一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用。

背景技术：

神经退行性疾病是一个主要的公共卫生问题，因为神经退行性疾病影响几乎所有年龄段。其中，肌萎缩性侧索硬化症(als)是一种影响上下运动神经元的进行性神经退行性疾病，其主要特征是运动神经元以及脊髓和延髓运动神经元的选择性和进行性退化，并且涉及一种或多种以下机制关联的脑功能障碍：氧化应激、炎症和细胞死亡。已有研究的交叉核对结果表明，全世界目前有超过223000人受到als的影响，并且由于人口加剧老龄化，这一数据到2040年将增加69％。als患者出现症状后，存活时间一般仅为3至5年。不到10％的als患者被定义为家族性als，90％以上为散发性als(sals)。根据现有数据库中描述的基因组信息，人类基因组中高达98％的基因由非编码序列组成，非编码rna(lnrnas)是指缺乏开放阅读框，不能为蛋白质编码的rna序列。其中，近40％的长非编码rna(lncrnas)在大脑中特异性表达。因此，lncrnas的表达差异在神经退行性疾病中起着关键作用。由于散发性患者als的临床诊断所需时间较其他神经退行性疾病患者更长，所以寻找散发性als的临床潜在生物标志物迫切而重要。另外，帕金森病(pd)是一种影响中枢神经系统的慢性神经退化疾病，主要影响运动神经系统，会导致躯体平衡和协调困难。帕金森病通常会随着时间的推移而缓慢出现，随着疾病的进展，患者的运动神经将会受到极大的影响。早期最明显的症状为颤抖、肢体僵硬、运动功能减退和步态异常。帕金森病带来的主要运动症状合称为帕金森综合征。帕金森病通常发生在60岁以上的老人，约有1％的老人罹患该病，在确诊后的预期余命约为7-15年。在帕金森病的临床试验中，衡量帕金森病的严重程度是通常诊断的依据，但由于缺乏疾病的敏感性和特异性而有严重阻碍，因此帕金森病的诊断也存在着如上述als诊断相同的问题。

目前已有研究提出了几种有关神经退行性疾病的临床或分子生物标志物。例如：在脑脊液和血液中测量脂质能量代谢相关脂蛋白、大脑组织中tau蛋白或者alpha-synuclein蛋白的累积程度，或炎症标志物il-6/il-8以及血液中的各类有关病理持续的标志物等。然而，上述标志物大多数都存在不能在疾病早期辅助诊断的问题，或者采样的手段相对复杂检测难度较大等问题。例如脑脊液中测量的脂质能量代谢相关脂蛋白，在血液中测量的数据由于年龄和性别的不同在各个研究中结果差异较大。因此需要提供一种用于散发性als和pd疾病早期临床诊断的有效生物标志物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用，以解决现有技术中存在的生物标志物无法对散发性als和pd疾病的早期临床诊断起到有效辅助诊断的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物，所述生物标志物为lncrnas，所述lncrnas转录本包括lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的一种或多种。

根据一种优选实施方式，所述lnc-cntn4-2:1的基因序列如seqidno.1所示；所述lnc-nr3c2-8:1的基因序列如seqidno.2所示；所述lnc-abca12-3:1的基因序列如seqidno.3所示；所述lnc-dyrk2-7:1的基因序列如seqidno.4所示；以及所述lnc-potem-4:7的基因序列如seqidno.5所示。

根据一种优选实施方式，所述lnc-cntn4-2:1和所述lnc-nr3c2-8:1在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期具有相同的差异性表达趋势。

根据一种优选实施方式，所述lnc-dyrk2-7:1、所述lnc-abca12-3:1和所述lnc-potem-4:7在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期具有不同的差异性表达趋势。

本发明还提供了前述的生物标志物在制备早期诊断散发性肌萎缩侧索硬化症和帕金森病的产品中的应用。

根据一种优选实施方式，所述产品包括试剂盒。

根据一种优选实施方式，所述试剂盒包括检测样本中lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的表达水平的试剂。

根据一种优选实施方式，所述试剂还包括特异性针对lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的探针和引物。

根据一种优选实施方式，所述引物包括针对lnc-cntn4-2:1且基因序列如seqidno.6和seqidno.7所示的引物对、针对lnc-dyrk2-7:1且基因序列如seqidno.8和seqidno.9所示的引物对、针对lnc-potem-4:7且基因序列如seqidno.10和seqidno.11所示的引物对、针对lnc-nr3c2-8:1且基因序列如seqidno.12和seqidno.13所示的引物对以及针对lnc-abca12-3:1且基因序列如seqidno.14和seqidno.15所示的引物对。

