一株可改性麦麸的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株可改性麦麸的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.麦麸也叫麦皮，是小麦粉制作工艺中的副产品，我国麦麸年产量超过3000万吨，但是我国对麸皮的广泛应用仍处于较低水平，食用和商用价值较低。
4.麦麸的营养物质丰富，含有多种维生素、多糖、多酚物质和膳食纤维，有益于人体健康。但是存在以下原因：麦麸中纤维素与半纤维素等不容物较多，食用口感差；麦麸某些理化性质差，不能高效地利用某些功能性物质；小麦麸皮含有的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)含量较面粉中高，don是禾谷镰刀菌产生，化学性质属于单端孢霉烯族化合物。因为它能引起动物呕吐反应又被叫做呕吐毒素，含有呕吐毒素的小麦制品对人体的健康有很大的威胁，毒理学经过实验表明，呕吐毒素对细胞、神经都有毒性，呕吐是最主要的症状。当禾谷镰刀菌污染小麦后，即赤霉病，呕吐毒素在小麦中检出率最高，是一种危害性很高的真菌毒素。
5.对麦麸改性常见的方法包括物理方法、化学法、生物法。物理法改性主要通过里的作用改变膳食纤维的结构，常用的物理法包括挤压膨化处理、超高静压、超微粉碎、热蒸汽等方法增加物质的溶出，是比较常用的一种方法。化学法可以打断膳食纤维的化学键，但添加化学物质容易引起食品安全问题，对麦麸改性具有一定的局限性。生物法处理麦麸常用的酶改性制剂有纤维素酶、木聚糖酶和半纤维素酶。目前研究麦麸改性的方法通常将物理、化学、生物法联合起来处理，可以达到较好的麦麸改性效果。但是无论物理或化学处理麦麸中don一般不会在加工、储藏、烹调过程中破坏。


技术实现要素：

6.基于上述现有技术的不足，本发明提一株可改性麦麸的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，该菌株是从玉米黄浆水中通过筛选、纯化及鉴定等技术获得，通过采用该菌株对麦麸进行固态发酵，可以有效改性麦麸，经实验证明，其能在发酵过程中显著抑制禾谷镰刀菌的生长，防止禾谷镰刀菌爆发，产生真菌毒素造成二次污染，并且能够综合有效地提高麦麸的品质，因此具有良好的实际应用之价值。
7.为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)yh03，该菌株已于2021年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为cctcc no：m 2021164。
9.所述贝莱斯芽孢杆菌yh03的特性如下：革兰氏阳性(+)菌，菌体杆状，有芽孢，碱性厌氧。接触酶阳性，柠檬酸试验阳性。菌落在lb培养基上乳白色，初期表面光滑，粘液状不宜挑起，边缘不整齐；后期菌落表面呈膜。
10.所述贝莱斯芽孢杆菌yh03的代谢物也属于本发明的保护范围。
11.本发明的第二个方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌yh03的培养方法，所述培养方法包括将所述贝莱斯芽孢杆菌yh03接种至发酵培养基进行发酵培养。
12.其中，所述发酵培养基可以是lb液体培养基，所述lb液体培养基具体组成为：胰蛋白胨3g、酵母提取物1.5g、nacl 3g、蒸馏水补足至300ml，ph值7.0。
13.本发明的第三个方面，提供一种菌剂，其包括上述第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌yh03或其发酵物或其代谢产物。
14.本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
15.本发明的第四个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或含贝莱斯芽孢杆菌yh03的代谢物。
16.本发明的第五个方面，上述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或微生物菌剂在如下1)-3)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
17.1)在抑制病原菌和/或在制备病原菌抑制剂中的应用；
18.2)在抑制病害和/或制备病害抑制剂中的应用；
19.3)在固态发酵和/或制备固态发酵剂中的应用。
20.上文所述应用1)中，所述病原菌包括禾谷镰刀菌，其可产生真菌毒素即脱氧雪腐镰刀菌烯醇(即呕吐毒素，don)；
