橡胶树转录因子HbICE2及其编码基因与应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及橡胶树转录因子hbice2及其编码基因与应用。

背景技术：

ice(inducerofcbfexpression)是cbf诱导表达的转录激活因子。植物中ice的结构，除含典型bhlh结构域外，还存在s富集区、nls区和转膜区，且bhlh结构域均含有19个保守的kmdrasilgdai(d/e)ylkell氨基酸。其基因分别在西红柿、黄瓜、烟草、香蕉等不同植物中发现，可提高植物的抗寒性。研究表明，atice属于组成型表达基因，编码含bhlh的myc类(myc-liketranscriptionfactors)转录激活因子myc(myelocytomatosis)家族成员可以应答多种植物激素，在介导的植物环境胁迫反应中起着非常重要的转录调控作用。

橡胶树(heveabrasiliensismuell.arg.)原产南美洲亚马逊河流域，是典型的热带雨林树种。我国的植胶区位于热带北缘，属于非传统植胶区，经常性遭遇的寒流。因此，生产上需要高产又抗寒的新品种，但是高产耐寒品种极其匮乏。这是由于橡胶树常规育种周期长，杂交次代少，高产和耐寒性状难于聚合；橡胶树耐寒性选育种依赖大田及前哨苗圃鉴定，不仅鉴定周期长、效率低，而且耗费大量的人力、物力和土地资源。本项目采取正向遗传学研究策略，利用建立的橡胶树抗寒性室内鉴定实验系统和已知抗寒性强弱的橡胶树无性系为材料，从分子生物学和遗传转化层面，揭示了橡胶树低温胁迫抗性等的分子机制，鉴定了橡胶树ice2基因的功能，对于认识植物在非休眠条件下对低温胁迫的抗性机制以及通过转基因技术定向改良高产品种的低温胁迫抗性具有重要的理论意义和实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种橡胶树转录因子hbice2及其编码基因与应用。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树转录因子hbice2，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种橡胶树转录因子hbice2基因，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子hbice2基因。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pcambia1302载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pcambia1302载体质粒，seqidno:2所示核苷酸序列位于pcambia1302载体质粒的spei和bsteⅱ两限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树转录因子hbice2、或者本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子hbice2基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体在提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性中的应用。

其中，所述盐为氯化钠。

本发明的第五个方面是提供一种提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性的方法，其特征在于，将本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子hbice2基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体转染至植物。

本发明的第六个方面是一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示。

本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:7和seqidno:8所示。

本发明从分子生物学和遗传转化层面，揭示了橡胶树低温胁迫抗性的分子机制，鉴定了橡胶树hbice2基因的功能，基因表达分析显示hbice2基因响应低温胁迫上调表达，且在耐寒性强的橡胶树品种中表达量显著高于耐寒性弱的品种，通过转基因验证了hbice2能够增强转基因植株的耐寒性、耐旱性和耐盐性等，这对于认识植物在非休眠条件下对低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等的抗性机制以及通过转基因技术定向改良高产品种的低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等具有重要的理论意义和实际应用价值，该基因可作为重要的基因资源，在橡胶树和其他植物抗逆基因工程中得到应用。

附图说明

图1为hbice2基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

图2为hbice2基因的系统进化树分析。

图3为hbice2基因在低温条件下橡胶树耐寒品种和不耐寒品种的表达分析结果。

图4为过表达hbice2基因的拟南芥植株的耐寒性鉴定结果，图中，wt：对照，35::hbice2：转hbice2基因拟南芥。

图5为过表达hbice2基因的拟南芥植株的耐盐性鉴定结果，图中，wt：对照，35::hbice2：转hbice2基因拟南芥。

图6为过表达hbice2基因的拟南芥植株的耐旱性鉴定结果，图中，wt：对照，35::hbice2：转hbice2基因拟南芥。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、基因获得

利用rt-pcr技术从巴西橡胶树品种93-114的树皮中克隆获得转录因子hbice2基因，具体实施方案如下：

参照天根rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒的操作说明提取橡胶树树皮总rna。根据ferments公司试剂盒的操作步骤合成cdna第一链。依据本橡胶树基因组数据库，获得注释为ice的unigene，借助ncbi数据库搜索比对，初步鉴定为完整的基因序列。

以cdna第一链为模板，以hbice2-f(seqidno:3)：atgctatctggactaaatggca和hbice2-r(seqidno:4):ctatatcattccatggaagcctg为引物，通过pcr扩增反应获得转录因子hbice2基因的cdna序列，扩增体系：pyrobestdnapolymerase(5u·μl^-1)1μl，10×pyrobestbufferii5μl，dntpmixture(2.5mmol·l^-1)4μl，hbice2-f(10μmol·l^-1)1μl，hbice2-r(10μmol·l^-1)1μl，cdna模版1μl，灭菌水补足50μl。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃30s，60℃30s，72℃2min，共32个循环；72℃延伸10min。

