一种将末端炔烃转化为羧酸的方法及其在基因编码库构建中的应用与流程

1.本发明属于生物化学领域，具体涉及一种将末端炔烃转化为羧酸的方法及其在基因编码化合物库构建中的应用。


背景技术：

2.药物研发依赖于多种生物筛选方法来发现先导化合物
1.。阿斯利康的科学家对66个2016年～2017年间的临床候选药物的起源分析发现：43％的临床候选药物是基于先前已知化合物而发现的，29％是通过高通量筛选方法发现的
2.。剩下的筛选方法包括基于结构的药物设计
3.(structure
‑
based drug design，简称sbdd；14％)、针对性的筛选(focused screening；8％)、基于片段化合物而进行的先导化合物的发现(fblg；5％)
4.以及基因编码库筛选(delt；1％)。sbdd：根据目标蛋白质的3d结构特征，依赖于计算机算法指导小分子化合物结构设计与筛选，是发现先导化合物的一个重要途经
5.。基于有机化合物分子片段的筛选(fragment screen)以及其筛选出先导化合物的方法(fblg)：通常是在高浓度下对几千个小分子量(<200da)的化合物组进行筛选，这些基于小分子片段进行的筛选方法是早期活性化合物发现的有效途经
6.。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在许多化合物中通过对生物学靶标的亲和力和/或药理学效力以无差异性的筛选方式找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选法在活性化合物的筛选与发现中的重要作用是无可争议的。但是，其高成本导致了收录化合物总数及化学空间结构上的局限性
7.。另外，高通量筛选法只能在一种或十分有限的2
‑
3种不同生物条件下进行，以至于这种传统的筛选方法的局限性越来越不能满足新药研发的需求。在很多疾病蛋白的筛选实践中，用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选的化合物在数量及化学结构空间上能呈现几何级数上的飞跃，以及同时使用多种生物筛选模式，基因编码化合物库技术(delt)应运而生
8.。尽管delt平台只有简短的发展历史，它已经得到了广泛认可与应用，正积极地影响新药研发的进程。
3.brenner和lerner于1992年提出delt原创理论并预见了它能够使用比传统化学更快捷的方式来合成和筛选数量庞大的编码化合物库
9.。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库(del)极大地增加了化合物的数量和化学空间结构的多样性
10.。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物
11.。delt的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列标记过的化合物文库
12.。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去没有与靶标蛋白质结合的化合物而达到物理分离并找到具有高亲和力的化合物
13.。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克)，而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下
14.(例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、不同的蛋白质浓度、存在或不存在竞争化
合物、存在不同的缓冲液或辅助因子等等)同时进行多项生物筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称pcr)扩增和下一代测序(next generation sequencing，简称ngs)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。然后对具有高亲和力化合物进行“脱离寡聚核酸”的单独合成，并逐个测定没有附着寡聚核酸的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性
15.。这种生物筛选的方式与传统的高通量生物活性筛选中标靶蛋白与单个化合物逐一地进行是根本不同的。
4.最近几年在这一领域里出现的活细胞del筛选方法，是一个引人注目的成就
16.。它代表着通过delt平台可以筛选到有细胞生物活性的化合物。del活细胞筛选将不再需要纯化过的靶标蛋白，也无需对蛋白进行修饰。这样不仅简化了生物筛选的过程，而且更好地保持了蛋白的原生态结构。这样，药物学家能够在此平台上找到更好的先导化合物
[17
‑
18]
。
[0005]
构建化学结构上的多样性是delt能够成功地筛选到有生物活性的化合物的重要原因。通过传统的有机化学反应来合成一些结构新颖的母核化合物。然后，将母核化合物链接到寡聚核酸上，以此构建编码库是许多del的合成思路。此外，还可以直接在寡聚核酸上发现、发展新化学反应。因此，开发有机化学反应在delt上的首次应用是我们工作的重要内容。根据我们掌握的文献资料表明，目前没有在寡聚核酸上合成有机羧酸的方法报道。有机羧酸是重要的有机化合物酰胺的合成原料。常规的化学合成方法是通过酯或酰卤或腈水解、醇或醛或烯烃的氧化、芳香烷烃的氧化等。这些方法中的大多数在寡聚核酸上难以实现。其中可行的方法是通过酯水解得到羧酸。但是，这种方法需要从同时具有与dna能够链接的基团例如羧酸与羧酸酯基团的试剂原料合成。这种试剂的商业来源有限，难以满足基因编码库合成的需要。本发明提供了一种不同于常规酯水解的方法，它只需要一步转化就可以从广泛易得的末端炔烃类化合物转化为羧酸类化合物，因此可以通过此方法获得不同结构的羧酸类化合物。


技术实现要素：

[0006]
本发明所要需要解决的技术问题，在于提供一种将末端炔烃转化为羧酸的方法并应用于基因编码化合物库的构建。具体地，以寡聚核酸末端炔烃化合物为底物，在铜催化剂和硝酮类试剂存在下将末端炔烃转化为羧酸，羧酸是合成酰胺类、羧酸酯类化合物的重要原料。以此反应为基础，可以构建酰胺类、羧酸酯类化合物的基因编码库。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
[0008]
本技术提供一种羧酸化合物，其结构式为是由寡聚核酸连接具有羧基的化学基团构成；
[0009]
其中，取代基团r为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、c1‑
c
12
烷基、c2‑
c6烯烃基、c2‑
c6炔烃基、c3‑
c8环烷基、c1‑
c6烷基氧、c4‑
c
12
芳香基团、c4‑
c
12
杂环芳香基团中的任意一种至多种或它们的任意组合；
[0010]
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。
[0011]
本技术提供在基因编码化合物库构建中将末端炔烃转化为羧酸的方法，具体是以寡聚核酸末端炔烃化合物为底物，在铜催化剂和硝酮类试剂存在下，转化为羧酸。具体反应方程式如下：
[0012][0013]
优选地，以寡聚核酸末端炔烃化合物为底物，在铜催化剂和硝酮类试剂存在下，在0～90℃反应1～24小时转化为羧酸。
[0014]
其中，寡聚核酸末端炔烃化合物的结构式为是由寡聚核酸连接具有端炔基的化学基团构成；所制备的羧酸化合物的结构式为是由寡聚核酸连接具有羧基的化学基团构成，r为末端炔烃上的取代基团。它包括氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、c1‑
c
12
烷基、c2‑
c6烯烃基、c2‑
c6炔烃基、c3‑
c8环烷基、c1‑
c6烷基氧、c4‑
c
12
芳香基团、c4‑
c
12
杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合；