21.上文所述应用2)中，所述病害可以为禾谷镰刀菌引发的植物病害，所述植物病害可以为小麦赤霉病；
22.上文所述应用3)中，所述固态发酵可以为麦麸固态发酵；经试验证明，采用本发明的贝莱斯芽孢杆菌yh03对麦麸进行固态发酵处理，可以改性麦麸，增加麦麸中可溶性膳食纤维戊聚糖含量、总多酚含量，发酵后的麦麸具有更强的抗氧化活性，对人体或动物有利；同时有效降低麦麸中的呕吐毒素(don)。
23.因此，本发明的第六个方面，提供一种麦麸固态发酵方法，所述方法包括：向麦麸中加入上述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或微生物菌剂。
24.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
25.上述技术方案首次筛选获得一株可改性麦麸的贝莱斯芽孢杆菌，通过采用该菌株对麦麸进行固态发酵，经实验证明，其能在发酵过程中显著抑制禾谷镰刀菌的生长，防止禾谷镰刀菌爆发，产生真菌毒素造成二次污染，经发酵后的麦麸与未发酵的麦麸相比，发酵后的麦麸总酚、抗氧化性、可溶性戊聚糖和总戊聚糖都显著增加。发酵后的麦麸持水性呈上升趋势，持油性有所下降，从而综合有效地提高麦麸的品质。同时发酵条件温和，设备简单，可实现无污水、无臭气排放，是一项符合绿色环保节能的技术。因此具有优异且广泛的实际应用之价值。
附图说明
26.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示
意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
27.图1为本发明实施例中贝莱斯芽孢杆菌yh03平板和镜检图。
28.图2为本发明实施例中贝莱斯芽孢杆菌yh03平板对峙图。
29.图3为本发明实施例中贝莱斯芽孢杆菌yh03发酵液抑菌效果图。
30.图4为本发明实施例中贝莱斯芽孢杆菌yh03的gyrb系统发育树。
31.图5为本发明实施例中贝莱斯芽孢杆菌yh03的冻干型菌粉图。
32.图6为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸呕吐毒素含量影响图。
33.图7为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸可溶性戊聚糖和总戊聚糖含量的影响图。
34.图8为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸总酚含量的影响图。
35.图9为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸抗氧化性的影响图。
36.图10为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸蛋白质的影响图。
37.图11为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸蛋白质的影响图。
38.图12为本发明实施例中芽孢杆菌yh03发酵对麦麸持油性的影响图。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
41.本发明的一个具体实施方式中，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)yh03，该菌株已于2021年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为cctcc no：m 2021164。
42.所述贝莱斯芽孢杆菌yh03的特性如下：革兰氏阳性(+)菌，菌体杆状，有芽孢，碱性厌氧。接触酶阳性，柠檬酸试验阳性。菌落在lb培养基上乳白色，初期表面光滑，粘液状不宜挑起，边缘不整齐；后期菌落表面呈膜。其gyrb片段测序结果如seq id no.1所示。
43.所述贝莱斯芽孢杆菌yh03的代谢物也属于本发明的保护范围。
44.本发明的又一具体实施方式中，提供上述贝莱斯芽孢杆菌yh03的培养方法，所述培养方法包括将所述贝莱斯芽孢杆菌yh03接种至发酵培养基进行发酵培养。
45.其中，所述发酵培养基可以是lb液体培养基，所述lb液体培养基具体组成为：胰蛋白胨3g、酵母提取物1.5g、nacl 3g、蒸馏水补足至300ml，ph值7.0。
46.本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述贝莱斯芽孢杆菌yh03或其发酵物或其代谢产物。
47.本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