根据一种优选实施方式，还包括用于检测内参基因的引物和探针，其中内参基因选自gapdh，针对内参基因gapdh的引物包括基因序列如seqidno.16和seqidno.17所示的引物对。

基于上述技术方案，本发明的用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用至少具有如下技术效果：

本发明提供的用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物为lncrnas，该lncrna转录本包括lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的一种或多种。通过检测样本中lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的一种或多种的差异性表达水平，可以作为早期诊断患者是否具有较高患有散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病症的风险的有效方法。

另一方面，本发明提供的用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物中lnc-dyrk2-7:1、lnc-abca12-3:1和lnc-potem-4:7在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期具有不同的差异性表达趋势。因此，通过检测lnc-dyrk2-7:1、lnc-abca12-3:1或者lnc-potem-4:7的差异性表达水平，可以在检测疾病的同时区分诊断散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中微阵列microarray的筛选结果；

图2是本发明实施例中散发性als和帕金森患者外周血白血胞中验证的具有差异性表达的lncrnas。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明提供的一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物，该生物标志物为lncrnas，lncrnas转录本包括lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的一种或多种。通过检测上述生物标志物的一种或多种的差异性表达水平，可以作为早期诊断患者是否具有较高患有散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病症的风险的有效方法，本发明的生物标志物为早期诊断sals和pd的有效分子标志物，是早期诊断sals和pd的有效产品。

进一步优选的，所述的lnc-cntn4-2:1的基因序列如seqidno.1所示；所述的lnc-nr3c2-8:1的基因序列如seqidno.2所示；所述的lnc-abca12-3:1的基因序列如seqidno.3所示；所述的lnc-dyrk2-7:1的基因序列如seqidno.4所示；以及所述的lnc-potem-4:7的基因序列如seqidno.5所示。如下表1所示。

表1具有差异性表达的lncrnas的核苷酸序列

进一步优选的，所述的lnc-cntn4-2:1和所述的lnc-nr3c2-8:1在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期具有相同的差异性表达趋势。优选的，所述的lnc-cntn4-2:1和所述的lnc-nr3c2-8:1在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期均具有表达下调的趋势。其中，lnc-cntn4-2:1在pd中相对于sals有更明显的降低，lnc-nr3c2-8:1在pd中仍有降低的表达，但并不比在sals中更明显。

进一步优选的，所述的lnc-dyrk2-7:1、所述的lnc-abca12-3:1和所述的lnc-potem-4:7在散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病的疾病早期具有不同的差异性表达趋势。优选的，所述的lnc-dyrk2-7:1和lnc-abca12-3:1在散发性肌萎缩性侧索硬化症中表达降低，而在帕金森病中表达升高，与同一个转录本在pd中的检测结果相反。优选的，所述的lnc-potem-4:7在散发性肌萎缩性侧索硬化症中表达降低，而在帕金森病中无差异性表达。因此，通过检测lnc-dyrk2-7:1、lnc-abca12-3:1或lnc-potem-4:7的差异性表达能够在检测的同时区分诊断sals和pd。

本发明还提供了前述的生物标志物在制备早期诊断散发性肌萎缩侧索硬化症和帕金森病的产品中的应用。

进一步优选的，所述产品包括试剂盒。优选的，该试剂盒包括检测样本中lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的表达水平的试剂。

进一步优选的，所述试剂还包括特异性针对lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1以及lnc-potem-4:7的探针和引物。

进一步优选的，所述引物包括针对lnc-cntn4-2:1且基因序列如seqidno.6和seqidno.7所示的引物对、针对lnc-dyrk2-7:1且基因序列如seqidno.8和seqidno.9所示的引物对、针对lnc-potem-4:7且基因序列如seqidno.10和seqidno.11所示的引物对、针对lnc-nr3c2-8:1且基因序列如seqidno.12和seqidno.13所示的引物对以及针对lnc-abca12-3:1且基因序列如seqidno.14和seqidno.15所示的引物对。如下表2所示。

进一步优选的，还包括用于检测内参基因的引物和探针，其中内参基因选自gapdh，针对内参基因gapdh的引物包括基因序列如seqidno.16和seqidno.17所示的引物对。

