一种从高粘度发酵液中提取普鲁兰多糖的工艺

1.本发明属于生物技术领域，涉及普鲁兰多糖的工业化生产技术，具体是一种从高粘度发酵液中提取普鲁兰多糖的工艺。


背景技术：

2.普鲁兰多糖是由出芽短梗霉发酵产生的一种大分子胞外多糖。也可称作茁霉兰多糖、短梗多糖或者普鲁兰。它是一种易溶于水的不定形葡聚多糖也是一种水溶性的模式多糖的代表。普鲁兰多糖，主要是通过α
‑
1,4
‑
糖苷键连接三个葡萄糖形成麦芽三糖，再通过α
‑
1,6
‑
糖苷键连接麦芽三糖，从而形成高分子量的线形多糖。其中α
‑
1,4
‑
糖苷键与α
‑
1,6
‑
糖苷键的比例为2:1，聚合度在200～5000，平均分子质量为4万～200万道尔顿。普鲁兰多糖具有良好的溶解性，粘结性、可塑性、稳定性及安全无公害等众多优良性质。普鲁兰多糖溶液直接制成薄膜，其薄膜具有耐油、阻氧性好、硬度强、弹性强、透明、可食等优势，广泛应用于果蔬肉类的保鲜。普鲁兰多糖也广泛应用于医药和化妆品行业等。国外开展相关研究较早，尤其是日本林原已经比较系统的进行生产工艺和应用研究。
3.我国开展相关研究较晚，现如今也已经发表了一些相关文章和专利，也有一些少数企业进行了工业化生产，总体仍然处于研究阶段，提取相对工艺不成熟。由于发酵液是高粘度，用传统的方法，直接处理高粘度的发酵液很困难，需要稀释处理降低粘度，增加水的用量和工作量，而且技术瓶颈也存在于传统提取工艺中使用无机絮凝剂和有机溶剂，还有一些助滤剂，不仅成本高，而且造成有机溶剂残留和固体废弃物无法再生处理，耗费大量资源。如传统的板框过滤除菌中，需要添加助滤剂(硅藻土)，并且需要对发酵液稀释2倍，不仅造成大量固体废物的排放，污染环境，而且菌体蛋白不能回收，造成资源浪费，大量的稀释处理造成也水资源的浪费，并且增加了后续超滤处理的压力。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有普鲁兰多糖提取工艺技术中的缺陷
5.提供一种新型的普鲁兰多糖的提取工艺：采用天然高分子生物絮凝剂(壳聚糖)，不用进行稀释处理、极大的减少用水量，并且不用添加助滤剂和有机溶剂醇沉，用少量天然高分子生物絮凝的方法除去高粘度发酵液中的菌体杂质，还可以吸附一部分色素，对后续脱色处理减少了压力，并且菌体蛋白可以很好的回收。采用等电点
‑
酶法去除发酵液中的蛋白质和大孔树脂脱色，当发酵液中的普鲁兰多糖含量达到一定浓度直接采用真空干燥，得到纯度较高的普鲁兰多糖，避免了有机溶剂的潜在危害，提高了产品产量和品质，减少固体废弃物，降低生产成本。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种从高粘度发酵液中提取普鲁兰多糖的工艺，包括以下步骤：
8.(1)去除发酵液中菌体：用hcl溶液调整高粘度发酵液的ph值3～5，加入冰乙酸溶解壳聚糖絮凝、保温、静置、离心去除菌体和不溶物，制得絮凝除菌体；
9.(2)去除蛋白质：将去除菌体和不溶物后的絮凝除菌体，用naoh溶液调整发酵液ph8～9，静置、离心，取上清液加入碱性蛋白酶，加热保温，灭酶，离心去除蛋白质；
10.(3)脱色处理：步骤(2)得到的发酵液用hcl溶液调整发酵液的ph值3～5,向其中加入大孔树脂，加热保温搅拌，吸附处理，进行色素的去除，然后过滤回收大孔树脂。
11.(4)超滤膜组去除离子:将步骤(3)得到的发酵液，通过超滤膜组件进行超滤除盐，反复循环进行超滤，至普鲁兰多糖浓度达5～8g/100ml。
12.(5)干燥、粉碎、包装。
13.本发明的提取方法可适用于高粘度发酵液，高粘度发酵液的粘度为200～350mpa
