吡咯伯克霍尔德氏菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物制剂领域，特别是涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌株及其在新垦造耕地中的应用。


背景技术：

2.为缓解耕地资源不断减少问题，我国多地利用新垦造耕地填补占用耕地面积以确保当地农耕面积总量的相对稳定性。然而新垦造耕地不同于可耕地，通过是未成熟的土壤，其砾石含量高、酸性强、营养匮乏，不适合植物生长。
3.目前，在土壤中施入植物促生根围细菌(pgpr)的微生物肥料被认为是替代化学肥料的生态友好方式，这也是可持续农业生产中降低生产成本的有效方法。目前，pgpr对植物生长影响机制的研究主要包括一些重要的细菌特性，如生物固氮、溶磷、铁载体和植物激素的产生等，已报道的植物促生真菌(pgpf)主要有曲霉菌、青霉菌以及木霉菌等，但多数菌株的功能单一或较少，只能改善土壤的少数问题，而对于未成熟土壤条件，需多方面改善土壤营养组分，才能更好地促进植物的生长。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决现有技术问题，提供了一种具有溶磷、固氮、产铁载体和3
‑
吲哚乙酸(iaa)的吡咯伯克霍尔德菌株，应用于新垦造的土壤中，能够有效促进植物的生长。
5.本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌株，分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(burkholderia pyrrocinia)zj9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2021968，保藏日期为2021年8月6日，保藏地址为中国武汉。
6.所述吡咯伯克霍尔德氏菌zj9为促生土壤细菌的一种，能够使土壤中难溶解的磷酸盐降解为植物了吸收的有效磷，可通过固氮功能为植物生长提供氮素，可利用细胞膜上的各种铁载体蛋白提高植物对铁素营养的吸收运输，从而缓解植物由于磷、氮、铁缺乏导致的生长受抑制状况；此外，该菌株还可以产生植物生长素iaa，促进植物抽枝或芽、苗顶部芽端的形成等。
7.本发明还提供了包含所述吡咯伯克霍尔德氏菌株的微生物菌剂。
8.可选的，所述微生物菌剂为吡咯伯克霍尔德氏菌zj9的菌悬液。
9.本发明还提供了所述吡咯伯克霍尔德氏菌株在促进植物生长中的应用。
10.可选的，在植物生长期间，对所述植物灌根吡咯伯克霍尔德氏菌zj9的菌悬液。
11.植物生长主要涉及根、茎、叶等，可用根长、根数、株高、地下干重或鲜重、地上干重或鲜重等指标来衡量。
12.可选的，所述植物种植于新垦造耕地土壤中。
13.可选的，所述植物为茄子。
14.可选的，所述菌悬液的浓度为108～109cfu/ml。
15.可选的，灌根时间为植物生长到3～4片叶阶段。
16.可选的，每株植物灌根10～12ml的菌悬液。
17.本发明筛选获得一株兼具高效溶磷、固氮、产铁载体和3
‑
吲哚乙酸的吡咯伯克霍尔德氏菌株，此菌株制备的微生物菌剂能够有效改善新垦造耕地土壤中微生物种群结构以及营养成分，促进植物的生长。
附图说明
18.图1为菌株zj9在na培养基上的菌落形态；
19.图2为基于atpd、gltb、gyrb、reca、lepa、phac和trpb基因构建的包含45个伯克霍尔德氏菌属种分类单元的最大似然(ml)树；以burkholderia kururiensis lmg 19447t为树外群.本研究分离菌株的分类单元用粗体显示；
20.图3为5个细菌菌株在ph 5.0或7.0的nbrip培养基上培养3天后的溶磷效果，a.ph 5.0，b.ph 7.0，1.zj3
‑
12，2.zj5，3.zj9，4.zj62，5.zj174；
21.图4为5个细菌菌株在ph 5.0或7.0的nbrip培养基上培养3天后的溶磷指数(psi)％柱状图，其中柱形图显示3次重复的平均值，不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著；
22.图5为5个细菌菌株在cas培养基上的产铁载体能力测定，a.ph 5.0；b.ph 7.0；1.zj3
‑
12，2.zj5，3.zj9，4.zj62，5.zj174；
23.图6为5个细菌菌株在nfb培养基上的固氮能力测定，a.ph 5.0，b.ph 7.0，1.zj3
‑
12，2.zj5，3.zj9，4.zj62，5.zj174；其中左侧为对照，右侧为处理组；
24.图7为不同ph培养基对5个菌株产iaa能力的影响图，a.ph 5.0，b.ph 7.0，1.对照，2.含0.1％色氨酸；
25.图8为5个菌株在ph 5.0或7.0培养基中产iaa的浓度柱状图；
