乳酸片球菌DY15及其应用、饲料及其制备方法与流程

乳酸片球菌dy15及其应用、饲料及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种乳酸片球菌dy15及其应用、饲料及其制备方法。


背景技术：

2.乳酸菌是一类革兰氏阳性、无芽孢的细菌总称，其发酵糖类的主要代谢产物为乳酸。乳酸菌作为一种活的微生物，对人类和动物的健康发挥着重要的作用，其抗菌和益生菌特性被应用在食品发酵、禽畜牧业、医疗保健和工业生产乳酸等多个领域，乳酸菌也随之成为重点研究对象。其中乳酸片球菌表现的健康作用也被用作治疗肠道感染、炎症性肠病，并且禽畜业中乳酸菌的加入替代带了抗生素的作用，丰富了饲料的营养，维持了肠道菌群平衡，促进动物健康发展。
3.棕榈粕是油棕榈果实提油后的副产品，产量巨大，价格低廉，不含黄曲霉毒素，并具有脂肪、粗纤维和氨基酸含量高的特点。豆皮是大豆加工后的副产品，木质素含量低，纤维含量高，容易吸收。由于受到非常规饲料原料的营养成分和饲用价值评定的限制，导致在配制日粮时，无法准确确定其最大添加比例。此外，由于棕榈粕中总碳水化合物多是难以消化的甘露聚糖等非淀粉多糖，豆皮中也有影响营养成分消化吸收的大豆球蛋白等抗营养因子，并且多肽类物质含量偏低，不利于动物的消化和吸收。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15，于2021年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20211291。
6.本发明的第二目的在于提供一种菌剂。
7.本发明的第三目的在于提供上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在制备抑菌产品中的应用。
8.本发明的第四目的在于提供上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在饲料中的应用。
9.本发明的第五目的在于提供一种饲料的制备方法。
10.本发明的第六目的在于提供一种饲料。
11.第一方面，本发明提供了一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15，所述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20211291。
12.第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15。
13.第三方面，本发明提供了上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在制备抑菌产品中的应用。
14.作为进一步技术方案，所述抑菌包括抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的至少一种。
15.第四方面，本发明提供了上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在如下a～c任一项中的应用：
16.a.制备饲料；
17.b.改善饲料的适口性；
18.c.提高饲料的营养价值。
19.第五方面，本发明提供了一种饲料的制备方法，包括如下步骤：将底物与碱性蛋白酶、甘露聚糖酶和上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂混合，经发酵制备得到饲料；
20.所述底物包括棕榈粕和豆皮。
21.作为进一步技术方案，所述棕榈粕和豆皮的质量比为6:2～6:6，优选为6:4；
22.优选地，所述底物还包括糖蜜；底物中糖蜜的质量百分比为1％～5％，优选为3％。
23.作为进一步技术方案，混合后，所述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15的浓度为1
×
107cfu/g以上；
24.优选地，所述碱性蛋白酶的用量为1000～1500u/g底物，优选为1200u/g底物；
25.所述甘露聚糖酶的用量为2000～3000u/g底物，优选为2500u/g底物。
26.作为进一步技术方案，底物含水质量百分比为45％～65％，优选为55％；
27.优选地，所述发酵的温度为36～38℃，优选为37℃；
28.优选地，所述发酵的时间为36～60h，优选为48h；
29.优选地，所述发酵的方式为密封发酵。
30.第六方面，本发明提供了一种饲料，采用上述制备方法制备得到。
31.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32.经发明人研究发现，本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15具有抑菌活性，对于大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用，其发酵产物包括多种风味物质，能够应用于饲料领域中，提高饲料的营养价值，改善适口性，提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统。