·
s。
14.优选地，步骤(1)，壳聚糖用冰乙酸溶解后加入到高粘度发酵液中，壳聚糖含量为0.6～1.0g/l；加热温度30～50℃，静置10～30min，离心转速速为4000～5000rpm，回收菌体蛋白。
15.优选地，选用的壳聚糖为经1％冰乙酸溶解后配置成浓度为0.8～1g/100ml的壳聚糖溶液时，粘度为20～30mpa
·
s，脱乙酰度为85～95％。配置浓度为1g/100ml时粘度为27.5mpa
·
s。
16.当高粘度发酵液粘度为200～250mpa
·
s时，加入高粘度发酵液中含量为0.6～1.0g/l的壳聚糖，加热温度30～50℃，静置20～30min絮凝除菌体，回收菌体蛋白。
17.当高粘度发酵液粘度为250～350mpa
·
s时，加入高粘度发酵液中含量为0.8～1.0g/l的壳聚糖，加热温度40～50℃，静置20min絮凝除菌体，回收菌体蛋白。
18.步骤(2)为去除蛋白质。将去除菌体后的发酵液，用浓度为6～10mol/l的naoh溶液调整发酵液ph8～9，静置15～30min，离心转速4000～5000rpm，取上清加入碱性蛋白酶，加热保温40
‑
50℃，2～3h，温度保持85～95℃，灭酶1～5min，以4000～5000rpm转速离心去除蛋白质。
19.优选地，步骤(2)中，碱性蛋白酶的添加量为80～100u/ml。
20.步骤(3)为脱色处理，其中，一种优选的方式为静态吸附，具体为，向经去除菌体和蛋白的后的发酵液用浓度为4～7mol/l的hcl溶液调整发酵液的ph值3～5,向其中加入大孔树脂，加热保温搅拌(转速180～220rpm)吸附处理1～3h，进行色素的去除，然后过滤回收大孔树脂。
21.另一种优选的方式为动态吸附，具体为，向经去除菌体和蛋白的后的发酵液用浓度为4～7mol/l的hcl溶液调整发酵液的ph值3～5,控制流速5～15bv/h，上柱体积为10～15bv通过大孔树脂交换柱，收集滤出液。所述加热保温温度为20～40℃。优选动态吸附方式，大孔树脂的添加量为每100ml发酵液添加3～10g，所述大孔树脂的型号优选为：lx～68m。
22.步骤(4)为采用超滤膜组去除离子。一种优选的方法为：将经过去除菌体、蛋白和脱色后的发酵液，通过截留分子量为1000～10000da的超滤膜组件进行超滤除盐，操作压力为0.20～0.40mpa,向发酵液中加入0.5～1.0倍体积的蒸馏水，反复进行6～8次的循环超滤，至普鲁兰多糖浓度达5～8g/100ml，且溶液按葡萄糖计，单糖、二糖和寡糖质量含量小于10％，且溶液电导率为50～300μs/cm。
23.步骤(5)，为了提高干燥、粉碎、包装工序的效率，可将步骤(4)中的普鲁兰多糖溶
液旋蒸浓缩至多糖含量为10～20g/100ml，铺成0.2～1.2mm厚进行干燥到恒重，最后粉碎包装得到普鲁兰多糖成品。
24.所述干燥方式为真空干燥。
25.所述真空干燥工艺具体参数为：
‑
0.08～
‑
0.1mpa，温度为60～70℃，时间为2～6h。
26.本发明的技术方案原理和有益效果：
27.各种蛋白质因氨基酸残基组成不同。当溶液在某一特定ph值的条件下，蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等(总净电荷为零)时，因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，而沉淀析出。同时蛋白质的黏度、渗透压、膨胀性以及导电能力均为最小。可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。
