一种快速提取生物核酸的样品处理方法与流程

一种快速提取生物核酸的样品处理方法
【技术领域】
1.本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种生物核酸快速提取的样品处理方法、核酸提取方法及提取试剂盒。


背景技术：

2.随着基因组测序技术的发展，生物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的生物基因组dna是基因组测序技术得以应用的首要前提。随着生物学的发展，基因的转录产物rna的研究也越来越受到研究者们的青睐。
3.越来越多的dna、rna以及两者共提的提取方法被开发出来。具体来说，传统的生物基因组dna提取方法主要有ctab和sds法，常见的生物rna提取方法主要有trizol法、硫氰酸胍/酚法、sds/酚法、盐酸胍法等。
4.对于生物样品核酸提取的质和量不仅与提取配方有关还与生物样品的处理方式和/或处理方法有关。于是一些生物样品的处理方法不断的涌现出来，如：机械方法，包括高速组织捣碎机、玻璃匀浆器等；物理方法，包括反复冻融法、冷热变替法、超声波法、加压破碎法等；化学及生物学法，包括有机溶剂提取法，水溶液提取法和酶法等。
5.被实验室广泛应用的方式和方法中，主要有机械法、酶法和液氮研磨法。各种方法各有其优缺点。机械法的优点：效率高，有利于自动化；其缺点：成本高。酶法：液氮冷冻干燥研磨法，优点：研磨效果好，可以快速提取生物核酸，缺点：不利于自动化。传统的酶法，优点：有利于自动化，缺点：酶解速度慢。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供克服至少一种上述现有技术缺点的方法和常温快速核酸提取试剂盒。
7.如权利要求1所述，一种生物核酸快速提取样品的处理方法，其特征在于包括以下步骤：
8.a)处理生物样品，包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法、高速离心法和/或加入防止核酸降解的抑制剂等，以获得小体积的细胞和/或极细小生物组织聚集体；
9.b)加入小体积高浓度的蛋白酶，包含但不限于，蛋白酶k、溶菌酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等；
10.跟据权利要求1a)所述，其特征在于：对固态生物样品，加入和/或核酸降解抑制剂和/或再加入高浓度的酶，经过包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法等，获得极细小的生物样品组织；对于液体中含有细胞的生物样品，和/或加入防止核酸降解的抑制剂，离心去除上清，获得生物样品细胞。
11.为了区别传统的酶解法，本专利所提供的酶解方法特点在于体积小且酶的浓度比较高，所以称该方法为浓缩酶解法。
12.更具体来说，对于dna降解抑制剂包含但不限于，和/或一种或一种以上螯合剂化
合物，优先选自，包含但不限于：n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、乙二胺
‑
n，n
′‑
二琥珀酸(edds)、1，2
‑
双(邻氨基苯氧基)乙烷
‑
n，n，n
′
，n
′‑
四乙酸(bapta)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(ntmp)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(dtpmp)、1
‑
羟基亚乙基
‑
1，1
‑
二膦酸(hedp)等)，优选edta。
13.更具体来说，对于rna降解抑制剂包含但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的rnasea抑制剂为焦碳酸二乙酯(depc)水溶液。
14.优选实施方式中，高浓度酶与细胞和/或极细小的生物样品组织混匀后，总体积还是非常小的，这样就拉近酶与底物作用距离加快酶解反应，使细胞和/或极细小的生物样品组织被彻底酶解，让生物核酸暴露出来，与核酸提取液充分接触，不仅可以加快核酸提取过程而且还可以增加核酸提取量。
15.根据权利要求1b)所述，其特征在于：和/或加入高浓度蛋白酶，具体来说大于0.5mg/ml，优选在2mg/ml～50mg/ml，更有选在5mg/ml～30mg/ml；所用高浓度蛋白酶体积在1ul～100ul，优选在5ul～50ul，更优选在10ul～30ul；把酶和经过步骤a)处理后的生物样品混匀，放置一段时间，优选1分钟～10分钟。更优选1分钟～3分钟。
16.为了区别传统的酶解法，本专利所提供的酶解方法特点在于体积小且酶的浓度比较高，所以，把该方法定义为浓缩酶解法。
17.出于本发明的目的，术语“核酸”表示包含但不限于：天然，优选分离的、线性、支化或环状核酸如rna，具体是mrna、sirna、mirna、snrna、trna、hnrna、microrna或核酶，dna，质粒dna，线粒体dna等。
18.出于本发明的目的，术语“螯合剂”表示能够螯合金属离子的化合物，如edta等。
19.优选实施方式中，处理后的生物样品核酸提取方法包括以下步骤：
20.a)把酶解后的生物样品与裂解液混匀；
21.b)在含有核酸的裂解液和/或溶液和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到基于一种基质或一种以上基质混合物上，包含但不限于离心柱、磁球等；
22.c)任选地洗涤固定在基质上的核酸；
23.d)任选地洗脱结合在基质上的核酸。
24.在优选实施方式中，尤其是裂解液还可包含和/或临时加入酶，例如裂解酶、rnase a、dnase i，具体说，例如蛋白酶k，蛋白酶，消解酶，无色肽酶，溶细胞酶，溶葡萄球菌酶，溶菌酶和核酶等。