33.本发明提供的饲料的制备方法以棕榈粕和豆皮为底物，以乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15为发酵菌，同时添加碱性蛋白酶和甘露聚糖酶，采用菌酶协同发酵的方式处理棕榈粕和豆皮，该方法简单方便，不仅大大提高了棕榈粕和豆皮的抑菌能力和有机酸的含量，还提高了饲料的适口性，让棕榈粕和豆皮成为饲料变成了可能；发酵结束后，乳酸含量较未发酵之前提高了671.93倍，总酸含量与未发酵前相比，提高了6.34倍，产酸能力适中，不会导致棕榈粕和豆的过分酸化；小肽含量比未发酵前提高了28.03％，提高了原料的附加价值，有利于废弃物再利用；发酵后出检测出含量不等的辛酸乙酯、月桂酸甲酯、乙偶姻、十四酸甲酯、乙酸、辛酸异戊酯和苯乙醛等风味物质，其中有许多都是制作香精香料的常用材料，提高了发酵棕榈粕和豆皮的适口性。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1为乳酸片球菌dy15在平板培养基形态；
36.图2为乳酸片球菌dy15在mrs培养基中的生长曲线。
具体实施方式
37.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
38.第一方面，本发明提供了一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15，该菌株的分类命名为：乳酸片球菌dy15，拉丁文学名：pediococcus acidilactici dy15，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年10月18日，保藏编号：cctcc no：m 20211291。
39.本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15分离自无锡欧尚超市购得酸菜，该菌菌体为中等大小，培养基上菌落为乳白色，表面光滑湿润，隆起，有一种奇特的酸香的味道。
40.经发明人研究发现，本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15具有抑菌活性，对于大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用，其发酵产物包括多种风味物质，能够应用于饲料领域中，提高饲料的营养价值，改善适口性，提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统。
41.第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15，或者还包括其他菌株或者本领域技术人员所熟知的辅料，由于该菌剂含有乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15，因此，该菌剂具有本发明菌株的全部有益效果。
42.第三方面，本发明提供了上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在制备抑菌产品中的应用。
43.经发明人研究发现，本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15具有抑菌活性，对于大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用，因此能够用于制备抑菌产品。
44.第四方面，本发明提供了上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂在如下a～c任一项中的应用：
45.a.制备饲料；
46.b.改善饲料的适口性；
47.c.提高饲料的营养价值。
48.经发明人研究发现，本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15
具有抑菌活性，对于大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用，其发酵产物包括多种风味物质，能够应用于饲料领域中，提高饲料的营养价值，改善适口性，提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统。因此，本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15能够应用于制备饲料，改善饲料的适口性以及提高饲料的营养价值中。
49.第五方面，本发明提供了一种饲料的制备方法，包括如下步骤：将底物与碱性蛋白酶、甘露聚糖酶和上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15或菌剂混合，经发酵制备得到饲料；
50.所述底物包括棕榈粕和豆皮。
51.本发明提供的制备方法简单方便，采用菌酶协同发酵的方式处理棕榈粕和豆皮，提高了棕榈粕和豆皮的抑菌能力和有机酸的含量，能够阻止致病菌在动物肠道中的定植，增强动物的抗病能力，减少原料中的抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率和动物的消化能力，对提高棕榈粕和豆皮的饲用价值以及对非常规饲料的利用具有重大意义。
52.作为进一步技术方案，所述棕榈粕和豆皮的质量比例如可以为，但不限于6:2、6:3、6:4、6:5或6:6，优选为6:4；
53.优选地，所述底物还包括糖蜜；底物中糖蜜的质量百分比例如可以为，但不限于1％、2％、3％、4％或5％，优选为3％。