28.有益效果
29.1、采用天然高分子生物絮凝剂——壳聚糖絮凝剂，絮凝去除粘度200～350mpa
·
s的高粘度普鲁兰多糖发酵液中的菌体，可以减少一倍用水量；可以避免引入无机絮凝剂和固体助滤剂的添加造成固体废弃物，造成环境污染；还可以很好的回收高蛋白含量的菌体制作菌体饲料添加剂，做到无废物，还可以絮凝除去一部分色素，减轻了后续脱色处理的压力。
30.2、采用本发明的方法，采用天然高分子生物絮凝剂壳聚糖，可处理粘度为200～350mpa
·
s的高粘度普鲁兰多糖发酵液发酵液，不用对高粘度发酵液进行稀释处理，可减少一倍用水量；使用少量的壳聚糖即可絮凝除去发酵液中的菌体杂质，同时壳聚糖还可以吸附一部分色素，对后续脱色处理减少了压力；可以避免引入无机絮凝剂和固体助滤剂的添加造成固体废弃物，造成环境污染；可以避免引入无机絮凝剂和固体助滤剂的添加造成固体废弃物，可以避免引入无机絮凝剂和固体助滤剂的添加造成固体废弃物，造成环境污染；
31.3、
·
采用等电点
‑
酶法去除发酵液中的蛋白质，保温时短，不仅避免长时间保温热变性除蛋白，也避免使用无机和有机化学试剂除蛋白，造成试剂的残留。
32.4、采用大孔树脂吸附发酵液中的色素，操作简便，去除蛋白效果好，脱色效果优异脱色效率高，，并且树脂可以再生，多次重复使用，节省成本。
33.5、本发明的普鲁兰多糖提取工艺，得到纯度较高的普鲁兰多糖，提高了产品产量和品质，减少固体废弃物，降低生产成本，生产过程可以实现安全、高效、连续和自动化。产品收率可达90～95％，纯度为92～97％，品质好，生产过程可实现安全性、连续性和自动性。
附图说明
34.图1本发明的普鲁兰多糖提取工艺路线图
具体实施方式
35.本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
36.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
37.实施例1：
38.(1)去除菌体：用浓度为6mol/l的hcl溶液调整高粘度发酵液(200mpa
·
s)的ph值5，向其中加入壳聚糖使其含量达1.0g/l，保持温度30℃，静置10min，离心转速4000rpa，离心去除菌体和不溶物。
39.(2)蛋白质的去除：将去除菌体后的发酵液，用浓度为6mol/l的naoh溶液调整发酵液ph8.2，静置15min，离心(转速5000rpa)，取上清加入80u/ml碱性蛋白酶，在温度40℃下保持2h，90℃灭酶5min，离心(转速5000rpa)去除蛋白质和残留的壳聚糖絮状物。
40.(3)大孔树脂脱色处理：向经去除菌体和蛋白的后的发酵液用浓度为6mol/l的hcl溶液调整发酵液的ph值3,向其中加入5g/100ml大孔树脂(lx～68m)，加热30℃保温搅拌(转速220rpm)吸附处理1.5h，进行色素的去除，然后过滤回收大孔树脂。(4)离子去除:将经过去除菌体、蛋白和脱色后的发酵液，依次通过截留分子量为5000da和10000da的超滤膜组件进行超滤除盐，操作压力为0.20mpa,根据截留测液体中盐类含量的指标，向发酵液中加入1.0倍体积的蒸馏水，循环进行超滤，反复进行8次，确保溶液中盐类等小分子物质含量符合标准，即溶液按葡萄糖计，单糖、二糖和寡糖质量含量小于10％，且溶液电导率为蒸馏水和自来水电导率，50～300μs/cm，并使普鲁兰多糖浓度达8g/100ml。