0.2％的琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增产物，回收纯化目的条带，克隆到peasy-bluntsimplecloningvector载体上，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取阳性克隆送invitrogen公司进行测序。利用blast检索genbank数据库进行同源性分析，结果表明克隆了ice家族基因中的一个完整的阅读框(图1)。利用mega5.10软件进行多重比对分析并构建系统发育树。结果表明所克隆的ice基因属于ice家族，是该家族5个成员之一，于是命名该基因为hbice2(图2)。

二、基因表达模式分析

在长期的抗寒前哨苗圃和大田实践中，鉴定出耐寒品种橡胶树93-114、橡胶树gt1和橡胶树ina873，不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515。于是，以这六个品种为材料，低温(4℃)处理，分别在处理0h、4h、8h和24h采集样品，5株一个混合样，3个生物学重复。利用荧光定量技术，对橡胶树转录因子hbice2基因的表达模式进行分析。hbice2基因荧光定量引物序列如，hbice2-q-f(seqidno:5)：cgatcttccctttccaactacct和hbice2-q-r(seqidno:6)：caaaaatagcgtattccctgagc，内参基因actin7a(genebank登录号：hq260674)的引物序列如，actin7a-f:ggcactttggtactcaagtc和actin7a-r:gaagcatcccaatcactctc。使用biorad公司的cfx-384荧光定量pcr仪进行荧光定量pcr,反应程序：95℃预变性30s，94℃5s,60℃20s,72℃20s,进行45个循环，扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。分别检测hbice2在橡胶树耐寒品种和不耐寒品种中的表达情况。结果hbice2在橡胶树耐寒品种93-114、gt1和ina873中的本底表达显著高于不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515。在低温胁迫下，hbice2不论在耐寒品种还是不耐寒品种中都呈上调表达趋势，但是在耐寒品种93-114、gt1和ina873中的表达量显著高于不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515，特别在低温处理4h和8h时，差异极显著。这表明hbice2基因与橡胶树的低温胁迫抗性有关(图3)。

三、遗传转化

以已测序验证的质粒为模板，以hbice2-tr-f(seqidno:7)：gactagtatgctatctggactaaatgg(下划线为spei酶切位点)和hbice2-tr-r(seqidno:8)：gggtgaccctatatcattccatggaagc(下划线为bsteⅱ酶切位点)为引物，扩增hbice2基因的orf，扩增产物经双酶切后连接到经相同内切酶切后的表达载体pcambia1302中，通过测序鉴定目的基因的完整性和连接顺序的正确性，利用热激将带有hbice2基因orf的质粒转化到gv3101菌株。通过农杆菌介导法，侵染拟南芥的花序，将hbice2基因转化到将要形成的种子中进行过表达，然后对转基因阳性植株进行鉴定，对含有目的基因的t3代阳性植株进行筛选及耐寒性鉴定分析，以没有转基因的正常植株为对照(wt)，结果表明培养4周的转基hbice2的拟南芥株系在低温-5℃条件下处理15h，然后正常恢复培养2周，过表达hbice2的拟南芥株系的存活率高于60％，而对照wt的存活率仅为11％(图4)。这说明hbice2能够提高转基因植物株系抗低温胁迫的能力。可能对橡胶树的低温胁迫抗性有很大的调控作用。

以没有转基因的正常植株为对照(wt)，用300mm的氯化钠溶液给培养4周的转基hbice2的拟南芥株系和wt植株淋水，5天淋水一次，23℃条件下盐胁迫培养2周，结果显示对照wt植株的叶片失水干枯，部分植株已枯死，存活率为54％；但是转基hbice2的拟南芥株系没有出现枯死植株，并且已抽苔开花结果荚，存活率为100％(图5)。说明hbice2能够提高转基因植物株系抵抗高盐胁迫的能力。

以没有转基因的正常植株为对照(wt)，在正常条件下培养转基因hbice2的拟南芥植株4周，然后停止淋水，即干旱处理2周，结果显示wt植株的叶片失水而枯萎，转基因hbice2的植株的老叶已枯萎，嫩叶还正常生长，并且已抽苔开花结果荚。然后给干旱处理的wt和转基因hbice2的拟南芥植株淋水，正常培养8天，结果显示wt的存活率为63％，而转基因hbice2的拟南芥植株没有完全枯死的现象，并且都已开花结果，存活率为100％(图6)。由此可见hbice2能够提高转基因植物株系抵抗干旱胁迫的能力。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院橡胶研究所

<120>橡胶树转录因子hbice2及其编码基因与应用

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