到jy300-8菌液和jmr-01菌液，再采用无菌pbs分别调整jy300-8菌液和jmr-01菌液的浓度均为1ⅹ109cfu/ml，按照jy300-8菌液:jmr-01菌液(体积比)＝1：2混合，制得二价益生菌菌悬液(lp，其中，jy300-8和jmr-01的cfu比为1：2)。将二价益生菌菌悬液于105℃下高压蒸汽灭菌30min，制得灭活菌悬浮液(ip)。活菌(lp)及灭活菌(ip)悬浮液均保存于4℃冰箱中备用。2、二价益生菌在小鼠模型肠道的定殖6-8周龄spf级bablc雄性小鼠随机分为4组，每组10只。分组处理方案如下：(1)对照组：采用8号小鼠灌胃针，灌胃100μl无菌pbs缓冲液；(2)活菌灌服组(lp)：灌胃上述一制备的二价益生菌菌悬液100μl(1×109cfu/ml)；(3)灭活菌组(ip)：灌胃上述一制备的灭活菌悬浮液100μl(1×109cfu/ml)；分别于灌胃0天(开始灌胃的前一天)和4天小鼠粪便，严格按照tianampstooldnakit试剂盒说明书提取新鲜收集的小鼠粪便微生物组基因组dna，提取的基因组dna经过酶标仪检测纯度和浓度合格后，调整其浓度为40ng/ul后用作qpcr反应的模板。按照sybrgreenpcrmastermix试剂盒要求进行qpcr扩增，检测jy300-8和jmr-01在乳腺癌小鼠模型肠道的定殖状态。小鼠肠道内jy300-8和jmr-01的定殖情况采用qpcr技术进行研究。经过设计、合成、筛选的jy300-8和jmr-01的16s靶向引物如下表8。肠道微生物的靶向引物f/r-tot的序列依次为gcaggcctaacacatgcaagtc/ctgctgcctcccgtaggagt。选择肠道微生物的靶向引物作为内参，以目标益生菌的靶向引物为扩增引物可特异性地检测目标益生菌在肠道总微生物组中的比例。表8为jy300-8和jmr-0116srna靶向引物初始时间(0d)结果如图5a可知，pbs组，复合活菌菌液(lp)及灭活菌(ip)组肠道微生物中jy300-8(l.casei)和jmr-01(l.reuteri)均比较接近，无显著性差异。分别灌服pbs、lp及ip4天时由图5b可知，灌服了二价灭活菌(ip)的小鼠肠道中jy300-8和jmr-01分别为对照的1.745和0.59倍，与对照组无明显差异；灌服了二价活菌(lp)的小鼠肠道中jy300-8和jmr-01分别是对照的7.099和4.952倍，这说明益生菌活菌jy300-8和jmr-01在灌服4d时在小鼠体内完成了定殖，可在机体肠道中发挥益生功能。实施例6、二价益生菌治疗结直肠癌小鼠模型的研究一、二价益生菌活菌及灭活菌的制备用竹签分别挑取jy300-8和jmr-01菌株斜面少许，分别接种于mrs液体种子培养基中，37℃静置培养18h，以10％(v:v)的比例转接于mrs液体发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱中发酵24h。菌液4000rpm下离心30min，弃上清，pbs洗涤菌体沉淀2次，得到jy300-8菌液和jmr-01菌液，再采用无菌pbs分别调整jy300-8菌液和jmr-01菌液的浓度为1ⅹ109cfu/ml，按照jy300-8菌液:jmr-01菌液(体积比)＝1：2混合，制得二价益生菌菌悬液(lp，其中，jy300-8和jmr-01的cfu比为1：2)。将二价益生菌菌悬液于105℃下高压蒸汽灭菌30min，制得二价灭活菌悬浮液(ip)。活菌(lp)及灭活菌(ip)悬浮液均保存于4℃冰箱中备用。二、二价益生菌体内抑制结直肠癌小鼠模型的研究6-8周龄spf级bablc雄性小鼠通过皮下注射肿瘤细胞的方式进行结直肠癌小鼠模型的诱导。具体为：将结直肠癌ct-26细胞复苏培养传代至适宜状态，edta-胰蛋白酶消化，吹散成单细胞，计数，pbs调整细胞浓度为1×107个/ml。balbc小鼠后背部皮下接种，接种量为100ul，即肿瘤细胞接种量为5×106个/只，接种后每日观察小鼠的生长情况。接种后第10天起采用游标卡尺每日测量肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积。待肿瘤体积超过100mm3时(接种后10天)，表明肿瘤模型建立成功，随机将balb/c小鼠肿瘤模型随机分为4组，每组10只，进行如下实验：(1)对照组：采用8号小鼠灌胃针，每天灌胃2次，每次100μl无菌pbs缓冲液；(2)活菌灌服组(lp)：每天灌胃2次上述一制备的二价益生菌菌悬液，每次100μl(1×109cfu/ml)；(3)灭活菌组(ip)：每天灌胃2次上述一制备的灭活菌悬浮液，每次100μl(1×109cfu/ml)；(4)结直肠癌药物组(dfur)：按照去氧氟尿苷胶囊(dfur)的使用说明书给予结直肠小鼠灌服dfur，每天灌服两次；(5)正常小鼠：每天自由饮水，不进行灌胃处理。按照接种后时间算起，在接种后第10天检测各组小鼠肿瘤体积及存活率。肿瘤体积v＝1/2×a×b2，其中，v代表肿瘤体积；a代表肿瘤的最长径；b代表肿瘤的最短经。实验结果如图6所示，二价益生菌对结直肠癌模型小鼠的具有显著的干预效果。活菌灌服组(lp)和灭活菌组(ip)及结直肠癌药物组(dfur)对结直肠癌具有显著的抑制效果，其肿瘤体积显著低于对照组(pbs处理组)，尤其是活菌对结直肠癌的控制最好，肿瘤体积最小。