48.本发明中，术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养贝莱斯芽孢杆菌yh03细菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌
体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的贝莱斯芽孢杆菌yh03产生的代谢物。
49.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有贝莱斯芽孢杆菌yh03的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。
50.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有贝莱斯芽孢杆菌yh03的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。
51.以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述贝莱斯芽孢杆菌yh03或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行。在本发明的一个具体实施方式中，所述冷冻干燥具体方法为：将发酵培养液加入可溶性淀粉，置于-80℃冷冻过夜，然后将其置于冷冻干燥机上冻干干燥；冷井温度-56℃，压力0.1mbar，主干燥24-48h，终末干燥3h，真空压力0.001mbar。
52.其中，所述可溶性淀粉加入量控制为5-15％(w/v)，优选为10％。
53.本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除含活性成分外，还含有载体。所述载体可为微生物制剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。
54.所述载体可为固体载体或液体载体；
55.所述固体载体可为矿物材料、植物材料和/或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、麦饭石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉、稻壳粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；
56.所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。
57.所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂；优选为粉剂。
58.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
59.本发明的又一具体实施方式中，上述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或微生物菌剂在如下1)-3)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
60.1)在抑制病原菌和/或在制备病原菌抑制剂中的应用；
61.2)在抑制病害和/或制备病害抑制剂中的应用；
62.3)在固态发酵和/或制备固态发酵剂中的应用。
63.上文所述应用1)中，所述病原菌包括禾谷镰刀菌，其可产生真菌毒素即脱氧雪腐
镰刀菌烯醇(即呕吐毒素，don)；
64.上文所述应用2)中，所述病害可以为禾谷镰刀菌引发的植物病害，所述植物病害可以为小麦赤霉病；
65.上文所述应用3)中，所述固态发酵可以为麦麸固态发酵；经试验证明，采用本发明的贝莱斯芽孢杆菌yh03对麦麸进行固态发酵处理，可以改性麦麸，增加麦麸中可溶性膳食纤维戊聚糖含量、总多酚含量，发酵后的麦麸具有更强的抗氧化活性，对人体或动物有利；同时有效降低麦麸中的呕吐毒素(don)。
66.因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种麦麸固态发酵方法，所述方法包括：向麦麸中加入上述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或微生物菌剂。
67.具体的，所述方法包括：按照麦麸质量0.1～10％(优选1％)的比例加入上述贝莱斯芽孢杆菌yh03和/或微生物菌剂，然后按照物料比1～5:1(优选为2:1)加入水，搅拌混合均匀，密封后进行发酵处理；发酵温度控制为25～35℃(优选为37℃)，无需调节ph，固态发酵时间控制为8h及以上，优选为8-168h，如8h、24h、48h、72h、96h和168h。
