一种恶臭假单胞菌及其在降解白酒废水中总氮的应用

1.本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及到一种恶臭假单胞菌及其在降解白酒废水中总氮的应用。


背景技术：

2.白酒酿造作为中国传统酿造产业，近几年迅猛发展，白酒产量呈上升态势，但生产过程中会产生大量的白酒废水。白酒废水主要来源于含高有机物浓度的蒸馏锅底水、发酵盲沟水、蒸馏工段地面冲洗水、酒库的渗漏水、“下沙”和“糙沙”工艺操作期间的高粱冲洗水和浸泡水等，由于其cod、ss值(水质悬浮物)高，ph值呈酸性，成分复杂，且废水中有机物、氮、磷浓度高，色度高，处理难度较大，这给白酒企业带来了极大的环境压力和经济压力。
3.目前，白酒废水一般采用厌氧
‑
好氧为主的多级治理工艺，以达到《发酵酒精和白酒工业水污染物排放标准》(gb27631
‑
2011)。该工艺可以有效降解白酒废水中大部分有机物，但含氮化合物依然较高，从而需进一步生物脱氮。传统生物的脱氮技术是基于微生物硝化作用和反硝化作用的两个独立过程进行。第一个阶段由硝化作用在好氧条件下，将水中的氨氮转化为no2‑
n和no3‑
n，以此硝化产物为底物进行反硝化作用。第二阶段的反硝化作用中，反硝化菌将硝态氮与亚硝态氮进一步转化氮气，达到了将水体中氮离子去除的目的。随着技术进步，异好氧反硝化菌逐渐进入人们视野，该菌能够在好氧条件下同时进行硝化和反硝化作用。好氧反硝化细菌在生物脱氮过程中具有关键作用。因此，好氧反硝化细菌的筛选对白酒废水中总氮的去除具有重要意义。但是迄今为止还未见恶臭假单胞菌降解白酒废水中总氮的报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)及其在降解白酒废水中总氮的应用，该菌株具有易培养、强的耐高温、耐酸碱能力、优异的好氧反硝化能力和总氮降解率高的特点。
5.为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明提供一种恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)，该菌株筛选于白酒厂污水处理站的活性污泥，命名为pseudomonas putida wl
‑
2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年6月28日，保藏编号为gdmcc no:61748。
7.本发明还提供上述恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)在降解白酒废水中总氮的应用。
8.进一步地，该恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)在降解白酒废水中总氮的应用，包括以下步骤：
9.步骤(1)：制备恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)活化菌液；
10.步骤(2)：将步骤(1)所得的活化后的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)菌液投入白酒废水中，进行降解。
11.进一步地，步骤(1)中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)活化菌液的浓度为2
×
107～10
×
107cfu/ml。
12.进一步地，步骤(2)中白酒废水中总氮浓度为4500～5000mg/l。
13.进一步地，步骤(2)中降解的条件为：降解温度为25～30℃，转速为150～210r/min，降解时间为24～48h。
14.进一步地，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的接种量为1～5wt％。
15.进一步地，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)活化菌液的制备方法包括以下步骤：
16.1)、将恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)菌株接种于种子液培养基中，置于25～30℃、150～210r/min摇床培养12～24h后，即得种子液；
17.2)、取富集液体培养基置于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入步骤1)所得的4～8wt％的种子液，然后置于25～30℃、150～210r/min摇床培养1～2天，即得恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)活化菌液。
18.进一步地，步骤1)中种子液培养基配方中包括以下重量份的组份：酵母浸膏3～7份、蛋白胨8～12份、磷酸二氢钾0.1～0.4份、磷酸氢二钾0.1～0.4份、硫酸镁0.1～0.4份和蒸馏水800～1100份。
19.进一步地，步骤2)中富集液体包括以下重量份的组份：葡萄糖14～18份、蛋白胨4～8份、硫酸镁0.5～1.5份、磷酸二氢钾1～4份和蒸馏水800～1100份。
20.进一步地，步骤2)中富集液体的ph为6.5～7.5。
21.进一步地，培养基均采用120～125℃灭菌20～30min。
22.综上所述，本发明具有以下优点：
23.1、白酒废水呈酸性(ph约5.95～6.85)，普通的硝化菌株无法大量生长，本发明中提供的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)对环境适应性强，易培养。
24.2、白酒废水属于高浓度有机废水，其总氮含量高，本发明中提供的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)具备较高降解总氮的能力。且该菌株经多次传代培养，菌株依旧稳定遗传，且降解能力稳定；在传代过程中，并未出现明显的变异菌株。