在接种后42d时，结直肠癌小鼠pbs对照组的存活率降低至50％，活菌组和药物组存活率显著高于对照组(存活率为90％)，灭活菌组存活率为70％，由此可知二价益生菌(jy300-8：jmr-01＝1：2)对结直肠癌模型小鼠的肿瘤的增殖具有明显的抑制作用，并能显著延长其存活。实施例7、二价益生菌体内预防结直肠癌小鼠模型的研究6-8周龄的bablc雄性小鼠随机分为5组，每组30只。小鼠适应环境1周后，按如下分组进行小鼠灌胃处理。(1)对照组(control)：采用8号小鼠灌胃针，每天灌胃2次，每次100μl无菌pbs缓冲液；灌胃2周进行肿瘤模型诱导，肿瘤细胞接种后持续灌胃；(2)活菌组(lp)：每天灌胃2次实施例6的一制备的二价益生菌菌悬液(jy300-8和jmr-01的cfu比为1：2)，每次100μl二价益生菌菌悬液(1×109cfu/ml)；灌胃2周进行肿瘤模型诱导，肿瘤细胞接种后持续灌胃；(3)灭活菌组(ip)：每天灌胃2次实施例6的一制备的灭活菌悬浮液，每次100μl，灌胃2周进行肿瘤模型诱导，肿瘤细胞接种后持续灌胃；(4)商品益生菌制剂对照组(sp,吉林标普生物科技有限公司益生菌冻干粉，产品批号为：xz-jdq-1808a)：商品益生菌制剂调节浓度1×109cfu/ml，每天灌胃2次，每次1×109cfu/ml；灌胃2周进行肿瘤模型诱导，肿瘤细胞接种后持续灌胃；(5)正常小鼠：每天自由饮水，不进行灌胃处理；除正常小鼠外，其他各组小鼠连续2周灌胃处理后进行结直肠癌肿瘤模型的诱导，具体如下：ct-26细胞复苏培养传代至适宜状态，edta-胰蛋白酶消化，吹散成单细胞，计数，pbs调整细胞浓度为1×107个/ml。balbc小鼠腹股沟皮下接种，接种量为100ul,即肿瘤细胞接种量为5×106/只，接种后每日观察小鼠的生长情况。统计至对照组全部小鼠生长出肿瘤或无明显肿瘤生成为止(统计时间一般超过15d)。结果如表9所示，由表9可知二价益生菌可显著预防肿瘤的发生，与对照组相比，复合活菌对小鼠模型结直肠癌的预防率达到31％，同时其预防率显著高于商品益生菌组(13.9％)，这表明二价活菌可显著控制肿瘤的发生，这对结直肠癌的治疗提供了新的视角。表9为二价益生菌对结直肠癌小鼠模型的预防结果分组未出瘤数(只)出瘤率(％)预防率(％)lp组10/3066.731ip组8/3073.324.2商品益生菌组5/3083.313.9control1/3096.7-按照建模成功后统计存活率如图7所示，在建模成功后102d时，对照组结直肠癌小鼠的存活率为0，与对照相比，lp治疗组结直肠癌小鼠存活率提高了43.3％，且肿瘤小鼠中出现一只痊愈小鼠。这表明二价活菌不但可以抑制肿瘤的发生，还能在一定程度上延长结直肠癌小鼠的寿命，控制肿瘤的发展。此外，采用jy300-8菌株单独做预防结直肠癌的小鼠模型研究，灌服两周干酪乳杆菌jy300-8活菌及灭活菌液的小鼠模型在肿瘤接种24d时，发现该菌没有预防ct26肿瘤细胞诱导的小鼠模型结直肠癌发生的作用，只能在一定时间内控制肿瘤的增长速度。jy300-8活菌(浓度为1ⅹ109cfu/ml)及灭活菌液抑瘤率分别达到60.33％和42.96％。实施例8、二价益生菌治疗乳腺癌小鼠模型的研究6-8周龄bablc雌性小鼠通过皮下注射乳腺癌细胞的方式进行乳腺癌小鼠模型(her2阳性乳腺癌)的诱导。具体为：将tubo细胞(her2过表达的鼠源乳腺癌细胞系)复苏培养传代至适宜状态，edta-胰蛋白酶消化，吹散成单细胞，计数，pbs调整细胞浓度为1×106个/ml。balbc小鼠后背部皮下接种，接种量为100ul,即肿瘤细胞接种量为5×105/只，接种后每日观察小鼠的生长情况。接种后第10天起采用游标卡尺每日测量肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积。待肿瘤体积超过100mm3时(接种后10天)，表明肿瘤模型建立成功，随机将balbc小鼠肿瘤模型随机分为4组，每组15只，进行如下实验：(1)对照组：采用8号小鼠灌胃针，每天灌胃2次，每次100μl无菌pbs缓冲液；(2)活菌灌服组(lp)：每天灌胃2次实施例5的一制备的二价益生菌菌悬液，每次100μl(1×109cfu/ml)；(3)灭活菌组(ip)：每天灌胃2次实施例5的一制备的灭活菌悬浮液，每次100μl(1×109cfu/ml)；(4)正常小鼠：每天自由饮水，不进行灌胃处理；按照接种后时间算起，在接种肿瘤细胞后第10天监测各组小鼠肿瘤体积及存活率。肿瘤体积v＝1/2×a×b2，其中，v代表肿瘤体积；a代表肿瘤的最长径；b代表肿瘤的最短经。二价益生菌对乳腺小鼠模型的治疗结果如图8所示，由图8a可知活菌灌服组(lp)和灭活菌组(ip)均对乳腺癌具有显著的抑制效果，其肿瘤体积显著低于对照组(pbs处理组)，尤其是灭活菌对乳腺癌的控制最好，肿瘤体积最小。由图8b可知，在接种后82d时，乳腺癌癌小鼠pbs对照组的存活率降低至0，灭活菌组存活率显著高于对照组为35％，且总体治愈率为25％。由此可知灭活的二价益生菌(jy300-8：jmr-01＝1：2)对乳腺癌小鼠的模型肿瘤的增殖具有明显的抑制作用，并能显著延长其存活。实施例9、二价益生菌辅助12c6+治疗乳腺癌小鼠模型的研究6-8周龄bablc雌性小鼠通过皮下注射乳腺癌细胞的方式进行乳腺癌小鼠模型的诱导，具体方法参见实施例8。