26.图9为5个细菌菌株灌根30天对新垦造耕地上茄子生长的影响图.a.用吡咯伯克霍尔德氏菌(burkholderia pyrrocinia)zj174灌根，b.用分散泛菌(pantoea dispersa)zj62灌根，c.用吡咯伯克霍尔德氏菌(burkholderia pyrrocinia)zj9灌根；d.用菠萝泛菌(pantoea ananatis)zj3
‑
12灌根，e.用阿伯氏伯克霍尔德氏菌(burkholderia arboris)zj5灌根，f.对照。
具体实施方式
27.下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。
28.实施例1菌株的分离、纯化、筛选和鉴定
29.1.菌株的分离和纯化
30.以5点采样法采集浙江省杭州市临安於潜新垦造耕地土壤，封装于干净封口袋中带回实验室。以土壤稀释法分离土壤微生物菌株，即称取2g土样于18ml双蒸水(ddh2o)中，在180rpm摇床上震荡30min，制成10
‑1土壤稀释液；取1ml该稀释液至含有9ml ddh2o的离心管中，制成10
‑2土壤稀释液；以此类推，获得10
‑3、10
‑4土壤稀释液。分别取100μl 10
‑3和10
‑4土壤稀释液，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基(na：1％胰蛋白胨、0.1％酵母抽提物、1％蔗糖、0.3％蛋白胨、1.5％琼脂)平板上，并置于30℃培养箱中培养2～3天，挑选生长速度快(菌落
大)、菌落形态各异(比如，颜色、透明度、质地等形态)的细菌于新的na平板上纯化，纯化2～3次，得到988个分离系。
31.2.筛选
32.溶磷：分别用无菌枪头将988个分离菌株转接于含有5ml nb(不加琼脂的na)培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养18h(调整od
600
至0.8)，后用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述菌液后转接于nbrip培养基(葡萄糖10g、氯化镁5g、氯化钾0.2g、七水硫酸镁0.25g、硫酸铵0.1g、磷酸钙5g、琼脂15g、双蒸水1000ml,ph 5.0或7.0)平板上，在30℃培养3d，观察溶磷情况。
33.产铁载体：分别用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述已调整od
600
至0.8的菌悬液转接于cas培养基平板上于30℃培养3天，观察培养基颜色变化，若由紫色转变为黄色，则表明该培养基上的分离系具有产铁载体能力。
34.其中，cas培养基的组分及其制备方法如下：
35.溶液a：cas 0.0605g、双蒸水50ml、1mm六水氯化铁(含10mm hcl)10ml；溶液b:hdtma 0.0729g、双蒸水40ml；
36.溶液b:hdtma 0.0729g、双蒸水40ml；
37.溶液c:双蒸水750ml、10x mm9(磷酸二氢钾0.3g、氯化钠05g、氯化铵1.0g、氢氧化钠6.0g、30.24pipes、双蒸水1000ml，菌后再加入10％酪蛋白氨基酸30ml、葡萄糖2g、1m氯化镁1ml、100mm氯化钙1ml)100ml、琼脂15g、pipes 30.24g，ph 5.0或7.0。
38.溶液a和b混匀灭菌，溶液c灭菌后冷却到50℃左右时加入上述已灭菌的a+b溶液、10％酪蛋白氨基酸30ml、葡萄糖2g、1m氯化镁1ml、100mm氯化钙1ml。
39.固氮：分别将上述已调整od
600
至0.8的菌悬液3000g离心5min，弃上清，再用等量ddh2o重悬。分别取10μl重悬菌液至装有5ml nfb(磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.1g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.02g、氯化铁0.01g,二水锰酸钠0.002g、苹果酸钠5.0g、含0.5％无水乙醇的溴百里酚蓝5ml，双蒸水1000ml，ph 5.0或7.0，在30℃180rpm摇床上培养2天。培养基颜色变化则代表菌株有固氮能力。
40.产iaa：分别取10μl上述重悬菌液至装有10ml nb培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养2天，利用分光光度计检测是否产生iaa。
41.通过上述四个实验得到5株兼具溶磷、固氮、产铁载体和iaa的分离菌株，并进行编号，分别为zj3
‑
12、zj5、zj9、zj62、zj174。
42.3.菌株zj9的鉴定
43.3.1形态特征