25.3、本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)是好氧反硝化菌，能够在好氧条件下同时进行硝化和反硝化作用，对白酒废水中总氮降解率达60～85％，为白酒废水生物脱氮过程中提供了重要菌株，对白酒废水降解总氮具有实际的应用价值。
附图说明
26.图1是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)在lb平板培养基上的菌落形态图；
27.图2是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)经革兰氏染色后的结果图；
28.图3是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)扫描电镜图；
29.图4是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)序列进化树图；
30.图5是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的生长和脱氮测试结果曲线图；
31.图6
‑
7是本发明中恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的耐酸碱和耐高温测试结果图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
33.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的分离、纯化和筛选
35.恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的分离、纯化和筛选，包括如下步骤：
36.(1)在白酒厂污水处理站取样，挑选活性污泥，装入无菌取样袋中；
37.(2)称取步骤(1)中所得的10g活性污泥置于装有90ml dm基础培养基的250ml锥形瓶中，进行驯化培养；
38.(3)取步骤(2)中混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑7、10
‑8、10
‑9倍的稀释溶液；
39.(4)用无菌移液枪分别移取步骤(3)所得的0.1ml各稀释液涂布于装有20ml btb固体培养基中，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；
40.(5)将步骤(4)所得的培养基置于30℃恒温培养箱中培养2d；
41.(6)选取上述培养基中呈蓝色单菌落的菌，分别挑取形态各异的单个菌落于btb固体培养基中进行分离纯化；
42.(7)放置于30℃恒温培养箱中培养2d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落；当培养的菌纯化后，将菌株保藏于
‑
20℃冰箱中备用；
43.(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于30℃、160r/min摇床培养24h后，即得种子液；种子液培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨10g，磷酸二氢0.25g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.3g，去离子水1l；
44.(9)取100ml的dm液体培养基于250ml锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入10wt％的种子液，然后置于30℃、160r/min摇床培养2天；培养后5000r/min常温离心10min，测定上清液的总氮指标，选择总氮降解率较高的菌株；其中编号为wl
‑
2的菌株，命名为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)，其总氮降解率为64.18％。
45.上述dm基础培养基配方为磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.01g，磷酸氢二钠7.9g，柠檬酸钠5.66g，硝酸钠0.84g去离子水1l，ph调至7；btb固体培养基配方为dm基础培养基，溴麝香草酚蓝0.0006g，琼脂15g，去离子水1l，ph调整到7.0；培养基采用121℃灭菌20min。
46.实施例2恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的鉴定
47.恶臭假单胞菌(pseudomonas putida wl
‑
2)的鉴定，包括以下步骤：
48.(1)菌株形态、培养特征观察
49.将实施例1复筛获得的总氮降解最好的菌株接种在牛肉膏蛋白胨(na)固体培养基上，37℃培养18h，观察菌落的形态特征，如图1、图2所示，菌落呈浅黄色，圆形扁平，表面湿
润，光滑，边缘整齐，不透明，为革兰氏阴性菌；同时，其扫描电镜图如图3所示。
50.(2)生理生化特性测定
51.生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》进行，包括革兰氏染色、芽孢染色、接触酶反应、硝酸盐还原反应、硫化氢(h2s)试验、柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、糖氧化发酵测定等。
52.生理生化实验结果如附表1所示，硝酸盐还原为阳性，v
‑
p试验为阴性，甲基红试验为阴性，接触酶试验为阳性，糖发酵试验为阳性，柠檬酸盐试验为阳性。
53.表1生理生化鉴定结果
[0054][0055]
注：表中“+”为阳性，
“‑”
为阴性。
[0056]
(3)菌株分子生物学鉴定及其系统发育树的构建
[0057]