25.在裂解液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸固定到基质上。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
26.优选有用的是具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1～5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
27.除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是乙醇、丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体基团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如
正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
28.根据所述方法一优选的实施方式，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、n
‑
(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(tricine)、n，n
‑
双(2
‑
羟乙基)甘氨酸(bicine)、n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n
’‑
(2
‑
乙磺酸)(hepes)、哌嗪
‑
1，4
‑
双(2
‑
乙磺酸)(pipes)、n
‑
环己基
‑2‑
氨基乙磺酸(ches)、2
‑
(n
‑
吗啉代)乙磺酸(mes)、3
‑
(n
‑
吗啉代)丙磺酸(mops)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠、醋酸甲等
29.根据所述方法一尤其优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包含至少一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)和/或n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n
’‑
(2
‑
乙磺酸)(hepes)和/或醋酸钠和/或磷酸盐缓冲剂。根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解和/或结合组合物至少包含一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)和/或醋酸钠。
30.生物样品可以在室温，例如在15℃～25℃之间裂解，或者在升高温度，例如在30℃至95℃之间进行裂解。
31.在优选实施方式中，裂解液或裂解液混合物还可包含酶，例如蛋白酶k、蛋白酶、溶菌酶、葡萄球菌等，以及根据应用，核酸酶，例如dna酶和/或rna酶。
32.在盐溶液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸固定到离心柱。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
33.优选有用的是具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1～5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
34.根据一优选的实施方式，以结合组合物的总体积计，结合组合物包含体积含量在10％～200％范围内，优选在40％～120％之间，更优选在50％～80％之间。
35.除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是乙醇，丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体基团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
36.根据本发明一优选的实施方式，使样品与基于一种或一种以上二氧化硅化合物，如生物样品核酸与二氧化硅、硅酸盐、玻璃和/或硅胶的基质接触，并孵育足以实现结合的时间，从而分离核酸。基质可以使现有技术已知的常规设计，例如颗粒形式，膜形式或滤器形式等。为便于去除，优选具有磁性的颗粒。从10秒～30分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，一尤其优选的实施方式，从1分钟～10分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，又一更优选实施方式，具体约为5分钟的孵育时间是有益的。
37.优选具有胶状二氧化硅涂层的磁性颗粒来分离核酸。优选采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒径在1um～40um范围内，优选在5um～20um之间，尤其优选在6um～10um之间，优选粒度分布窄的磁性颗粒来分离核酸。更优选地，采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒度在6um～10um之间，优选粒度分布窄的磁性颗粒来分离核酸。
38.在又一优选的实施方式中，磁性或有磁力吸引的颗粒是具有基于氧化铁的磁性的
颗粒，优选选自磁铁矿(fe3o4)，磁赤铁矿(γ
‑
fe2
‑
o3)和/或铁氧体。
39.能够以有益方式使用的磁性二氧化硅颗粒可参见例如国际申请wo 01/71732，其内容被纳入本文作为参考。