44.将分离得到的菌株zj9接种于na培养基上，30℃培养2天，可获得表面光泽、边缘整齐的淡黄色圆形菌落，参见图1。
45.3.2系统发育分析
46.提取吡咯伯克霍尔德氏菌zj9的基因组dna，分别以引物对atpd
‑
f(5
′‑
gat cgt aca gtg cat cgg
‑3′
)(seq id no：1)和atpd
‑
r(5
′‑
atc gtg ccg acc atg tag
‑3′
)(seq id no：2)、gltb
‑
f(5
′‑
cgc tcg aag atc aag cag
‑3′
)(seq id no：3)和gltb
‑
r(5
′‑
ggg aac acc ttc acg aac
‑3′
)(seq id no：4)、gyrb
‑
f(5
′‑
cga caa ctc gat cga cga
‑3′
)(seq id no：5)和gyrb
‑
r(5
′‑
gac agc agc ttg tcg tag
‑3′
)(seq id no：6)、reca
‑
f(5
′‑
gat agc aag aag ggc tcc
‑3′
)(seq id no：7)和reca
‑
r(5
′‑
ctc ttc ttc gtc cat cgc ctc
‑3′
)(seq id no：8)、lepa
‑
f(5
′‑
cga cgg caa ggt cta caa
‑3′
)(seq id no：9)和lepa
‑
r(5
′‑
agc atg tcg acc ttc acg
‑3′
)(seq id no：10)、phac
‑
f(5
′‑
ctc agc gaa ttg cgt acg
‑3′
)(seq id no：11)和phac
‑
r(5
′‑
ccg ttc agc gag aag tcg
‑3′
)(seq id no：12)、trpb
‑
f(5
′‑
gat cta cct gaa gcg cga
‑3′
)(seq id no：13)和trpb
‑
r(5
′‑
gtg tgc atg tcc ttg tcg
‑3′
)(seq id no：14)扩增atpd、gltb、gyrb、reca、lepa、phac、trpb基因。其中，pcr扩增体系(50μl)为：32.5μl ddh2o、5μl 10x pcr buffer、4μl 2.5mm dntp、2μl 10μm各引物、4μl dna、0.5μl 5u/μl taq dna聚合酶(takara bio inc.,japan)。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min。pcr扩增所得片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。所得片段序列如下：
47.atpd区序列：
48.tgatcgcgcgaagcatgccgaagatctacgacgcgctcattctcgatggctcggaactgacgctcgaagtccagcagcagctgggcgacggcgtggtccgtaccatttgtctgggtgcatccgacggcctgcgccgcggcctgaccgtgaagaacacgagcaagccgatttcggttccggtcggcaagccgaccctcggtcgtatcatggacgtgctcggccgtccgatcgacgaagccggcccgatcgaaagcgaaacgacgcgttcgatccaccagaaggctccggcgttcgacgaactgtcgccgtcgaccgaactgctcgaaacgggtatcaaggtcatcgacctgatctgcccgttcgcgaagggcggcaaggttggcctgttcggcggtgccggcgtgggcaagaccgtcaacatgatggagctcatcaacaacatcgcgaaggaacacggcggttactccgtgttcgcgggcgtgggcgagcgtacccgtgaagggaacgacttctaccacgaaatgaaggactcgaacgttctcgacaaggtcgcgctggtgtacggccagatgaacgagccgccgggcaaccgtctgcgcgtcgcgctgaccggcctgacgatggccgagcacttccgtgacgaaggcctcgacgtgctgttcttcgtcgacaacatctaccgtttcacgctggccggtaccgaagtatcggcactgctcggccgtatgccgtcggcagtgggctatcagccgacgctggctgaagaaatgggcaagctgcaagagcgcatcacgtcgaccaagaagggctcgattacgtcggtccaggccgtgtacgtccctgcggacgacttgaccgacccgtcgccggctacgaccttcggccacctggacgcaaccgtcgttctgtcgcgtgacatcgcttcgctgggtatctacccggcggtcgacccgctcgactcgacgtcgcgccagatcgacccraacgtgatcggtgaagagcactactcgatcacccgtcgcgttcagcagacgctgcagcgctacaaggaactgcgagacatcatcgcgattctgggcatggacgaactgtcgccggaagacaagctgtcggtcgcacgtgcacgtaagatccagcgtttcctgtcgcagccgttccacgttgctgaagtgttcacgggctcgccgggcaagtacgtgccgctgaaggaaacgatccgcggcttcaagatgatcgtcgacggcgagtcgaca(seq id no：15)
49.gltb区序列：
50.ctcggcgtcccgccgagtacctggcgtcggccgaccagatccagatcaagatggcgcagggcgcgaagccgggcgaaggcggccaactgccgggccacaaggtgtccgaatacatcggcaagctgcgttactcggtgccgggcgtcggcctgatttcgccgccgccgcaccacgacatctactcgatcgaggatctggcgcagctgatccacgacctgaagaacgtgaacccgagcgcgagcatctcggtgaagctggtgtcggaagtgggtgtcggcacggtcgcggccggtgtcgcgaaggcgaaggccgatcacgtggtgatcgccggccatgacggcggcacgggcgcgtcgccgctgtcgtcggtcaagcatgccggcacgccgtgggaactgggtctcgccgaaacgcagcagacgctggtgctgaaccgcctgcgcggccggatccgcgtgcaggccgacggccagatgaagacgggccgcgacgtcgtgatcggcgcgctgctcggcgcggacgaattcggcttcgcgacggcgccgctcgtcgtcgagggctgcatcatgatgcgcaagtgccacctgaacacgtgcccggtcggcgtcgcgacgcaggatccggtgctgcgggcgaagttcaaggggcagcccgagcacgtcgtcaactacttctt
cttcgtcgccgaggaagtgcgcgagatcatggcgcagctcggcatcgcgaagttcgacgacctgatcggccgcgccgacctgctcgatacgcgcaagggcatcgagcactggaaggcgaagggcctcgacttctcgcgcgtgttctaccagccggaagaatgcgaagacgtcgcaccgcgccacgtcgacgtgcaggatcacggcctcgagcgcgcgctcgaccacgtgctgatcgagaaggcgaaggccgcgatcgagaacggcgagcatgtgtcgttcatccagccggtgcgcaacgtgaaccgtacggtcggcgcgatgctgtcgggcgtgatcgcgaagaagcacggccatgacggcctcgccgacgacgcggtgcacatccagctgaagggcacggcgggccagagcttcggcgcgttcctcgcgaagggcgtgacgctcgacctcgtcggcgacggcaacgactacgtcggcaagggcctgtcgggcggccggatcatcatccgcccgaccaacgacttccgcggcaagtccgaggaaaacatcatctgcggcaacacggtgatgtacggcgcgatcgaaggcgaagcgttcttccgcggcgtggcgggcgagcgcttctgcgtgcgcaactcgggcgcgacggcggtcgtcgagggcacgggtgaccacggttgcgaatacatgacgggcggtacggtcgtcgtgctcggcgagacggggcgcaacttcgcggccggcatgtcgggcggcctcgcgtacatctacgatccggaaggcacgttcgcggcgaagtgcaacaagtcgatggtcgcgctcgagccggtgctgcagcaggccgagcaggagcgcacggtcgaccgcgcgctctggcatgcgggcacgacggacgaagcgctgctcaaggggctcgtcgagcgtcatttccagttcacgggttcgccgcgcgcgaagtcgctgct(seq id no：16)