经16s rrna鉴定，得到核苷酸序列，序列seq id no：1(序列表)所示。经nbci比对，绘制系统发育树(如图4所示)，本发明提供的菌株与恶臭假单胞菌同源性为100％，为同种类不同菌株的恶臭假单胞菌。
[0058]
根据形态观察、生理生化实验及16s rrna鉴定，wl
‑
2菌株为恶臭假单胞菌pseudomonas putida，且命名为恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2。
[0059]
实施例3
[0060]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2的培养方法，包括如下步骤：
[0061]
(1)配制100ml种子液培养基于250ml锥形瓶中，采用121℃灭菌20min。种子液培养基配方为酵母浸膏5g，蛋白胨10g，磷酸二氢0.25g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.3g，去离子水1l；
[0062]
(2)在无菌操作台上，恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2菌株接种于步骤(1)所得的种子液培养基；
[0063]
(3)将步骤(2)所得的种子液培养基置于30℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
[0064]
(4)配制100ml富集液体培养基于250ml锥形瓶，采用121℃灭菌20min；其中，富集液体培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，去离子水1l，ph调至7；
[0065]
(5)在无菌操作台上，向富集液体培养基中接入6wt％种子液；
[0066]
(6)置于30℃、160r/min摇床培养2天，每2h用可见分光光度计测定一次od
600nm
值和总氮值，即得恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液；
[0067]
(7)将步骤(6)所得的pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液按10倍稀释法依次稀释
成10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7倍的稀释菌液；
[0068]
(8)用无菌移液枪分别移取0.1ml各稀释菌液涂布于装有15ml富集固体培养基中；其中，富集固体培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，去离子水1l，琼脂15g，ph调至7；
[0069]
(9)置于30℃恒温培养箱中培养1d，记录菌落数，计算恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液浓度。
[0070]
根据平板计数，恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液活菌浓度为1.2
×
107cfu/ml，生长曲线和脱氮曲线如图5所示。
[0071]
实施例4
[0072]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2的耐酸碱和耐高温测定。包括如下步骤：
[0073]
(1)配制100ml富集液体培养基于250ml锥形瓶，将其ph值分别调节为1、2、3、7和11、12、13，采用121℃灭菌20min；其中，富集液体培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，去离子水1l；
[0074]
(2)向富集液体培养基中分别接入6wt％种子液；
[0075]
(3)置于160r/min、30℃条件下培养24h，通过od
600nm
值下的吸光度，计算存活率；
[0076]
(4)配制100ml富集液体培养基于250ml锥形瓶，采用121℃灭菌20min，分别接入6wt％种子液；其中，富集液体培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，去离子水1l；
[0077]
(5)分别在30℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中加热2h；
[0078]
(6)置于160r/min、30℃条件下培养24h，通过od
600nm
值下的吸光度，计算存活率。
[0079]
根据结果显示，如图6和图7，本例中恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2在ph为3～11和温度80℃下都能存活。因此恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对酸碱和高温有不错的耐受性。
[0080]
实施例5
[0081]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮进行降解。包括如下步骤：
[0082]
(1)在白酒厂污水处理站取样，取a/o反应池进口处白酒废水，装入无菌塑料桶中；
[0083]
(2)取白酒废水100ml，废水中总氮为4613mg/l，调节ph为6.5，装于250ml锥形瓶中，于121℃灭菌20min；
[0084]
(3)在无菌操作台上，向步骤(2)所得的锥形瓶中接入2wt％恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液(活菌浓度为5.2
×
107cfu/ml)；
[0085]
(4)将步骤(3)所得的接入恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液的锥形瓶置于27.5℃、145r/min摇床中培养24h，作为实验组；