40.在优选实施方式中，可使用具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种基质或多种二氧化硅化合物基质的混合物。
41.在4℃～95℃之间的温度下，进行核酸与基质的结合，优选在20℃～70℃，尤其优选在45℃～70℃，最佳优选在50℃～65℃。结合也可以在室温进行，例如在15℃～25℃之间。
42.孵育后，从裂解和/或结合组合物中去除结合到基于一种基质或一种以上二氧化硅化合物基质混合物上的核酸。当使用磁性二氧化硅颗粒时，这可以在磁场的帮助下实现。例如，通过施加磁场将磁性颗粒拖拽至在其中进行孵育的容器的壁上，用吸管尖端或移液枪把液体移除；或者将磁性颗粒固定到塑料涂层保护的磁棒上，可以取出磁棒，把废液去除。
43.优选地，固定到基质上的核酸可以在去除之前进行洗涤。优选涉及所述颗粒的重悬，例如通过震摇或应用磁场。优选去除污染的洗涤溶液。
44.使用的洗涤试剂可以是常规洗涤缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤试剂，例如10mm三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的溶液和/或edta和/或0.05m～0.2m柠檬酸钠溶液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4m～6m盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
45.而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1～5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50％～100％乙醇的水溶液。
46.优选将固定到基质的核酸洗涤几次，例如1～4次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后，用含70％～100％乙醇的水溶液再次洗涤核酸。
47.更具体说，利用磁性颗粒，由于颗粒的磁性聚集而便于进行分离和/或洗涤步骤。
48.最后的洗涤步骤或水洗涤之后，可干燥优选的磁性颗粒，例如真空干燥或者通过蒸发液体或者让液体蒸发。
49.根据所述方法的步骤d)，可从基质上去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱。
50.也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于pcr或其他扩增方法，dna检测方法或dna鉴定方法。
51.结合的核酸可借助低盐含量的洗脱试剂把核酸从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1m的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的洗脱试剂和/或0.01％～0.02％depc水溶液等。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(edta)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
52.具体说，使用裂解和/或结合组合物产生了从生物样品分离核酸，具体是分离生物核酸的尤其有益的方法。
53.即使在储存之后，裂解和/或结合试剂的优点尤其在于可获得优良产品。
54.本发明还涉及从含核酸的生物样品分离和/或纯化核酸的试剂盒，该试剂盒包含本发明的裂解、结合和/或洗涤试剂。
55.在优选实施方式中，该试剂盒还包含基于一种或一种以上二氧化硅化合物的基质。具体是具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或一种以上的二氧化硅化合物的基质。优选包含在所述试剂盒中的磁性二氧化硅颗粒的例子参见国际申请wo 01/71732，其全部内容被纳入本文作为参考。
56.在又一优选的实施方式中，试剂盒可包含除磁性二氧化硅颗粒之外的硅烷化载体材料，优选具有二氧化硅膜的离心柱。
57.使用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mm三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的溶液和/或edta和/或0.05m～0.2m柠檬酸钠溶液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4m～6m盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
58.而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1～5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50％～100％乙醇的水溶液。
59.优选将固定到基质的核酸洗涤几次，例如2～3次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70％～100％乙醇的水溶液再次洗涤核酸。
60.根据所述实施方式，可从基质去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱核酸。也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于pcr或其他扩增方法，dna检测方法或dna鉴定方法等。