表2荧光定量实时pcr所用引物序列

实施例

本实施例提供了本发明的lncrnas生物标志物的筛选过程，以寻找与神经退行性疾病相关的特异性在外周血白细胞中有差异性表达的lncrnas。

a)通过microarray芯片进行筛查。

利用含有92727个人类编码和非编码rnas探针的芯片，首先对5例sals患者和5例健康对照样本进行失调lncrnas的筛选。利用heatmapper软件，选取与健康对照组差异最大的前30个lncrna，并将其表达差异以热图的形式呈现，如图1所示。图1中示出了针对sals和健康对照进行微阵列筛选后具有表达差异的30个lncrnas的热图，样本的层次聚类使用了平均连锁聚类法和皮尔森距离测量进行分析。利用微阵列结果比较了几个不同的lncrna数据库，其中包括lncipedia、noncode和annolnc。然后，用id对这些数据库中的转录物进行对应的命名。如图1所示，与对照组相比，sals外周白细胞中共有16个lncrnas下调，其余14个lncrnas上调。

b)对上述微阵列筛选出的差异性表达的lncrnas进行验证。

申请人对上述具有差异性表达的lncrnas进行了反转录-荧光定量实时pcr(rt-qpcr)。首先排除了序列与mrna高度重叠的lncrnas，将其余序列与mrnas不重叠或部分重叠的13个lncrnas通过rt-qpcr进行验证。选取了54例sals患者、40例pd患者和39例健康对照者，在早上开始临床治疗前，通过静脉穿刺收集所有参与者的约5ml全血到含edta的管中。采血后2小时内，通过ficoll-paqueplus(gehealthcarelifesciences，编号17-1440-02)离心分离外周血白细胞。

然后进行rna提取和反转录及定量实验。采用powerup^tmsybr^tmgreenmastermix(refa25742，appliedbiosystemsbythermoscientific)对选定的lncrnas进行qpcr实验，共20μlpcr反应混合物，包括2μlcdna、10μlpowerup^tmsybr^tmgreenmastermix(refa25742，appliedbiosystemsbythermoscientific)、1μl正向引物、1μl反向引物和6μl无核酶水。pcr反应在quantstudio3(appliedbiosystemsbythermofisherscientific)中完成。反应在96孔光学板中50℃孵育2分钟，然后95℃孵育2分钟，接着95℃15秒、55℃15秒和72℃1分钟的40个循环。每个样品同时分析三份，并进行熔融曲线分析，以验证pcr循环结束时预期pcr产物的特异性生成。将lncrnas的表达变化与内参gapdh进行归一化，用2^-δδct法计算差值。以所有对照组δct的平均数据作为校准物(δδct＝0，2^-δδct＝1)。

验证结果发现有5条lncrnas转录本在疾病样本和健康对照组之间存在差异性表达，如图2所示。图2示出了通过实时pcr验证sals(n＝52)、pd(n＝40)和健康对照组(hc，n＝38)外周血白细胞中具有表达差异的lncrnas。其中，图2a为lnc-cntn4-2:1；图2b为lnc-nr3c2-8:1；图2c为lnc-abca12-3:1；图2d为lnc-dyrk2-7:1；图2e为lnc-potem-4:7。本数据使用四分位数范围法查找极值后，采用用two-tailedmann-whitneyutest检测患者和健康对照组之间平均数的p值进行统计学评价。极值在图中已剔除。

结果表明：lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1和lnc-potem-4:7的转录本在sals病例中均有下调结果，且在pd样本中，上述部分lncrnas的转录本具有相同的差异性表达趋势，其中，lnc-cntn4-2:1和lnc-nr3c2-8:1在sals和pd样本中皆呈下调趋势。lnc-cntn4-2:1在pd中相对于sals有更明显的降低，lnc-nr3c2-8:1在pd中仍有降低的表达，但并不比在sals中更明显。而且仅在sals中观察到lnc-dyrk2-7:1和lnc-abca12-3:1表达降低，与同一个转录本在pd中的检测结果相反。另外，lnc-potem-4:7在sals中表达降低，但在pd中无差异性表达。因此，外周血白细胞中的特定的lncrnas：lnc-cntn4-2:1、lnc-nr3c2-8:1、lnc-abca12-3:1、lnc-dyrk2-7:1和lnc-potem-4:7的差异性表达可以作为早期诊断sals和pd的有效分子标志物。并且lnc-dyrk2-7:1、lnc-abca12-3:1或lnc-potem-4:7的差异性表达可以在检测的同时区别诊断sals和pd。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>四川大学华西医院

<120>一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森氏病早期诊断的生物标志物及其应用

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