[0086]
(5)将步骤(1)
‑
步骤(4)恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液用无菌生理盐水代替，其余条件与经步骤(1)
‑
步骤(4)所得的实验组一致，作为空白组；
[0087]
(6)培养结束后，测定实验组和空白组的总氮浓度，并计算总氮降解率。
[0088]
总氮指标测定具体方法为：碱性过硫酸钾法消解紫外分光光度法。取两支洁净空消解比色管，一支加入蒸馏水4ml，另一支加入等量稀释十倍的污水样液；分别加入2ml总氮试剂一，拧紧管盖摇匀，将其放入消解仪120℃消解30min消解，冷却，然后分别加入总氮试
剂而1ml；另取两支洁净空消解管，先加入5ml总氮试剂三，再分别取1ml的空白样和污水样的消解液，拧紧摇匀后静置10min显色，在多参数水质分析仪上测定总氮浓度。计算白酒废水总氮降解率。
[0089]
测定结果显示，本例中恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮降解率为71.45％。
[0090]
实施例6
[0091]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮进行降解。步骤如下：
[0092]
(1)在白酒厂污水处理站取样，取a/o反应池进口处白酒废水，装入无菌塑料桶中。
[0093]
(2)取白酒废水100ml,废水中总氮为4613mg/l，调节ph为7.5，装于250ml锥形瓶中，于121℃灭菌20min；
[0094]
(3)在无菌操作台上，向锥形瓶中接入2％恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液(活菌浓度为2.1
×
107cfu/ml)；
[0095]
(4)将步骤(3)所得的接入恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液的锥形瓶置于27.5℃、175r/min摇床中培养24h；
[0096]
(5)将步骤(1)
‑
步骤(4)恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液用无菌生理盐水代替，其余条件与经步骤(1)
‑
步骤(4)所得的实验组一致，作为空白组；
[0097]
(6)培养结束后，测定实验组和空白组的总氮浓度，并计算总氮降解率。
[0098]
测定结果显示，恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮降解率为66.27％。
[0099]
实施例7
[0100]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮进行降解。步骤如下：
[0101]
(1)在白酒厂污水处理站取样，取a/o反应池进口处白酒废水，装入无菌塑料桶中。
[0102]
(2)取白酒废水100ml,废水中总氮为4613mg/l，调节ph为7.0，装于250ml锥形瓶中，于121℃灭菌20min。
[0103]
(3)在无菌操作台上，向锥形瓶中接入2wt％恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液(活菌浓度为8.2
×
107cfu/ml)；
[0104]
(4)将步骤(3)所得的接入恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液的锥形瓶置于30℃、175r/min摇床中培养24h；
[0105]
(5)将步骤(1)
‑
步骤(4)恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液用无菌生理盐水代替，其余条件与经步骤(1)
‑
步骤(4)所得的实验组一致，作为空白组；
[0106]
(6)培养结束后，测定实验组和空白组的总氮浓度，并计算总氮降解率。
[0107]
测定结果显示，恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮降解率为76.61％。
[0108]
实施例8
[0109]
恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮进行降解。步骤如下：
[0110]
(1)在白酒厂污水处理站取样，取a/o反应池进口处白酒废水，装入无菌塑料桶中；
[0111]
(2)取白酒废水100ml,废水中总氮为4613mg/l，调节ph为7.0，装于250ml锥形瓶中，于121℃灭菌20min；
[0112]
(3)在无菌操作台上，向锥形瓶中接入2％恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液(活菌浓度为1.0
×
108cfu/ml)；
[0113]
(4)将步骤(3)所得的接入恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液的锥形瓶置于置于27.5℃、175r/min摇床中培养24h；
[0114]
(5)将步骤(1)
‑
步骤(4)恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2活化菌液用无菌生理盐水代替，其余条件与经步骤(1)
‑
步骤(4)所得的实验组一致，作为空白组；
[0115]
(6)培养结束后，测定实验组和空白组的总氮浓度，并计算总氮降解率。
[0116]
测定结果显示，恶臭假单胞菌pseudomonas putida wl
‑
2对白酒废水中总氮降解率为78.95％。
[0117]
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。