68.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
69.实施例
70.1、材料与方法
71.1.1材料和仪器
72.1.1.1材料
73.表1主要试剂
74.[0075][0076]
1.1.2仪器
[0077]
表2试验仪器与设备
[0078]
[0079][0080]
1.2实验方法
[0081]
1.2.1芽孢杆菌筛选及培养纯化
[0082]
培养基
[0083]
无机盐培养基：1l蒸馏水中加入0.25g kh2po4；0.25g mgso4·
7h2o；0.5gkno3；0.5g(nh4)2so4；0.05gcacl2；0.003gfecl3·
h2o，15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷却到50-60℃后加入过滤除菌的don，使其终浓度为10μl/m l。混匀后倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
[0084]
lb培养基：1l蒸馏水中加入10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10g氯化钠，15g琼脂，自然ph值。121℃高压蒸汽灭菌15min，待温度降到50℃左右倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
[0085]
pda培养基：马铃薯浸出粉6g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l。121℃高压蒸汽灭菌15min，待温度降到50℃左右倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
[0086]
2020年3月份从土壤、树叶、淡水、玉米浆等多种环境中采集样品装如自封袋中，注明采集时间地点。称量样品10g加入90ml灭菌蒸馏水中，置于摇床中，37℃，150rpm摇30min。静置15min后取上清液逐级稀释10-3
、10-4
、10-5
、10-6
。吸取100ul稀释液均匀涂布于以don浓度为10ug/ml的无机盐培养基中，25-30℃的室温下培养1周左右。长出菌落后，挑取少量菌落到新的含10ug/ml的无机盐培养基划线培养，分离出单菌落。
[0087]
1.2.2对禾谷镰刀菌的拮抗作用
[0088]
平板对峙实验
[0089]
禾谷镰刀菌复苏：将保存在4℃的禾谷镰刀菌接种到pda培养基上，25-30℃下培养3-5天，菌落直径5-7cm。利用无菌打孔器(直径6mm)在菌落靠近边缘的位置打孔，将菌饼接种新的pda培养基上。
[0090]
细菌培养液：将筛选出的具有降解don的微生物进行液体培养。刮取一接种环单菌落，加入到已灭菌的lb液体培养基中。摇床150rpm培养18-24h，将5ul菌液点到距菌饼2cm的pda培养基上，25-30℃下培养一周。
[0091]
发酵上清液的抑菌效果
[0092]
将细菌培养液4000rpm离心5min，上清液过0.22um滤膜(过滤除菌)。分别将200ul无菌上清液和400ul无菌上清液均匀涂布到lb液体培养基上，待平板上液体干燥后，将禾谷镰刀菌菌饼接种到涂有无菌上清液的lb培养基上。25-30℃下培养一周。
[0093]
1.2.3菌株鉴定
[0094]
形态鉴定
[0095]
筛选出具有降解呕吐毒素同时能够抑制禾谷镰刀菌的菌株yh03划线接种到lb培养上，室温下培养2-3天。观察菌落形态，通过革兰氏染色制备玻片，在显微镜下观察显微形态。
[0096]
生理特征鉴定
[0097]
分子生物学鉴定：
[0098]
采用细菌基因组dan试剂盒提取菌落基因组dna，利用gyrb片段的引物进行扩增，扩增结果经1％琼脂糖凝胶电泳检测后往测序公司测序。gyrb片段引物序列：
[0099]
up-1：5
’‑
gaagtcatcatgaccgttctgca-3’(seq id no.2)；up-2sr：5
’‑
agcagggtacggatgtgcg agcc-3’(seq id no.3)。
[0100]
1.2.4菌粉的制备
[0101]
菌种活化：将4℃斜面保藏的yh03划线到固体lb培养基上，25-37℃培养12-24h。
[0102]
种子培养：挑取活化的菌落，接种到lb培养基中。37℃,150rpm培养24h。
[0103]