54.作为进一步技术方案，混合后，所述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15的浓度为1
×
107cfu/g以上；
55.优选地，所述碱性蛋白酶的用量例如可以为，但不限于1000u/g底物、1100u/g底物、1200u/g底物、1300u/g底物、1400u/g底物或1500u/g底物，优选为1200u/g底物；
56.所述甘露聚糖酶的用量例如可以为但不限于2000u/g底物、2200u/g底物、2400u/g底物、2600u/g底物、2800u/g底物或3000u/g底物，优选为2500u/g底物。
57.需要说明的是，“1200u/g底物”是指1g底物添加1200u的酶。
58.作为进一步技术方案，底物含水质量百分比例如可以为，但不限于45％、49％、53％、57％、61％或65％，优选为55％；
59.优选地，所述发酵的温度例如可以为但不限于36℃、37℃或38℃，优选为37℃；
60.优选地，所述发酵的时间例如可以为，但不限于36h、40h、44h、48h、52h、56h或60h，优选为48h；
61.优选地，所述发酵的方式为密封发酵。
62.通过对发酵工艺的进一步优化和调整，更好的实现对棕榈粕和豆皮的发酵，提高饲料的适口性和营养价值。
63.第六方面，本发明提供了一种饲料，采用上述制备方法制备得到。
64.本发明提供的饲料营养价值高，易消化，适口性好，能够增强禽畜的抗病能力。
65.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
66.实施例1菌株的筛选
67.1培养基：mrs培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温80 1ml，蒸
馏水1l，115℃灭菌20分钟。
68.2筛选：该菌株分离自无锡欧尚超市购得酸菜，将酸菜先置于mrs培养基37℃培养24小时，用无菌水将培养液分别进行100，1000倍稀释，取100μl涂布于mrs固体培养基，37℃培养24小时，通过划线分离获得的一株乳酸菌株(如图1所示)。其微生物学特征是革兰氏染色典型阳性，菌体为中等大小，培养基上菌落为乳白色，表面光滑湿润，隆起，有一种奇特的酸香的味道。将该菌株在mrs培养基中培养，其生长曲线如图2所示。
69.3：菌株的鉴定：将筛选出来的菌种涂布于mrs平板上，挑取单菌落利用通用引物1492r(ggttaccttgttacgactt(seq id no.1))和27f(agagtttgatcctggctcag(seq id no.2))进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16srrna测序，序列所得结果通过ncbi的nucleotide blast与genbank中的模式菌株进行同源性比对。比对结果显示与genbank中相关模式菌株的16srna有99％的相似性i确定该菌株为乳酸片球菌，命名为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)dy15。
70.实施例2乳酸片球菌dy15生理生化特征的鉴定
71.(1)石蕊牛奶实验：牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在其中加入石蕊作指示剂和氧化还原指示剂，石蕊在中性时呈淡紫色酸性时呈粉红色碱性时呈蓝色还原时，则自上而下使牛奶褪色还原为白色。乳酸细菌发酵乳糖产酸，石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。观察接种和培养后的石蕊牛奶实验结果，37℃培养一天即可观测石蕊牛奶产酸和凝固反应。
72.(2)淀粉水解实验：将菌种接种于含有可溶性淀粉的基础培养基中，37℃培养24h，取少许培养液于比色盘内，同时取未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液。不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。
73.(3)明胶液化实验：将实验菌株接种于含有明胶的基础培养基中，置37℃培养24h，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于4℃冰箱中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。
74.(4)v-p实验：将实验菌株接种于pyg培养基中，37℃培养24h，取培养液在其中加入茶酚和氢氧化钾，置于不加盖的试管中混合，并陆续振荡30分钟，显示红色为阳性反应。
75.(5)葡聚糖实验：将新鲜的培养物接种于含有蔗糖的培养基斜面上，37℃培养24h。斜面上培养物形成粘稠的菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。
76.(6)硫化氢实验：将新鲜的培养物接种于含有半胱氨酸或胱氨酸的培养基中，用无菌的镊子夹取一乙酸铅滤纸条悬挂于接种试管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，实验中设空白对照，在没接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养24h，进行观察比较，纸条变黑色为阳性反应。