51.gyrb区序列：
52.catacgactcacgtgacgattcacgccgacaactcgatttccgtgaccgacaacggccgcgggatcccgaccgacgtgaagatgaacgacaagcacgagccgaagcgcagcgcggcggaaatcgtgatgaccgagctgcacgccggcggcaagttcgaccagaacagctacaaggtgtccggtggcctgcacggcgtgggcgtgtcgtgcgtgaacgcgctgtcgagctggctgcgcctcaccgtgcgccgcgacggcaagaagcggttcatggagttccaccgcggcgtcgcgcaggatcgcgtgctcgaggtggtggacggcgtggaagtgtcgccgatgctcgtgaccggcgacaccgagaaccgcggcaccgaagtgcacttcatggccgatccgacgattttcggcacggtcgagtatcactacgacatcctcgcgaagcggatgcgtgaactctcgttcctgaacaacggcgtgcggattcgtctcacggacctgcgctcgggcaaggaagacgatttcgcgttcgccggcggtgtgaagggcttcgtcgagtacatcaacaagacgaagaccaacctgcacccgacggtgttcttcgccaacggcgagaaggacggcgtgggcgtcgaagtcgcgatgcagtggaacgacagctacaacgaaaacgtgctgtgcttcacgaacaacattccgcagcgcgacggcggcacgcacctgaccggcctgcgggccgcgatgacgcgcgtcatcaacaagtacatcaccgacaacgaaatcgcgaagaaggcgaaggtcgagacgaccggcgacgacatgcgcgaagggctgtcgtgcgtgctgtccgtgaaggtgccggagccgaagttcagctcgcagacgaaggacaagctggtttcgtccgaggttcgtgcgccggttgaagaggttgtggcgaaggcgctggaagagttcctgctggaaacgccgatcgacgcgaagatcatctgcgggaagatcgtcgaggccgcgcgtgctcgcgatgctgcgcgcaaggcgcgcgagatgacgcgccgcaagggcgtgctcgacggcgtcggcctgccggggaagctcgcggactgccaggagaaagacccggcgaartgcgaaatctacatcgtcgagggcgactcggcaggtgggtcggcgaagcaagggcgtgatcgcaagttccaggcaatcctgccgctgcgc(seq id no：17)
53.reca区序列：
54.gaccgccgagaagagcaaggcgctggcggccgcactcgcgcagatcgagaagcagttcggcaaagggtcgatcatgcggatgggcgacggcgaggcggccgagaatatccaggtcgtctccacgggctcgctgggtcttgatatcgcactgggcgtcggcggcttgccgcgcggccgggtggtcgagatctacggtccggaatcgtcgggtaaaaccacgctcacgctgcaggtcatcgccgaactgcagaagctgggcggcaccgcagcgttcatcgacgccgagcacgcgctcgacgttcaatatgcagcgaagctcggcgtgaacgtgccggagctgctgatctcgcagccggacaccggcgagcaggcgctcgaaatcaccgacgcgctggtgcgctcgggctcgatcgacatgatcgtcatcgactcggtcgcggcgctcgtgccgaaggccgaaatcgaaggcgagatgggcgattcgctgccgggtctgcaggcccgcctgatgtcgcaggcgctgc
gcaagctgacgggcacgatcaagcgcacgaactgcctcgtgatcttcatcaaccagatccggatgaagatcggcgtgatgttcggcaacccggaaaccacgacgggcggcaacgcgctgaagttctattcgtcggtgcgtctcgacatccgccggatcggctcgatcaagaagaacgacgaggtgatcggcaacgaaactcgcgtgaaggtcgtcaagaacaaggtgtcgccgccgttccgcgaagcgatcttcgacatcctgtatggcgaaggcatttcgcgccagggcgagatcatcgatctcggcgtgcaggcgaagatcgtcgacaaggcgggcgcctggtacagctacaacggcgagaagatcggccagggcaaggacaacgcgcgtgagttcctgcgcgagaatccggaaatcgcgcgcgagatcgagaaccgcatccgcgaatcgctcggcgtcgtcagcatgcccgatggcgtgagccacga(seq id no：18)