发酵培养液：将种子液按照10％接种到发酵瓶或发酵罐中继续发酵培养24-48h。
[0104]
冻干干燥：将发酵培养液加入10％可溶性淀粉，置于-80℃冷冻过夜，然后将其置于冷冻干燥机上冻干干燥。冷井温度-56℃，压力0.1mbar，主干燥24-48h，终末干燥3h，真空压力0.001mbar。
[0105]
菌液经过冷冻干燥成为菌粉后，采用无菌袋包装防止吸潮，置于-20℃长期储存。
[0106]
1.2.5接种芽孢杆菌固态发酵麦麸
[0107]
将麦麸粉碎过80目筛，分别称取100g麦麸于标记好的三角瓶中，加入50ml蒸馏水，按照麦麸质量的1％接种yh03菌粉，不接种菌液为对照，重复3次。发酵温度37℃，湿度60％，在麦麸发酵8h、1d、2d、3d、4d、7d时取样，用于每一项指标的分析检测。
[0108]
1.2.6呕吐毒素检测
[0109]
酶联免疫法(elisa)简单，灵敏，成本低。实验采用酶联免疫法测定呕吐毒素，考察芽孢杆菌降解呕吐毒素能力。
[0110]
取粉碎恒重的麦麸样品5.0g，放入100ml具塞锥形瓶中，补入25ml无菌水与其混合；在智能恒温培养振荡器上摇匀10分钟，(150/min)；取振摇结束后的液体在离心管中，4000r/min离心5min，取上清液1ml，再加入4ml无菌水；摇匀，取50μl进行检测。
[0111]
将所需试剂从-4℃的冰箱中取出，置于20～25℃回温30min以上，每个试剂在使用前摇匀。标准品和样品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品50μl/孔，然后按序样本50μl/孔，依次加入呕吐毒素酶标物50μl/孔，随后加入呕吐毒素抗试剂50μl/孔，缓缓振荡摇匀，用遮光物覆盖后置25℃无光环境中反应30min。反应结束后，慢慢移开遮光物，把液体倒出，快速避免污染，用洗涤液250μl/孔，加入摇晃清洗4次，每次间隔10s，在卫生纸上拍干，孔内有气泡需用灭菌的枪头刺破。依次加入试剂a液50μl/孔，底物液b液50μl/孔，缓缓振荡摇晃均匀，用遮光物覆盖后置25℃无光环境反应。结束后快速加入终止液50μl/孔，缓缓振匀，使用酶标仪分别测定450nm和630nm的od值，需要在5min内读完数据。
[0112]
并按照公式(1)进行计算:
[0113]
[0114]
其中，b
‑‑
标准品或样品的吸光度值；b0‑‑
0μg/kg标准品的吸光度值。
[0115]
1.2.7总戊聚糖含量检测
[0116]
标准曲线绘制：将d-木糖配制成100μg/ml标准溶液，在试管中分别加入0.0ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml的d-木糖标准溶液，补加蒸馏水到3ml。
[0117]
先取1％地衣酚无水乙醇溶液0.3ml，然后加入0.1％氯化铁盐酸溶液3ml，用橡皮塞塞住，利用漩涡混合仪振荡摇匀。放入沸水浴30min，取出试管用冷水冲洗降温，倒入10ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容。以0.0ml试剂溶液做空白对照，使用1cm比色皿，测定在670nm、580nm双波长之差。以双波长的差值为纵坐标，d-木糖量为横坐标，获得标准曲线为y＝0.0012x-0.0116，r2＝0.998。
[0118]
样品测定：称取0.10g的麦麸样品放入试管中，加入配制好的2mol/l盐酸溶液20ml，用橡皮塞塞住后，放入沸水水浴2h，结束后用冷水冲洗冷却，用滤纸过滤，收集滤液，然后适当稀释备用。移取3ml样品稀释液到试管中，取1％地衣酚无水乙醇溶液0.3ml，后续测定步骤按照标准曲线绘制方法进行。
[0119][0120]
x—试样中总戊聚糖含量，单位为克每百克(g/100g)
[0121]
c—表示由d-木糖标准曲线得到的d-木糖含量，单位为微克(μg)
[0122]
0.88—单糖与聚糖的转换系数
[0123]
n—稀释倍数
[0124]
m—样品干重，单位为克(g)
[0125]
1.2.8水溶性戊聚糖含量检测
[0126]
称取2.00g样品入三角烧瓶中，加入100ml水，用智能恒温振荡器提取时间为120分钟，温度不超过30℃，然后摇匀后将混合物转移到离心管中。离心力为4000*g，离心时间为15分钟。取10ml离心的上清液，在试管中加入配制好的10ml 4mol/l盐酸溶液，然后在沸水浴中水解2h。冷却后，用滤纸过滤，收集滤液，然后适当稀释备用。移取3ml样品稀释液到试管中，取1％地衣酚无水乙醇溶液0.3ml，后续测定步骤按照1.2.7中标准曲线绘制方法进行。
[0127][0128]
x—试样中可溶性戊聚糖含量，单位为克每百克(g/100g)