77.(7)糖发酵实验：将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入基础培养基中，分别分装到5ml试管。37℃，振荡培养24h。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的培养液作为对照，滴加btb-mr试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。
78.dy15菌株的生理生化特性见表1和表2，结果显示，石蕊牛奶、v-p实验呈阳性，淀粉水解、硫化氢实验、葡聚糖、明胶液化呈阴性，能发酵利用d-半乳糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、d-甘露糖产酸。
79.表1乳酸片球菌dy15的生理特性
[0080][0081]
注：
“‑”
表示阴性，“+”表示阳性。
[0082]
表2乳酸片球菌dy15糖发酵结果
[0083][0084]
注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵。
[0085]
实施例3菌株抑菌直径的测定方法
[0086]
指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于lb液体培养基，37℃培养24h。
[0087]
采用牛津杯法：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基15-20ml，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，每50-100ml培养基加入指示菌菌悬液0.1-0.2ml(菌浓为108cfu/ml)，在每1个平板中分别加入5ml，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μl乳酸菌上清液，37℃培养10-13h后，测量各抑菌圈直径(或面积)，结果如表3所示。
[0088]
表3乳酸片球菌dy15抑菌效果
[0089][0090]
实施例4乳酸片球菌微生物菌剂的制备
[0091]
(1)将乳酸片球菌原始菌种按照1％的接种量接种到mrs培养基，37℃活化24h，按照同样的方式活化2-3代，继续于mrs培养基中培养，得到乳酸片球菌的菌液。
[0092]
(2)乳酸菌菌液的制备：将原始乳酸片球菌菌株，放入mrs液体培养基37℃活化24h，按照上述步骤活化2次，再在mrs液体培养基37℃培养24h获得发酵液。
[0093]
菌落计数：取发酵液1ml，在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul蒸馏水的离心管内，并在液体中反复吹打5次，振荡混匀(注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀)。按上述步骤逐级稀释，取
10-7
，10-8
两个梯度菌悬液100μl滴加到种子培养基平板上，进行涂板，计数菌落。
[0094]
实施例5菌酶协同发酵棕榈粕和豆皮工艺
[0095]
使用粗杆类粉碎机将原料棕榈粕和豆皮按质量比6：4的比例粉碎至2cm
±
0.5cm后待用。将水、乳酸片球菌dy15、碱性蛋白酶、甘露聚糖酶添加到棕榈粕和豆皮中进行发酵；使棕榈粕和豆皮中的水分的含量为55％(m/m)，碱性蛋白酶的含量为1200u/g底物，甘露聚糖酶含量为2500u/g底物，乳酸片球菌dy15按照实施例4的方法培养，并按照5％(v/m，ml/g)的接种量将菌液加入至底物中，使菌浓达1
×
107cfu/g。
[0096]
采用folin-酚法测定小肽含量为62.72mg/g，提高了28.03％；采用酸碱滴定法测定总酸含量为5.07％，提高了6.34倍；检测到乳酸菌数为2
×
107cfu/g，提高了50％；采用hplc法测定实施例5中所得发酵原料中的有机酸含量，结果如表4所示，发现乳酸、乙酸等含量显著提高。其中乳酸在发酵后含量提高了671.93倍。
[0097]
表4乳酸片球菌dy15有机酸含量
[0098][0099]
注：对照组为不经过发酵处理的原料。
[0100]
实施例6：发酵前后提高饲料适口性的芳香物质
[0101]
饲料风味剂又称诱食剂、食欲增进剂，其作用原理与动物的味觉、嗅觉、呼吸系统、消化系统等功能密切相关，可以提高饲料的适口性。顶空试验检测结果表明，实施例5所得发酵棕榈粕和豆皮后风味物质中辛酸乙酯、月桂酸甲酯、乙偶姻、十四酸甲酯、乙酸、辛酸异戊酯和苯乙醛等相对含量较高。辛酸乙酯主要用于食品加香剂及香料的配制，有类似白兰地的香气，并有甜味；乙偶姻主要用于配置奶油、乳品、酸奶和草莓等食用香料，具有强烈的奶油和脂肪香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气；月桂酸甲酯主要用于食用香精和日化香精的配制，具有脂肪、花香、葡萄酒样香气；十四酸甲酯常用于蜂蜜、椰子等食用香精，亦用于日用香精，还用于有机合成。发酵饲料中还检测到麦芽酚、癸酸乙酯、豆蔻酸、δ-十二内酯、棕榈酸乙酯等，这些都是制作香精香料的常用材料。此外还检测到甲酸、乙酸铵、丙酸、丁酸、l-乳酸、己酸等能抑制病原菌和不良腐败微生物的生长。
[0102]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。