55.lepa区序列：
56.acgtcgacttctcgtacgaggtcagccgttcgctgtccgcgtgcgaaggcgcgctgctggtcgtcgatgccagccagggcgtcgaggcgcagacggtcgcgaactgctacacggcgatcgagctcggcgtcgaggtcgtgcccgtgctgaacaagatcgacctgccggccgcgaaccccgagaacgcgatcgaggagatcgaggacgtgatcggcatcgacgcgaccgacgcgacgcgctgcagcgcgaagacggggctcggcgtcgaagacgtgctcgagtcgctgatcgcgaaggtgccgccgccgaagggcgatccggctgcgccgctgcaggcgctgatcatcgattcgtggttcgacaactacgtcggcgtcgtgatgctcgtgcgtatcgtcaacggcacgctgcgtccgaaggacaagatcaagatgatagcgaccggcgcgcagtatccggtcgagcacgtcggcgtgttcacgccgaagtcgcgcaatctcgactcgctgtcggccgggcaggtgggcttcatcatcgccggcatcaaggaactgacggccgcgaaggtcggcgacaccgtcacgcacgcgaccaaggccgcggccgaaccgctgccgggcttcaaggaagtgaagccgcaggtgttcgcgggcctgtatccggtcgaggcgaaccagtacgacgcgctgcgcgagtcgctcgagaagctgaagctgaacgacgcgtcgctgcagtacgagccggaagtgtcgcaggcactcggcttcggtttccgctgcggcttcctcgggctgctgcacatggaaatcgtgcaggagcggctcgagcgcgagttcgacatggacctcatcacgaccgcgccgacggtcgtctacgaggtcgtgcagagcgacggcacgacgatcatggtcgagaacccggcgaagatgccggaaccgggccgcatcggcgaggtccgcgagccgatcgtcaccgtgaacctgtatatgccgcaggactacgtcggctcggtgatcacgctgtgcgagcagaagcgcggctcgcagatcaacatgcagtatcacggccgccaggtgcagctcacgtacgagatcccgatggccgagatcgtgctcgacttcttcgatcgcctgaagtcggtgtcgcgcggctatgcgtcgatggactacgagttcaag(seq id no：19)
57.phac区序列：
58.aaagggaaaaattcgtacgtaacgggcgggatgggcggcatcggcaccagcatctgccagcgtctgtcgaaagacggcttcaaggtcgtcgcgggttgcggcccgaactcgccgcgccgcgtgaaatggctcgaggaccagaaggcgctcgggtacgatttcatcgcgtcggaaggcaacgtcggcgactgggactcgaccaaggaagcattcgacaaggtcaaggccgaagtcggcgagatcgacgtgctggtcaacaacgcgggcatcacgcgcgacgtcgtgttccgcaagatgacgcatgaagactggacggccgtgatcgacaccaacctgacgagcctgttcaacgtgacgaagcaggtgatcgacggaatggtcgagcgcggctggggccgcatcatcaacatttcgtcggtgaacggccagaaagggcaattcggccagaccaactactcgaccgcgaaggccggcatccacggcttcacgatgtcgctcgcacaggaggtcgcgacgaagggcgtgacggtcaacaccgtgtcgccgggctacatcggcaccgacatggtgaaggcgatccgccccgacgtgctcgagaagatcgtcgcgacgatcccggtgcggcgtctaggcgggcctgaggaaatcggttcgatcgtcgcgtggctcgcgtcgaacgattccggcttcgcgacgggcgccgacttccctgctgaacggattttttttctctcct(seq id no：20)