[0129]
c—表示由d-木糖标准曲线得到的d-木糖含量，单位为微克(μg)
[0130]
0.88—单糖与聚糖的转换系数
[0131]
n—稀释倍数
[0132]
m—样品干重，单位为克(g)
[0133]
1.2.9总酚含量检测
[0134]
对照品液体的配制：准确称量没食子酸对照品50mg，用蒸馏水溶解并用50ml的容量瓶定容，即为1.0mg/ml质量浓度的标准溶液。
[0135]
标准曲线的绘制：取0.0125ml、0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml到10ml棕色容量瓶
中，分别加入蒸馏水6ml，摇晃均匀，加入folin试剂0.5ml，摇晃均匀。静止1min，再加入75g/l碳酸钠1.5ml，摇晃振荡均匀，最后用蒸馏水定容，配制成浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的标准溶液，75℃水浴10min，波长760nm，测定吸光度，以质量浓度(μg/ml)为横坐标，吸光度a为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线为y＝0.0877x+0.05，r2＝0.999。
[0136]
制备样品原液：称取1.00g样品，按比例1：50加入2mol/l naoh密闭条件下振荡提取1h，调节ph为3.0，离心(9000rpm，15min，4℃)取上清液，用乙酸乙酯提取总多酚，重复3次。提取液在40℃下，旋转蒸发至冷凝水不再滴落，加入蒸馏水定容至50ml。
[0137]
加入1ml液体到10ml棕色容量瓶中，补5ml蒸馏水，振荡摇晃，随后继续加0.5mlfolin试剂，充分摇匀。静止1min，再加入75g/l碳酸钠1.5ml，混匀，用蒸馏水定容，在75℃水浴加热10分钟，选择波长760nm，测定其吸光度。
[0138]
1.2.10麦麸dpph清除率的测定
[0139]
样品溶液稀释：取1.2.9样品原液2ml用蒸馏水定容至10ml。
[0140]
配制0.1mmol/ldpph的95％乙醇溶液1.5ml，取1.5ml的样品溶液与其混合均匀，在室温下避光静止30min，517nm的波长，测定吸光度，其中蒸馏水做空白对照。dpph自由基清除率按照下列公式计算：
[0141]
dpph清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a3]
×
100
[0142]
其中：a1为样品+dpph的吸光度，a2为样品+95％乙醇的吸光度，a3为蒸馏水+dpph的吸光度。
[0143]
1.2.11麦麸蛋白质含量的测定
[0144]
利用全自动凯式定氮仪测量麦麸中的蛋白质含量。
[0145]
称取约0.2g样品于干净的消化管中，加入1片催化片(硫酸钾、硫酸铜)以及12ml浓硫酸，消化管上方盖上小漏斗，放入消化仪进行消化，设置最终温度420℃，保持1h。设置2根空白对照管。
[0146]
将硼酸溶液、氢氧化钠溶液、蒸馏水分别装入对应的大桶里，然后加入显色剂到硼酸桶里，混合均匀。加入0.1mol/l的标准盐酸溶液于内部桶内，打开凯氏定氮仪的冷凝水开关，再开机预热，将空的消化管放置在相应位置，打开设定好的程序，测定空白样品，两次空白差值不超过0.02。然后检测样品蛋白质含量。
[0147]
1.2.12麦麸持水性、持油性检测
[0148]
持水性(wai)：将一定质量的麦麸粉倒入水中，室温下缓慢搅拌30min，然后3000rpm离心15min，将上清液倾出。
[0149]
wai＝去除上清液后沉淀物质量/样品质量
…………………………
(4)
[0150]
称取0.5g的麦麸样品，加入10ml油(超市购)混合后放入预先称重的离心管中静置10min，离心25min(3000rpm)，倒出上清液，倒置10min，称重。
[0151]
持油性(oac)＝(w
2-w1)/w0*100
………………………………
(5)
[0152]
wo‑‑
干燥样品的质量(g)
[0153]
w1‑‑
干燥样品和离心管的总质量(g)
[0154]
w2‑‑
离心后残留物和离心管的总质量(g)
[0155]
2、结果
[0156]
2.1芽孢杆菌的筛选
[0157]
从玉米浆中分离出一株芽孢杆菌，命名为yh03，能够降解呕吐毒素don。玉米浆是玉米浸泡液后浓缩中形成的，营养物质丰富，ph值为4.0，属于酸性环境。
[0158]
2.2对禾谷镰刀菌的拮抗作用
[0159]
采用平板对峙实验，结果如图2所示，出现明显抑菌带；发酵上清液的抑菌效果如图3所示，可明显看到随浓度增加，抑菌效果增加。