41.(5)干燥：将步骤(4)中的普鲁兰多糖溶液旋蒸浓缩至多糖含量为15g/100ml，铺成0.5mm厚于
‑
0.09mpa，65℃进行干燥到恒重，最后粉碎包装得到普鲁兰多糖成品。
42.经上述提取工艺普鲁兰多糖的提取收率可达90.8％，纯度95％，菌体蛋白回收率12.4％。
43.实施例2：
44.(1)去除菌体：用浓度为5mol/l的hcl溶液调整高粘度发酵液(250mpa
·
s)的ph值3，向其中加入壳聚糖使其含量达0.8g/l，保持温度40℃，静置20min，离心转速5000rpa，离心去除菌体和不溶物。
45.(2)蛋白质的去除：将去除菌体后的发酵液，用浓度为10mol/l的naoh溶液调整发酵液ph8.5，静置20min，离心(转速5000rpa)，取上清加入100u/ml碱性蛋白酶，在温度40℃下保持2.5h，90℃灭酶5min，离心(转速5000rpa)去除蛋白质和残留的壳聚糖絮状物。
46.(3)大孔树脂脱色处理：向经去除菌体和蛋白的后的发酵液用浓度为5mol/l的hcl溶液调整发酵液的ph值3，以上柱体积15bv，上样速率5bv/h大孔树脂(lx～68m)，收集滤出液。
47.(4)离子去除:将经过去除菌体、蛋白和脱色后的发酵液，依次通过截留分子量为3000da和10000da的超滤膜组件进行超滤除盐，操作压力为0.40mpa,根据截留测液体中盐类含量的指标，向截留发酵液中加入1.0倍体积的蒸馏水，循环进行超滤，反复进行6次，确保溶液中盐类等小分子物质含量符合标准，并使普鲁兰多糖浓度达7g/100ml。
48.(5)干燥：将步骤(4)中的普鲁兰多糖溶液旋蒸浓缩至多糖含量为20g/100ml，铺成0.8mm厚于
‑
0.10mpa，60℃进行干燥到恒重，最后粉碎包装得到普鲁兰多糖成品。
49.经上述提取工艺普鲁兰多糖的提取收率可达93％，纯度94.5％，菌体蛋白回收率12.1％。
50.实施例3：
51.(1)去除菌体：用浓度为7mol/l的hcl溶液调整高粘度发酵液(280mpa
·
s)的ph值4，向其中加入壳聚糖使其含量达0.9g/l，保持温度40℃，20min，离心转速5000rpa，离心去
除菌体和不溶物，回收蛋白。
52.(2)蛋白质的去除：将去除菌体后的发酵液，用浓度为8mol/l的naoh溶液调整发酵液ph8.3，静置20min，离心(转速5000rpa)，取上清加入90u/ml碱性蛋白酶，在温度45℃下保持3h，90℃灭酶5min，离心(转速5000rpa)去除蛋白质和残留的壳聚糖絮状物。
53.(3)大孔树脂脱色处理：向经去除菌体和蛋白的后的发酵液用浓度为5mol/l的hcl溶液调整发酵液的ph值3,以上柱体积10bv，上样速率10bv/h大孔树脂(lx～68m)，收集滤出液。
54.(4)离子去除:将经过去除菌体、蛋白和脱色后的发酵液，依次通过截留分子量为1000da和5000da的超滤膜组件进行超滤除盐，操作压力为0.30mpa,根据截留测液体中盐类含量的指标，向截留发酵液中加入1.0倍体积的蒸馏水，循环进行超滤，反复进行7次，确保溶液中盐类等小分子物质含量符合标准，并使普鲁兰多糖浓度达10g/100ml。
55.(5)将步骤(4)中的普鲁兰多糖溶液旋蒸浓缩至多糖含量为10g/100ml，铺成1.0mm厚于
‑
0.08mpa，70℃进行干燥到恒重，最后粉碎包装得到普鲁兰多糖成品。
56.经上述提取工艺普鲁兰多糖的提取收率可达94.2％，纯度93.2％；菌体蛋白回收率12.76％。
57.传统工艺(除菌)与本发明效果对比：
58.表1天然高分子壳聚糖絮凝除菌与传统板框过滤除菌差异
59.