[0015]
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链；
[0016]
其中，所述铜催化剂为醋酸铜、硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、碳酸铜、碘化亚铜、铜
‑
β
‑
环糊精复合物、双(2,4
‑
戊二酮酸)铜、乙酰丙酮铜、四氟硼酸四(乙腈)铜、二氯(1,10
‑
菲咯啉)铜、双(8
‑
羟基喹啉)铜、三氟甲磺酸铜、双(三氟
‑
2,4
‑
戊二酮)铜、高氯酸铜、六氟磷酸四(乙腈)铜、醋酸亚铜、溴化铜、氟化铜、溴化亚铜、氯化亚铜、氯化亚铜
‑
双(氯化锂)络合物、溴化亚铜二甲硫醚；优选地，铜催化剂为碘化亚铜；
[0017]
其中，硝酮结构为结构式中r3、r4、r5为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、c1‑
c
12
烷基、c1‑
c6烯烃基、c1‑
c6炔烃基、c3‑
c8环烷基、c1‑
c6烷基氧、c4‑
c
12
芳香基团、c4‑
c
12
杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合，其中r5不可为氢；优选地，硝酮结构为
[0018]
其中，所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸锂、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铯、硼酸钠、硼酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、n，n
‑
二乙胺、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4
‑
二甲氨基吡啶、n,n
‑
二异丙基乙胺、1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯、n,n,n',n'
‑
四甲基乙二胺、四甲基胍、吡啶、n
‑
甲基二环己胺或二环己胺中的一种或几种的混合物；优选地，所述碱为硼酸钠；
[0019]
其中，所述反应的溶剂是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊
醇、环己醇、2
‑
氟乙醇、2,2
‑
二氟乙醇、2,2,2
‑
三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4
‑
二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n
‑
甲基吡咯烷酮、n,n
‑
二甲基甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2
‑
二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2
‑
甲基吡啶、3
‑
甲基吡啶、4
‑
甲基吡啶、4
‑
甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的混合溶剂；优选地，所述反应的溶剂是无机盐缓冲液与二甲基亚砜的混合溶剂；更优选地，所述反应的溶剂是ph＝9.5的硼酸钠缓冲溶液与二甲基亚砜的混合溶剂。
[0020]
优选地，将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃化合物溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮(200毫摩尔/升)，在50℃下震荡反应3小时。
[0021]
在一个实施方案中，所述寡聚核酸末端炔烃化合物的摩尔浓度是0.1～2毫摩尔/升；优选地，寡聚核酸末端炔烃化合物的摩尔浓度为0.5～1.5毫摩尔/升；更优选地，寡聚核酸末端炔烃化合物的摩尔浓度为1.0毫摩尔/升。
[0022]
在一个实施方案中，所述铜催化剂的用量为1～100当量；优选地，铜催化剂的用量为5～35当量；更优选地，铜催化剂的用量为20当量。
[0023]
在一个实施方案中，所述硝酮类试剂的用量为5～500当量；优选地，硝酮类试剂的用量为50～150当量；更优选地，硝酮类试剂的用量为100当量。
[0024]
在一个实施方案中，所述反应温度为0～90℃；优选地，所述反应的温度为30～70℃；更优选地，所述反应的温度为50℃。
[0025]
在一个实施方案中，所述反应的时间为0～24小时；优选地，所述反应的时间为2～5小时；更优选地，所述反应的时间为3小时。
[0026]
本发明提供了一种将末端炔烃转化为羧酸的方法，为基因编码化合物库羧酸的形成提供了新的方法，增加了基因编码化合物库的多样性，丰富了羧酸合成的路线。本发明提供的反应方法普适性好、条件较温和、操作方便、收率高，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成。
附图说明
[0027]
图1为本发明寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1的液相色谱质谱检测结果。
[0028]
图2为本发明寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
33的液相色谱质谱检测结果。
[0029]
图3为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
1存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0030]
图4为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
3存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0031]
图5为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
4存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0032]
图6为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0033]
图7为本发明所适用的部分硝酮化合物代表结构式。
[0034]
图8为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
2为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0035]
图9为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
3为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0036]
图10为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
6为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0037]
图11为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
7为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0038]
图12为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
8为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0039]