[0160]
2.3菌株鉴定
[0161]
形态鉴定结果：菌落在lb培养基上乳白色，初期表面光滑，粘液状不宜挑起，边缘不整齐。后期菌落表面呈膜。
[0162]
生理特征结果：革兰氏阳性(+)，菌体杆状，有芽孢，碱性厌氧。接触酶阳性，柠檬酸试验阳性。
[0163]
经分子生物学鉴定，gyrb片段测序结果如seq id no.1所示。在ncbi数据库中检索，与bacillus velezensis(mt300194.1)的同源性最高，相似度100％。采用mega7.0系统发育树构建gyrb片段系统发育树，如图4所示，yh03与bacillus velezensis(dq903176)聚为一支。结合形态和生理特征鉴定yh03为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株已于2021年1月27日保藏到中国典型培养物中心，保藏编号为cctcc no：m 2021164。
[0164]
gyrb片段测序序列：
[0165]
gtgtaggggcatccgtcgtaaacgccttgtcgaccactcttgacgttacggttcatcgtgacggaaaaatccattatcaggcgtacgagcgcggtgtacctgtggccgatcttgaagtgatcggcgaaactgataagaccggaacgattacgcacttcgttccggacccggaaattttcaaagaaacaactgtatatgactatgatctgctttcaaaccgtgtccgggaattggccttcctgacaaaaggcgtaaacatcacgattgaagacaaacgtgaaggacaagaacggaaaaacgagtaccactacgaaggcggaatcaaaagctatgttgagtacttaaaccgttccaaagaagtcgttcatgaagagccgatttatatcgaaggcgagaaagacggcataacggttgaagttgcattgcaatacaacgacagctatacaagcaatatttattctttcacaaataatatcaacacatacgaaggcggcacgcacgaggccggatttaaaaccggtctgacccgtgtcataaacgactatgcaagaagaaaagggattttcaaagaaaatgatccgaatttaagcggggatgatgtgagagaagggctgactgccattatttcaattaagcaccctgatccgcaattcgaagggcagacgaaaaccaagctcggcaactccgaagcgagaacgatcactgatacgctgttttcttctgcgctggaaacattccttcttgaaaatccggactcagcccgcaaaatcgttgaaaaaggtttaatggccgcaagagcgcggatggcggcgaaaaaagcccgggaattgacccggcgcaaaagtgcgcttgagatttccaatctgccgggcaaactggcggactgttcttctaaagatccgagcatttccgagctgtatatcgtagagggtgactctgcgggcggatcagcgaaacagggacgggaccgtcatttccaagccattctgccgctgcgcggtaagattctgaacgttgagaaagccagacttgataagattctctcaaacaatgaggtcagatcaatgatcacggccctcggaacaggaatcggagaagatttt(seq id no.1)
[0166]
2.4菌粉制备
[0167]
菌液经过冷冻干燥成为菌粉后，采用无菌袋包装防止吸潮，置于-20℃长期储存。菌粉如图5所示。
[0168]
2.5芽孢杆菌发酵对麦麸呕吐毒素含量影响
[0169]
由图6可知，芽孢杆菌发酵对麦麸的呕吐毒素显著降低，在8～168h呕吐毒素与未发酵麦麸呕吐毒素有显著性差异(p《0.05)，8h与原样相比降低了8.5倍，24～72h无显著差异，在96h后呕吐毒素有略微上升，可能是有机物被大量消耗引起，使单位质量的麦麸呕吐
毒素占比更大，但仍然低于麦麸发酵前的呕吐毒素。
[0170]
2.6芽孢杆菌发酵对麦麸可溶性戊聚糖和总戊聚糖含量的影响
[0171]