59.trpb区序列：
60.gcgaagacctgaaccacaccggtgcgcacaagatcaacaacgtgatcggccaggcgctgctcgcgaagcgcatgggcaagaagcgcgtgatcgccgaaaccggcgccggccagcacggcgttgcgaccgcgacgatctgcgcgcgcttcggcatggagtgcatcgtctacatgggcgccgaggacgtgcgccggcaggccgcgaacgtctaccggatgaa
gctgcttggcgcgacggtcgtgccggtcgaatcgggttcgcgcacgctgaaggacgcgctgaacgaagcgatgcgcgactgggtcacgaacatcgagagcacgttctacatcatcggcacggtcgcgggcccgcacccgtacccgatgatggtgcgcgacttccagcgcgtgatcggcgacgagtgcaaggtgcagatgcccgaactcgcgggccggcagcccgacgcggtgatcgcctgcgtcggcggcggctcgaacgcgatgggcatcttctatccgtacatcgacgatcgatcggtacagctgatcggcgtcgaagcggccggcgacggcctcgacacgggccatcatgcggcctcgctgatcgccggcagcccgggcgtgctgcacggcaaccgcacgtacctgctgcaggacgacaacggccagatcatcgagacgcattcggtgtcggcgggcctcgactatccgggcgtcggccccgaacacgcgtggctgaaggacagcggccgcgcgcagtacgtgccgatcaccgacgacgaggcactgaaggcattccacgactgctgccggatcgaggggatcattcccgcgctcgagtcgagccacgcgatcgcgtatggcgtgaagctcgcgccgacgttgccgaaggacaagatcctgctcgtcaacctgtcgggccgcg(seq id no：21)
61.上述序列经mafft 7.273比对排列、gblocks 0.91b剪切、sequencematrix version 1.7.9连接后，经jmodel test 2.1.7进行演化模型分析，以raxmlgui v.1.5最大似然法(ml)构建系统发育树。系统发育树由45个分类单元构成，其中burkholderia kururiensis lmg 19447t作为外群。述7个位点序列串联后，构建的系统发育树结果表明(图2)，菌株zj9与吡咯伯克霍尔德氏菌zj174、au24190、r
‑
13543和atcc 39277作为一个分支聚在一起，具有ml
‑
bs支持率为100％。系统发育分析结果显示，菌株zj9是吡咯伯克霍尔德氏菌(burkholderia pyrrocinia)，将其命名为吡咯伯克霍尔德氏菌zj9，并保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏号为cctcc m 2021968。
62.实施例2溶磷能力测定
63.将
‑
70℃下保存的吡咯伯克霍尔德氏菌zj9、吡咯伯克霍尔德氏菌zj174、阿伯氏伯克霍尔德氏菌zj5、分散泛菌zj62分别接种于na平板(1％胰蛋白胨、0.1％酵母抽提物、1％蔗糖、0.3％蛋白胨、1.5％琼脂)上，在30℃培养活化2天。分别用无菌枪头转接上述的活化菌株于含有5ml nb(即未加琼脂的na)培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养18h。
64.调整od
600
至0.8后，用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述菌液后转接于nbrip培养基(葡萄糖10g、氯化镁2 5g、氯化钾0.2g、七水硫酸镁0.25g、硫酸铵0.1g、磷酸钙5g、琼脂15g、双蒸水1000ml、ph 5.0或7.0)平板上，在30℃培养3天，测量溶磷圈直径，并按照式1计算溶磷指数，式1如下：
65.溶磷指数％＝(处理菌落直径
‑
无菌滤纸片直径)/无菌滤纸片直径x100。
66.如图3所示，不论在ph 5.0还是ph 7.0条件下，5个细菌菌株均有明显的溶磷效果。各菌株的溶磷指数结果如4所示，在ph 5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌zj9溶磷指数为118.8