肿瘤模型建立成功时，随机将balbc小鼠肿瘤模型随机分为5组，实验组每组15只，且每组设长期观察组，动物数量为26只，此时开始灌胃处理。分组及益生菌的治疗方案如下：(1)对照组(pbs)：采用8号小鼠灌胃针，每天灌胃2次，每次100μl无菌pbs缓冲液。给予持续灌胃，直至实验终点；(2)ir组：以剂量率0.5gy/min，辐照剂量为8gye，采用甘肃省武威肿瘤医院重离子中心的重离子束(12c6+)进行辐射治疗。(3)ir+活菌组(ir+lp)：肿瘤建模成功后每天灌胃2次实施例5的一制备的二价益生菌菌悬液，每次100μl(1×109cfu/ml)；灌胃1周后，同ir组条件进行肿瘤局部辐照。辐照后给予持续灌胃，直至实验终点；(4)ir+灭活菌组(ir+ip)：肿瘤建模成功后每天灌胃2次实施例5的一制备的灭活菌悬浮液，每次100μl(1×109cfu/ml)；灌胃1周后，同ir组条件进行肿瘤局部辐照。辐照后给予持续灌胃，直至实验终点；(5)正常小鼠：每天自由饮水，不进行灌胃处理.检测到jmr-01和jy300-8定殖到小鼠体内时(灌胃5d)，以剂量率0.5gy/min，辐照剂量为8gye，采用甘肃省武威肿瘤医院重离子中心的重离子束(12c6+)进行辐照治疗。随后每两天测其肿瘤和统计存活率变化。治愈率＝肿瘤痊愈小鼠数量/建模成功小鼠数量×100％按照接种后时间算起，结果表明：二价益生菌辅助重离子辐照可显著提高乳腺小鼠模型的治疗结果(见图9所示)。辐照组(ir)、辐照+活菌灌服组(ir+lp)和辐照+灭活菌组(ir+ip)均对乳腺癌具有显著的抑制效果，其肿瘤体积显著低于对照组(pbs处理组)。在肿瘤细胞接种后0-120d时，辐照+灭活菌组(ir+ip)小鼠存活率为100％，且肿瘤体积控制较好，因此在前期辐照+灭活菌组(ir+ip)对乳腺癌小鼠模型的控制较好。在接种肿瘤细胞202d，pbs对照组乳腺癌小鼠的存活率为0，辐照+活菌组对乳腺癌的控制最好，肿瘤体积最小，显著低于pbs，低于ir组，其存活率为61.54％，显著高于辐照+灭活菌组(42.31％)和辐照组(38.46％)；且辐照+活菌组治愈率为41.23％，显著高于辐照+灭活菌组(38.46％)和辐照组(23.08％)。由此可知二价益生菌(jy300-8：jmr-01＝1：2)辅助重离子辐照治疗显著提高乳腺癌小鼠模型肿瘤的治愈效率，并显著延长其存活率，为her2阳性乳腺癌的防治疗提供新的思路。sequencelisting<110>中国科学院近代物理研究所<120>一种肠道益生菌及其在治疗肿瘤和替代抗生素中的应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1439<212>dna<213>lactobacilluscasei<400>1tatacatgcagtcgaacgagttttggtcgatgaacggtgcttgcactcgtgattcgactt60aaaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataac120atttggaaacagatgctaataccgcataaatccaagaaccgcatggttcttggctgaaag180atggcgcaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaac240ggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactg300agacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaag360tctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttg420gagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccac480ggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttat540tgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaacc600gaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgt660gtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtc720tgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagt780ccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagct840aacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattga900cgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacctta960ccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatg1020acaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaac1080gagcgcaacccttatgactagttgccagcattcagttgggcactctagtaagactgccgg1140tgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggct1200acacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctc1260ttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgc1320tagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgccc1380gtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaaccctttagggagcgag1439<210>2<211>1238<212>dna<213>lactobacillusreuteri<400>2gcagtcgtacgcactggcccaactgattgatggtgcttgcacctgattgacgatggatca60ccagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgccccggagcgggggataac120atttggaaacagatgctaataccgcataacaacaaaagccacatggcttttgtttgaaag180atggctttggctatcactctgggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaac240ggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatggaactg300agacacggtccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaag360cctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttg420gagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgcagtgacggtatccaaccagaaagtcac480ggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttat540tgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggtctgatgtgaaagcctttcggcttaac600cgaagaagtgcatcggaaaccgggcgacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatg660tgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggt720ctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtag780tccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccggagc840taacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattg900acgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaacctt960accaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagataaggcgttcccttcggggacgcaat1020gacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaa1080cgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccg1140gtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcagatcatcatgccccttatgacctgggc1200tacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcaa1238<210>3<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>3gctgtctggtctgtaact18<210>4<211>19<212>dna<213>artificialsequence<400>4cggaatgcttaatgcgtta19<210>5<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>5gctaataccgcataacaaca20<210>6<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>6aagccgttaccttaccaa18当前第1页12