61.结合的核酸可借助低盐含量的洗脱试剂把核酸从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1m的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的洗脱试剂和/或0.01％～0.02％depc水溶液。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(edta)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
62.根据优选的实施方式，洗脱试剂洗脱次数在一次或一次以上，一优选洗脱次数在1～3次，更优选的洗脱次数为1次。
63.所述记载前述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的载体，典型地为纸质说明书，也可以是记载所述方法的电子版说明书的任意载体(包括但不限于可移动磁盘、光盘、电子墨水屏幕、网络资源及其地址等)，只要能通过读取该载体而获知该方法，则均在本概念范围内。
64.本发明在另一方面提供一种计算机可读载体，其记载包含用于实施前述裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的计算机程序。所述计算机作广义理解，包括但不限于单片机、plc、单板机、工控机、pc机等形式。所述计算机可读载体包括但不限于flash、eeprom、磁盘(软盘或硬盘)、光盘等任何形式。所述计算机程序可以是任意语言编写的，例如汇编、java、vb、vc、c++、python，只要能够控制相关系统实施所述方法即可。
65.本发明提出的一种快速提取生物核酸样品处理方法至少能产生如下有益效果：
66.1.操作简单，省时，生物核酸提取大约在15分钟左右；
67.2.增加生物样品核酸提取量，由于高浓度酶，让生物样品被酶解的更彻底；
68.3.生物样品处理和核酸提取都在室温下完成，当然也可以高温孵育完成。
【附图说明】
69.图1唾液细胞酶解前后对比图；
70.图2是分别用本发明酶解法和液氮冷冻干燥法处理唾液细胞，提取dna结果对比凝胶电泳图；
71.图3是分别用本发明酶解法和液氮冷冻干燥法处理口腔细胞，提取dna结果对比凝胶电泳图；
【具体实施方式】
72.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述仅用于帮助理解本发明。
73.实施例1——2种不同处理方法提取唾液细胞dna
74.如前所述，取800ul新鲜唾液并加入36ul 0.5m ph 8.0 edta，混匀，平分两份，12000rpm，离心1分钟，去除上清。第一份用液氮冷冻干燥研磨法处理唾液细胞；第二份加入10ul 20mg/ml蛋白酶k，混匀，室温放置2分钟进行酶解(见图1)，然后分别转入300ul第一裂解液(临时加入5ul 10mg/ml rnase a，绿色快速唾液dna提取试剂盒)，摇匀，再加入45ul第二裂解液(绿色快速唾液dna提取试剂盒)，摇匀，放置2分钟，12000rpm，离心1分钟，取上清放入新的ep管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用60ul洗脱液将dna从离心柱上洗脱。整个dna提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
75.将结果在biaosharp上测定(表1)，并通过凝胶电泳检测(图2)，可见，本发明提供浓缩酶解法能让细胞酶解更彻底而且比液氮冷冻干燥法提取唾液细胞dna的量更多。
76.表1：2种不同处理方法提取唾液细胞dna质量
77.处理方法酶解法研磨法dna浓度82.38ng/ul56.27ng/ula260/a2801.8291.836
78.实施例2——2种不同处理方法提取口腔细胞dna
79.如前所述，分别用口腔拭子棒取口腔细胞，放入1ml保护液(10mm tris
‑
hcl、20mm edta)，激烈震动，把2管口腔细胞混合，均分，12000rpm，离心1分钟，去除上清。第一份用液氮冷冻干燥研磨法处理口腔细胞；第二份加入10ul 20mg/ml蛋白酶k，混匀，室温放置2分钟进行酶解。然后，分别转入300ul第一裂解液(临时加入5ul 10mg/ml rnase a，绿色快速口腔拭子dna提取试剂盒)，摇匀，再加入80ul第二裂解液(绿色快速口腔拭子dna提取试剂盒)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的ep管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用60ul洗脱液将dna从离心柱上洗脱。整个dna提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
80.将结果在biaosharp上测定(表2)，并通过凝胶电泳检测(图3)，本发明提供的浓缩酶解法比液氮冷冻干燥法提取口腔细胞dna的量多。
81.表2：2种不同处理方法提取口腔细胞dna质量
82.处理方法酶解法研磨法dna浓度95.68ng/ul62.31ng/ula260/a2801.8351.827
83.由结果可见，本发明提出的浓缩酶解法，能够让生物样品酶解更彻底，在生物组织酶解方面具有较好的普适性。更为突出的是，操作都是在室温进行的，而且操作时间非常短，为缩短整体实验时间、提高实验效率提供了更多可能性。
84.本发明所用试剂的来源：
[0085][0086][0087]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和结构的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、组合、替换和变型，本发明的保护由所附权利要求及其等同范围限定。