图13为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
9为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0040]
图14为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
10为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0041]
图15为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
18为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0042]
图16为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
19为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0043]
图17为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
32为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0044]
图18为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
33为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0045]
图19为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
34为底物，在铜催化剂和硝酮1
‑
10存在下，末端炔烃转化为羧酸的液相色谱质谱检测结果。
[0046]
图20为本发明以寡聚核酸末端炔烃化合物为底物，在铜催化剂和硝酮类试剂存在下末端炔烃转化为羧酸的炔烃化合物部分代表结构式。
具体实施方式
[0047]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中的所有寡聚核酸原料均为寡聚核酸双链或者单链的底物。寡聚核酸末端炔烃化合物底物的合成方法十分类似。通用的合成方法可以参照实施例1或实施例2完成。硝酮的合成方法十分类似。通用的方法可以参照实施例3完成。
[0048]
实施例1，寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1的合成
[0049]
将10纳摩尔寡聚核酸溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，将80当量5
‑
己炔酸(80毫摩尔/升)在室温下加入到寡聚核酸溶液中，并加入50当量2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(50毫摩尔/升)及200当量n,n
‑
二异
丙基乙胺(200毫摩尔/升)，在室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入4微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，100微升无水乙醇，震荡混匀。放置
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟后，高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
1。通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图1，产物分子量为16284.6，产物的收率为95.0％。
[0050]
具体反应方程式如下：
[0051][0052]
实施例2，寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
33的合成
[0053]
将10纳摩尔寡聚核酸溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，将30当量4
‑
炔基
‑2‑
氟苯胺(30毫摩尔/升)在室温下加入到寡聚核酸溶液中，并加入20当量2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(20毫摩尔/升)及20当量n,n
‑
二异丙基乙胺(20毫摩尔/升)，在室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入4微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，100微升无水乙醇，震荡混匀。放置
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟后，高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃化合物2
‑
33。通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图2，产物分子量为16347.9，产物的收率为92.0％。
[0054]
具体反应方程式如下：
[0055][0056]
实施例3，硝酮1
‑
1的合成
[0057]
0.08毫摩尔芳香硝基化合物溶于700微升乙腈，加入0.16毫摩尔芳香醛基化合物、0.096毫摩尔氯化铵、0.08毫摩尔锌粉以及100微升水，在40℃下搅拌反应12小时。反应结束后离心处理，将上清液直接用于下一步的反应。
[0058][0059]
实施例4，寡聚核酸末端炔烃2
‑
1转化为羧酸
[0060]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
1溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
1(200毫摩尔/升，实施例3制备)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶
液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱并冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
1羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图3。产物分子量为16313.6，产物的收率为52.4％。
[0061]
实施例5，寡聚核酸末端炔烃2
‑
1转化为羧酸
[0062]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
1溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
3(200毫摩尔/升，制备方法同实施例3)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
1羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图4。产物分子量为16313.6，产物的收率为41.8％。
[0063]
实施例6，寡聚核酸末端炔烃2
‑
1转化为羧酸
[0064]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
1溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
4(200毫摩尔/升，制备方法同实施例3)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
1羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图5。产物分子量为16312.8，产物的收率为54.7％。
[0065]
实施例7，寡聚核酸末端炔烃2
‑
1转化为羧酸
[0066]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
1溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升，制备方法同实施例3)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
1羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图6。产物分子量为16317.0，产物的收率为76.0％。
[0067]
我们验证了不同硝酮对寡聚核酸末端炔烃转化为羧酸的反应的影响，通过液相色谱质谱检测在硝酮1
‑
10存在下，反应的产率较高，因此选取硝酮1
‑
10为最优条件。部分硝酮代表结构式见图7。
[0068]
实施例8，寡聚核酸末端炔烃2
‑
2(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0069]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
2溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升
无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
2羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图8。产物分子量为16330.0，产物的收率为62.0％。
[0070]
实施例9，寡聚核酸末端炔烃2
‑
3(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0071]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
3溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
3羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图9。产物分子量为16304.9，产物的收率47.0％。
[0072]
实施例10，寡聚核酸末端炔烃2
‑
6(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0073]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
6溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
6羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图10。产物分子量为16370.3，产物的收率为83.0％。
[0074]
实施例11，寡聚核酸末端炔烃2
‑
7(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0075]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
7溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
7羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图11。产物分子量为16352.3，产物的收率为78.0％。
[0076]
实施例12，寡聚核酸末端炔烃2
‑
8(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0077]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
8溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
8羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图12。产物分子量为16351.4，产物的收率为71.0％。
[0078]
实施例13，寡聚核酸末端炔烃2
‑
9(制备方法同实施例1)转化为羧酸
[0079]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
9溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
9羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图13。产物分子量为16364.8，产物的收率为88.0％。
[0080]
实施例14，寡聚核酸末端炔烃2
‑
10(制备方法同实施例2)转化为羧酸
[0081]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
10溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
10羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图14。产物分子量为16363.2，产物的收率为67.0％。
[0082]
实施例15，寡聚核酸末端炔烃2
‑
18(制备方法同实施例2)转化为羧酸
[0083]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
18溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
18羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图15。产物分子量为16331.1，产物的收率为86.0％。
[0084]
实施例16，寡聚核酸末端炔烃2
‑
19(制备方法同实施例2)转化为羧酸
[0085]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
19溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当量硝酮1
‑
10(200毫摩尔/升)，在50℃下反应3小时。反应结束后，向反应液中加入50当量二乙基二硫代氨基甲酸钠(100毫摩尔/升)水溶液，震荡混匀，在50℃下反应10分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，取上层溶液加入3.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，87.5微升无水乙醇，震荡混匀，放置到
‑
80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到寡聚核酸末端炔烃2
‑
19羧酸产物，通过液相色谱质谱检测产物分子量及确认收率，结果如图16。产物分子量为16304.0，产物的收率为62.0％。
[0086]
实施例17，寡聚核酸末端炔烃2
‑
32(制备方法同实施例2)转化为羧酸
[0087]
将5纳摩尔寡聚核酸末端炔烃2
‑
32溶于5微升硼酸钠缓冲溶液(ph＝9.5，250毫摩尔/升，1当量，1当量)，并加入20微升二甲基亚砜、20当量碘化亚铜(20毫摩尔/升)及100当
library incorporating elements of natural macrocycles[j].angew.chem.int.edit.,2019,58(28),9570
‑
9574.