±
3.9％，显著高于吡咯伯克霍尔德氏菌zj174的110
±
6.3％、阿伯氏伯克霍尔德氏菌zj5的100
±
4.6％及菠萝泛菌zj3
‑
12的93.1
±
2.9％。而在ph 7.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌zj9溶磷指数为95.8
±
4.6％，显著高于菠萝泛菌zj3
‑
12的87.5
±
4.6％，与阿伯氏伯克霍尔德氏菌zj5的95.8
±
3.9％相当，显著低于吡咯伯克霍尔德氏菌zj174的108.3
±
4.6％。
67.实施例3产铁载体能力测定
68.用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取实施例2中5ml nb培养基中30℃180rpm摇床上培养18h后菌液(调整od
600
至0.8)，转接于cas培养基平板上于30℃培养3d，测量橙黄色晕圈直径。
69.其中，cas培养基的组分及其制备方法如下：
5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌zj9 iaa产量为20.75
±
1.09μg/ml，显著低于菠萝泛菌zj3
‑
12(29.58
±
1.38μg/ml)，但显著高于吡咯伯克霍尔德氏菌zj174(17.67
±
0.63μg/ml)、阿伯氏伯克霍尔德氏菌zj5(11.83
±
0.63μg/ml)和分散泛菌zj62(9.92
±
0.80μg/ml。吡咯伯克霍尔德氏菌zj9在ph 7.0时iaa量显著高于ph 5.0。
85.实施例6在新垦造耕地土壤中对茄子苗的促生作用
86.将上述活化菌株，用无菌枪头接种于新的nb培养基中，于30℃180rpm摇床上培养20h，以获得菌落浓度为108cfu/ml的细菌悬液。
87.‵
杭茄2010
′
种子先用2％次氯酸钠溶液消毒2min，再用无菌水冲洗3次，并在无菌水中浸泡5h，风干。将上述种子置于湿润的无菌滤纸上，于25℃预培养3d。将发芽的种子播种至装满耶糠的32孔穴盘中，置于25℃、相对湿度70～80％的温室中培养。选择长势基本一致的3～4叶期茄子幼苗，定植于装有未灭菌新垦造耕地土壤(采自浙江省杭州市临安於潜新垦造耕地，土壤ph 5.2)的花盆中，每盆1株，每处理30株，三次重复。于定植当天，在茄子植株根部灌上述细菌悬液10ml，以灌无菌水为对照。在30℃、相对湿度70～80％的温室内生长30d后，测定茄子植株株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重。其中，促生作用(gpf％)＝(处理
‑
对照)/对照
×
100％。
88.结果如图9、表1和表2所示，与对照相比，5个菌株对植株生长和生物量的积累均有明显的促进作用，尤其对叶片生长的促进作用最为明显。其中，吡咯伯克霍尔德氏菌zj9灌根处理中，地上、地下干重(或鲜重)比对照增加最多，分别增加54.80％(或76.37％)、39.51％(或154.89％)，而株高和根长比对照增加也较多，分别增加23.34％、46.16％，其还能明显促进茄子植株的早期开花。分散泛菌zj62灌根处理中，根长比对照增加最多，增加49.33％，而株高、地上、地下干重(或鲜重)比对照增加也较多，分别增加23.57％、43.62％(或65.35％)、38.49％(或118.41％)。吡咯伯克霍尔德氏菌zj174灌根处理中，株高比对照增加最多，增加34.50％，而地上、地下干重(或鲜重)比对照增加也较多，分别增加37.39％(或69.06％)、28.95％(或117.01％)，但根长比对照增加最少，增加26.22％。菠萝泛菌zj3
‑
12灌根处理中，地下干重比对照增加最多，增加53.42％，株高、地上干重、地下鲜重对对照增加也较多，分别增加25.45％、44.89％、107.38％，但根长、地上鲜重比对照增加较小，分别增加42.20％、50.17％。而阿伯氏伯克霍尔德氏菌zj5灌根处理中，株高、地上、地下干重(或鲜重)比对照增加最少，分别增加12.52％、13.48(或16.05％)、8.32％(或33.77％)，而根长比对照的增加较少，增加30.40％。
89.表1 5个菌株灌根30d对茄子植株生长的影响
[0090][0091]
注：同列数据后的不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著
[0092]
表2 5个菌株灌根30d对茄子植株的促生作用
[0093][0094]
注：同列数据后的不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著。