戊聚糖是一种非淀粉多糖，被划分为可溶性聚戊糖和不溶性戊聚糖，可溶性和不可溶性戊聚糖构成了总戊聚糖。戊聚糖广泛存在于小麦中，但含量很少，是糊粉层细胞外薄壁的主要组成成分。由图7可知，8～168h可溶性戊聚糖和总戊聚糖与未发酵的麦麸相比，有显著性差异，发酵时间在24～96h总戊聚糖和可溶性无聚糖含量无显著差异(p《0.05)，麦麸经芽孢杆菌固态发酵后，总戊聚糖在168h达到最高值35.76g/100g，可溶性戊聚糖在48h达到最大数6.53g/100g，可溶性戊聚糖和总戊聚糖含量显著增加，说明芽孢杆菌发酵可以促进不可溶性戊聚糖向可溶性戊聚糖转化，这可能是由于麦麸中的内源木聚糖酶与芽孢杆菌的代谢产物之间的相互作用。
[0172]
2.7芽孢杆菌发酵对麦麸总酚含量的影响
[0173]
由图8可知，麦麸经芽孢杆菌固态发酵后，8h与未发酵麦麸无显著性差异，发酵时间太短，结合态多酚未充分释放，发酵24h后总酚含量显著增加，发酵时间在24h、48h、168h的总酚含量无显著性差异(p《0.05)，麦麸中添加芽孢杆菌后，总酚含量先增加，在发酵72小时时达到最大值3.618mg/g，是原料的2.34倍，之后含量下降，但在168小时发酵过程中，麦麸中的总酚含量均高于未发酵的总酚含量，这可能是芽孢杆菌发酵麦麸产生的酶系破坏了结合态多酚的结构。96h后总酚含量下降，可能是芽孢杆菌在释放了这些物质的同时又进行了部分消耗。
[0174]
2.8芽孢杆菌发酵对麦麸抗氧化性的影响
[0175]
根据图9显示，发酵8h的麦麸与未发酵的麦麸无显著性差异，发酵时间太短，抗氧化成分释放量很小，发酵24h后dpph自由基清除率明显上升(p《0.05)，dpph自由基清除能力的变化趋势和总酚含量的改变情况相近，dpph自由基清除率先升高后降低，在芽孢杆菌发酵到72h达到最大59.5％，比发酵前增加了1.7倍。可以得出抗氧化性和总酚含量密切相关。
[0176]
2.9芽孢杆菌发酵对麦麸蛋白质的影响
[0177]
由图10可知，与未发酵麦麸相比，固态发酵麦麸粗蛋白先降低后上升，但升高的幅度很小。发酵8h麦麸蛋白质含量最低，与未发酵麦麸有显著差异(p《0.05)，其原因可能是芽孢杆菌产生蛋白酶水解了麦麸中的蛋白质，所以8h略微下降，接入麦麸的芽孢杆菌自身携带蛋白质，随着发酵时间的延长，芽孢杆菌数量增加，蛋白质含量也增加，麦麸在高温烘干情况下，麦麸中的芽孢杆菌死亡分解，自身的蛋白质提高了麦麸中蛋白质的含量，所以麦麸中蛋白质含量先降低，后上升。
[0178]
2.10芽孢杆菌发酵对麦麸持水性和持油性的影响
[0179]
本实验测定了芽孢杆菌发酵麦麸对其吸水指数(wai)的影响，如图11所示。芽孢杆菌发酵麦麸wai随发酵时间延长呈上升趋势，对比未发酵、发酵72h和168h，发酵72h、168h麦麸与未发酵麦麸有显著差异(p《0.05)，发酵7天wai最高，较未发酵麦麸提高了11.11％。原因可能是发酵过程中麦麸纤维发生降解，使纤维结构变得疏松，增加了其比表面积，吸水性指数上升。同时发酵时麦麸中的蛋白质发生了水解反应，蛋白质的空间结构遭到破坏，从而削弱了分子之间的疏水相互作用
[24]
。另外，发酵过程中可溶物增加，不可溶的膳食纤维向可溶性膳食纤维转变，这些原因都能导致麦麸的水溶性指数上升。
[0180]
由图12可知，经过芽孢杆菌发酵的麦麸，其持油性在发酵72h有所略微上升，与未
发酵麦麸无显著差异(p《0.05)，在发酵达到168h后，麦麸持油性显著下降(p《0.05)，原因可能是麦麸粒径为80目时，麦麸的持油性相对较高。其次是发酵之后的麦麸纤维结构被不同程度的破坏，麦麸的网孔状结构遭到一定的损坏，使得发酵后的麦麸对油脂的保持力下降。再次经发酵后的麦麸，部分膳食纤维被降解，导致亲水性的物质更容易溢出，进而对油脂的吸附能力下降。
[0181]
综上，本发明采用贝莱斯芽孢杆菌固态发酵麦麸，分析芽孢杆菌固态发酵前后麦麸的毒素脱除情况、总戊聚糖、水溶性戊聚糖含量变化、蛋白质、总酚、抗氧化性和持油性、持水性变化。主要研究结果如下：
[0182]
经发酵后的麦麸与未发酵的麦麸相比，发酵后的麦麸总酚、抗氧化性、可溶性戊聚糖和总戊聚糖都显著增加。总酚的变化趋势是先增加后减少，在发酵72h时达到最大值3.62mg/g，为原料的2.34倍。抗氧化性变化趋势与总酚相同，在72h自由基清除率到达最大59.5％，为原料的1.7倍。可溶性戊聚糖和总戊聚糖变化趋势相近，可溶性戊聚糖在发酵48h到达最大值6.53g/100g，而总戊聚糖在168h达到最大值35.76g/100g。蛋白质含量在发酵后有略微增加，可能是菌体自身蛋白质，所以本发明认为发酵后的麦麸蛋白质几乎不变。发酵后的麦麸持水性呈上升趋势，持油性则相反，有所下降。芽孢杆菌的脱毒能力较好，整个发酵过程呕吐毒素的含量都很低，在第8h的时候呕吐毒素降到最低，其值为2.85μk/kg，相比与未发酵的麦麸降低了8.5倍。
[0183]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。